JP2021028297A - マイクロｒｎａ及びその誘導体を有効成分とするがん治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 がんとＢＲＤ４の関係に着目して、これを出発点とする新たな概念に基づくがん治療の手段を見出すこと。【解決手段】ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）に基礎をおく二本鎖ＲＮＡ、及び／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）に基礎を置く二本鎖ＲＮＡ、を有効成分とするがん治療剤を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。このがん治療剤は、難治性のがんや薬剤耐性のがんを含めた幅広いがん種が治療対象となる。【選択図】 なし

Description

本発明は抗がん剤に関する発明であり、具体的には、特定のマイクロＲＮＡとその誘導体を有効成分とする抗がん剤に関する発明である。

がんは日本人の死因のトップであり、２０１２年の国立がんセンターの統計によると生涯においてがんに罹患する確率は日本人男性６３％、女性４７％と高い。また２０１５年の厚生労働省の統計によると、死亡原因にしめる癌の割合は、日本人男性３２％、女性２４％、全人口の約３分の１ががんで亡くなっている。がんによる死亡は増加し続け、２０３０年には世界で年間１１４０万人ががんで死亡すると予測されている。

２００３年に終了したヒトゲノム計画により、がんを遺伝子レベル、タンパク質分子レベルで理解し、それをがんの診断、治療に応用しようとする動きは加速され、その結果、がんをめぐる診断および治療の進歩は目覚ましい。特に、治療面においては従来の抗がん剤とは異なる機序として、がん細胞において活性化している遺伝子やタンパク質を標的としたいわゆる分子標的治療薬の進歩、開発も進んでいる。診断時にがんで活性化している分子を同定することでこのような分子標的治療薬が臨床応用されている。

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がんをめぐる上記の状況のもと、本発明者らは、まずはがんとＢＲＤ４の関係に着目して、これを出発点とする新たな概念に基づくがん治療の手段を見出すことを課題とした。

ＢＲＤ４は構造上、アセチル化修飾されたリジンに結合するブロモドメインを２つもち、Ｃ末端側にはｐ−ＴＥＦｂ（positive elongation factor b）と結合する領域を有しているタンパク質である（非特許文献１）。ヒストンのアセチル化修飾は転写活性と正の相関を認め、ｐ−ＴＥＦｂは転写を行うＲＮＡポリメラーゼIIを抑制するタンパク質を不活性化することで転写を活性化する。ＢＲＤ４はアセチル化修飾されたヒストンのリジンに結合することで、そこにｐ−ＴＥＦｂを動員し、転写を促進する働きがある。血液腫瘍、膵がん、乳がんなどいくつかのがん種において、ＢＲＤ４発現の異常な活性化ががん細胞の増殖に寄与し、ＢＲＤ４の発現を抑制することが、がん治療において有効である可能性が報告されている（非特許文献２、３、４、５、６、７）。そこで、現在、ＢＲＤ４を阻害するＢＥＴ阻害剤が開発されつつある。多くのＢＥＴ阻害剤は、ＢＲＤ４のブロモドメインが、アセチル化リジンと結合する領域の阻害作用を持つ（非特許文献８）。

本発明者らはこのＢＲＤ４に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の役割に着目した。ｍｉＲＮＡは標的転写産物（ｍＲＮＡ）のコーディング（ＣＤＳ）領域あるいは３'−非翻訳領域（３'ＵＴＲ）への結合を通じて、その翻訳あるいは安定化を妨害することにより、遺伝子発現を調整する、内因性の小分子の非コーディングＲＮＡである（非特許文献９、１０）。いくつかのｍｉＲＮＡは腫瘍遺伝子を抑制的に調節することが可能であり、腫瘍抑制型のｍｉＲＮＡの不活性化は発がん経路の活性化につながる（非特許文献１１）。重要なこととして、一つのｍＲＮＡは複数のｍｉＲＮＡによって標的にされる一方、一つのｍｉＲＮＡは複数のｍＲＮＡを標的にすることができる（非特許文献１２）。すなわち、腫瘍遺伝子を標的にする複数のｍｉＲＮＡの発現低下は、発がん経路の活性化をもたらすが、複数の発がん経路に寄与する複数の遺伝子を標的にすることができるｍｉＲＮＡの投与は、がん治療において効果的であると考えられる。

その結果、二本鎖のｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０と二本鎖のｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐが、がん抑制効果を有し、特に、「ＢＲＤ４遺伝子の過剰発現が認められるがん」とＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子の発現が認められるがんに対する優れた抑制効果が認められることを見出すと共に、少なくとも二本鎖のｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０は、ＢＲＤ４遺伝子に関連する、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、又は、ＥＧＦＲ遺伝子の過剰発現が認められるがんに対しても優れた抑制効果が認められることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、下記（１）の二本鎖ＲＮＡ（以下、本発明の第一の二本鎖ＲＮＡ又は第一の二本鎖ＲＮＡともいう）、及び／又は、下記（２）の二本鎖ＲＮＡ（以下、本発明の第二の二本鎖ＲＮＡ又は第二の二本鎖ＲＮＡともいう）、を有効成分とするがん治療剤（以下、本発明のがん治療剤ともいう）を提供する。

（１）本発明の第一の二本鎖ＲＮＡは、塩基配列「ＡＧＣＵＵＵＵＧＧＧＡＡＵＵＣＡＧＧＵＡｋ₁ｋ₂」（配列式１）［式中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、及び、Ｕはウラシルを表し、ｋ₁とｋ₂は同一又は異なって、Ｇ、Ｔ又はＵである：配列番号１］の一本鎖ＲＮＡ、並びに、塩基配列「ＵＡＣＣＵＧＡＡＵＵｈＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵ」（配列式２）［式中、ｈは、Ａ、Ｕ又はＣである：配列番号２］の一本鎖ＲＮＡからなる、略相補的な二本鎖ＲＮＡ、である。

本発明の第一の二本鎖ＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）を基礎とするものである。当該ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０（天然型）のガイド鎖は、配列式１の塩基配列「ｋ₁ｋ₂」が「ＧＵ」である塩基配列の一本鎖ＲＮＡであり、パッセンジャー鎖は、配列式２の塩基「ｈ」が「Ａ」である塩基配列の一本鎖ＲＮＡである。これらの一本鎖ＲＮＡが相互に略相補的に結合して下記式の二本鎖ＲＮＡを構成している。下記式において、塩基間の太線は塩基間の水素結合を示し、当該部分の塩基対が相補的であることを示している。「略相補的」とは、下記式のように、二本鎖ＲＮＡの一部が一本鎖である部分、及び／又は、塩基対の一部が水素結合で結合していない部分（ミスマッチ）、を含みつつ、全体としては二本鎖ＲＮＡを構成している状態であり、二本鎖ＲＮＡの対となっている一本鎖ＲＮＡの構成塩基同士の全てが水素結合した「完全に相補的」な場合を含んでいる。

配列式１の好適な他の態様として、下記の４態様の式が挙げられる。

（２）本発明の第二の二本鎖ＲＮＡは、塩基配列「ＡＧＧＡＧＧＡＡＵＵＧＧＵＧＣＵＧＧＵＣＵＵ」（配列式３：配列番号３）の一本鎖ＲＮＡ、並びに、塩基配列「ＡＣＵＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣ」（配列式４：配列番号４）の一本鎖ＲＮＡからなる、略相補的な二本鎖ＲＮＡである。配列式３は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、配列式４は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−３ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）の塩基配列であり、下記の略相補的構造を有している。天然型の成熟ｍｉＲＮＡでは、配列式３がガイド鎖として、配列式４がパッセンジャー鎖として位置付けられている。

本発明の第一・第二の二本鎖ＲＮＡには、無修飾のものの他、ヌクレアーゼ耐性を付与する等の目的の修飾が施されたものも含まれる。当該修飾としては、リン酸部の修飾、糖部の修飾が挙げられる。リン酸部の修飾としては、リン酸部の酸素原子を硫黄原子に置換した「ホスホロチオエート修飾」（Ｓ化）等が知られている。糖部の修飾としては、２'位のフッ素（Ｆ）化、Ｏ−メチル化、ＭＯＥ化等の２'位の修飾；ＬＮＡ（２'，４'−ＢＮＡ）化、ＥＮＡ化、モルフォリノ核酸化等の架橋型修飾が挙げられる。

本発明の第一・第二の二本鎖ＲＮＡは、公知ＲＮＡの合成法等を用いて合成することが可能である。ＲＮＡの合成法は、ホスホロアミダイド法やその改良法、Ｈ−ホスホネート法とその改良法、酵素合成法（in vitro転写法）等があげられる。また、市販品の当該核酸や、委託製造された当該核酸を本発明に適応することも可能である。

本発明のがん治療剤の対象となるがんは、特に限定されないが、少なくともＢＲＤ４遺伝子発現が過剰に発現しているがんであり、ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子が発現しているがんは好適な治療対象となる。ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子は、主に上部消化管気道に発生する難治性のがんである「ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」における、１５番染色体と１９番染色体の転座により認められる融合遺伝子である。

さらに、本発明のがん治療剤の有効成分が「本発明の第一の二本鎖ＲＮＡ」を含む場合には、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、又は、ＥＧＦＲ遺伝子の過剰発現しているがんが好適な治療対象となる。

ＣＤＫ２遺伝子とＣＤＫ６遺伝子について、ＣＤＫは「サイクリン依存性キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ）」の略称であり、ＣＤＫ２は、ＣｙｃｌｉｎＥと、ＣＤＫ２−ＣｙｃｌｉｎＥ複合体を形成し、細胞周期をＧ１期からＳ期へ移行させる。当該複合体にＣＤＫインヒビターであるｐ２１が結合すると、細胞周期はＳ期に移行しなくなる（Ｇ１／Ｓ期チェックポイント）。これはＤＮＡに傷害を受けた細胞のがん化を妨げる、重要な機能であることが知られており（非特許文献１３）、がん細胞におけるＣＤＫ２遺伝子の過剰発現は、がんの促進作用として捉えられる。ＣＤＫ６遺伝子も、細胞周期をＧ１期からＳ期への以降を制御する役割を持つ遺伝子であり、がん細胞におけるＣＤＫ６遺伝子の過剰発現はがんにおける増殖促進作用として捉えられ、ＣＤＫ６を標的とする低分子化合物が開発され、さまざまながんにおいて臨床試験がおこなわれている。当該ＣＤＫ２遺伝子又はＣＤＫ６遺伝子が過剰発現しているがんは、「本発明の第一の二本鎖ＲＮＡ」を含む態様の本発明のがん治療剤の好適な治療対象である。

ＢＲＤ３は、上述したＢＲＤ４と同じく、ヒストンのアセチル化リジンを認識し，制御タンパク質を集めてクロマチン構造や遺伝子発現を制御する機能を有するタンパク質ドメインである「ブロモドメイン」の一つである。ブロモドメイン繰り返し配列及び特異的末端配列を持つＢＥＴ（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）ファミリータンパク質の一つとして知られており、これをコードする遺伝子は、抗がん剤であるＢＥＴ阻害薬の標的の一つとなっている。ＢＲＤ３が過剰発現しているがんは、「本発明の第一の二本鎖ＲＮＡ」を含む態様の本発明のがん治療剤の好適な治療対象である。

ＥＧＦＲは、「上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、細胞の増殖や成長を制御する上皮成長因子（ＥＧＦ）を認識し、シグナル伝達を行う受容体であり、多くのがんにおいてＥＦＧＲ遺伝子の過剰発現が認められ（非特許文献１４）、がんのＥＧＦＲ遺伝子の過剰発現は予後不良因子である（非特許文献１５、１６）。特に、肺がんはＥＧＦＲによって強く促進されることが知られており、「本発明の第一の二本鎖ＲＮＡ」を含む態様の本発明のがん治療剤の好適な治療対象となる。当該態様の本発明のがん治療剤は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する抵抗性を獲得した肺がんに対しても有効である。

さらに「がんとの共存」を目指す場合も本発明のがん治療剤の適応対象となりうる。すなわち、がんにおけるＢＲＤ４遺伝子の発現をはじめ、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子の発現を抑制することにより、がんの悪性化を防ぎ、天寿を全うすることを目指す場合にも本発明のがん治療剤は適していると考えられる。

上記の遺伝子発現の定量は、常法に従って行うことが可能であり、例えば、ＢＲＤ４遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子の発現の定量は、ノーザンブロッティング法、ウェスタンブロティング法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ法）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法を含む）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法、発現アレイ解析法、免疫組織化学染色法等、又は、これらの方法の変法が挙げられる。また、ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの診断は、フランキングＮＵＴプローブを用いるｓｐｌｉｔ−ａｐａｒｔ ＦＩＳＨ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウェスタンブロティング法、免疫組織化学染色法等に基づく診断が一般的である。

遺伝子の正常な発現量を基にして適切なカットオフ値が包括的に又はがん個別的に設定された、これらの遺伝子発現の定量法を、治療対象のがんに対して適用して、当該がんにおける所定の遺伝子の発現定量値に対して、前記カットオフ値を当て嵌めることで、所定の遺伝子の過剰発現の有無を特定することができる。このような所定の遺伝子の過剰発現が認められるがんを、本発明のがん治療剤の適切な適用対象として特定することができる。

上述した遺伝子的特徴のがんが、本発明のがん治療剤の好適な治療対象であるが、外形的には、上記のＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの他、膵がん、肝がん、食道がん、肺がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、皮膚がん、腎がん、血液腫瘍等が例示される。無論、これらのがんの外形に治療対象が限定されるものではなく、好適には、上記の遺伝子的特徴に基づいた治療対象がんの選択が行われることが好適である。また、有効成分である核酸が確実にがんに到達可能であることから、局所投与、すなわち、本発明のがん治療剤を直接がんに接触させることが可能ながんが、治療対象として好適である。

本発明により、幅広いがん種、薬剤耐性がん、難治性がんに対して治療効果を有するがん治療剤が提供される。特に、本発明のがん治療剤は、ＢＲＤ４遺伝子の過剰発現が認められるがん、さらに、ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子の発現が認められる難治性のがんである「ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」に対する治療効果が認められる。さらに、本発明のがん治療剤の実施態様の一つである「ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）を基礎とする二本鎖ＲＮＡ」を有効成分として含むがん治療剤は、上記に加えて、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、又は、ＥＧＦＲ遺伝子の過剰発現しているがんに対しても治療効果が認められる。

細胞増殖を抑制するマイクロＲＮＡのスクリーニングの手順を示す図面である。 膵がん細胞株Ｐａｎｃ１における、図１−１におけるスクリーニングの結果を示す図面である。 図１−２のスクリーニングの結果をベン図で示した図面である。 ２種類の膵がん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した場合における当該がん細胞株の状態を示した顕微鏡写真である。 種々のがん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した場合における細胞増殖曲線を示した図面である。 図１−５に引き続き、種々のがん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した場合における細胞増殖曲線を示した図面である。 有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）をがん細胞株に導入した後に行った発現アレイ解析の結果と、予測される当該有効成分が３'ＵＴＲ領域に作用する標的遺伝子候補の数を、それぞれベン図で示した図面である。 有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した２種類の膵がん細胞株における、ＣＤＫ２遺伝子とＣＤＫ６遺伝子の発現抑制について検討したウエスタンブロットの結果を示す図面である。 ＣＤＫ２遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の３'ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 ２種類の膵がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＣＤＫ２遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 膵がん細胞株と、ＥＧＦＲがドライバーとなってがんの増殖を促進する肺がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＥＧＦＲ遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 ＥＧＦＲがドライバーとなってがんの増殖を促進する肺がん細胞株に対して、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）をがん細胞株に導入した後に行った発現アレイ解析の結果から予測される当該有効成分がコーディング領域に作用する標的遺伝子候補の数を、それぞれベン図で示した図面である。 ２種類の膵がん細胞株に対して有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した場合の、ＢＲＤ２遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＢＲＤ４遺伝子等の発現に対する影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図面である。 膵がん細胞株に対してｓｉＲＮＡを用いて、ＢＲＤ２遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＢＲＤ４遺伝子をノックダウンした場合の細胞増殖に対する影響を示す図面である。 膵がん細胞にＢＲＤ４遺伝子発現ベクターを導入し、ＢＲＤ４を過剰発現させたときの細胞増殖に対する影響を示す図面である。 ＢＲＤ４遺伝子のコーディング領域のうち、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）のガイド配列と相同する領域の塩基配列、作成した変異の配列、及び、当該有効成分の導入によるルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 ＢＲＤ３遺伝子のコーディング領域のうち、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）のガイド配列と相同する領域の塩基配列、作成した変異の配列、及び、当該有効成分の導入によるルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 ＢＲＤ３遺伝子の３'ＵＴＲ領域のうち、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）のガイド配列と相同する領域の塩基配列、及び、当該有効成分の導入によるルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す図面である。 膵がん細胞におけるＢＲＤ４の発現に対する、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）導入の影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図面である。 膵がん細胞におけるＢＲＤ３の発現に対する、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）導入の影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図面である。 ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子のｍＲＮＡと、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）のガイド配列の関係を示している。 ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの細胞株に、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した結果を、細胞増殖とウエスタンブロットで示した図面である。 ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの細胞株に対するＢＥＴ阻害剤の効果を、細胞増殖とウエスタンブロットで示した図面である。 ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの細胞株と、そのＢＥＴ阻害剤耐性株の用量反応曲線とＩＣ５０を示した図面である。 ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａのＢＥＴ阻害剤耐性細胞株に、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）を導入した結果を、細胞増殖とウエスタンブロットで示した図面である。 マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験における、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）の投与スケジュールを示した図面である。 膵がん細胞株の皮下注射から２３日後のマウスの皮下腫瘍の外観を示した写真図面である。 図５−２のマウスから摘出された腫瘍の写真図面である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験における、有効成分の一つである第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（天然型）の投与の効果を、摘出された腫瘍の体積により検討した結果を示す図面である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍における、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０の発現解析を行った結果を示す図面である。 上記ｉｎ ｖｉｖｏ試験において摘出された腫瘍における、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０の発現増加に伴う、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子の発現の低下を、摘出腫瘍の免疫染色により示した写真図面である。 有効成分である４種類の第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（塩基配列改変型を含む）導入による腫瘍抑制効果を検討した結果を示す図面である。 有効成分である第一の二本鎖ｍｉＲＮＡによる腫瘍増殖抑制の機序のまとめを示した図面である。 有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ）のがん抑制効果をウエスタンブロットにより検討した結果を示す図面である。 ＢＲＤ４遺伝子と有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ）の相同領域を、コーディング領域と３'ＵＴＲ領域において示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第１と第２のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第３のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第４のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の第５のコーディング領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。 ＢＲＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域における、有効成分である第二の二本鎖ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ）との相同領域について行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図面である。

本発明のがん治療剤の形態は、その有効成分である、本発明の第一・第二の二本鎖ＲＮＡそのもの、であってもよいが、これらの有効成分としての核酸を含有する医薬組成物としての形態を取るのが通常である。これらの有効成分をがん治療剤としての直接投与する場合も、用時に注射剤等の液剤として混合使用するのが現実であるので、この態様も実質には医薬組成物の使用に含められる。

上記の有効成分としての核酸の人体に対する投与量は、一日成人１人あたり、０．０１μｇ−１００ｍｇ程度である。この投与は１日１回、ないし、２−５回、さらに連日ないし数日おきに行うことも可能である。

上記医薬組成物は、上記の有効成分としての核酸とともに適切な医薬製剤担体を配合して、製剤組成物の形態に調整される。当該製剤担体としては、使用形態に応じた担体を選択することが可能であり、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等の賦形剤ないし希釈剤を使用することができる。組成剤の形態は上記の有効成分としての核酸を効果的に含有可能な形態であれば、特に限定されるものではなく、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤、軟膏剤、ハップ剤であってもよい。また、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのも好適である。現状においては本発明のがん治療剤は、局所への投与が効果的であり、この投与形式に適した剤型は、通常は注射剤、軟膏剤、又は、ハップ剤の形態である。注射剤を用いる局所への投与は、腫瘍に対して、皮下、皮内、筋肉内注射等の体外からの注射により、直接有効成分を注入し、さらに、内視鏡を用いて体内（消化管内、子宮内、膀胱内等）の腫瘍に対して、直接有効成分を注入する、等の態様で行われる。軟膏剤又はハップ剤を用いる局所への投与は、皮膚がんに対して直接有効成分を浸潤させる、等の態様で行われる。

また、上記の有効成分としての核酸に対して適切な担体を添加することで使用時に液状となしうる乾燥剤とすることも可能である。さらに、高分子ミセル、シクロデキストリン含有ポリマーで構成されたナノ粒子、安定核酸脂質粒子、多機能エンベローブ型ナノ構造体等のドラッグデリバリーシステムを活用して、本発明のがん治療剤の効果をより向上させることが可能である。

医薬品組成物としての本発明のがん治療剤は、その形態に応じた適切な投与経路により、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、皮膚上、消化管内、子宮内、膀胱内、血管内、腹腔内等への投与形態で、投与される。医薬品組成物中の上記の有効成分としての核酸の含有量は当該組成物の投与方法、投与形態、使用目的、患者の症状等に応じて適宜選択され、一定ではないが、通常、有効成分の核酸を０．１−９５質量％程度含有する組成物形態に調整して、上述した有効成分の投与量と投与頻度で投与を行うことが望ましい。

以下、本発明の実施例を開示する。

１．材料と方法
実施例の結果の開示に先立ち、それに用いられた材料と試験方法について説明する。

（１）マイクロＲＮＡ（本発明のがん治療剤の有効成分の有用性の検証用途）
（ａ）本発明の第一の二本鎖ＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ））の天然型と塩基改変誘導体
（ａ）−１：天然型二本鎖ＲＮＡ
「ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）」として、当該マイクロＲＮＡの合成を、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．：米国）に依頼して調達した。当該マイクロＲＮＡは、下記の塩基配列の二本鎖ＲＮＡである。以下、この実施例においては、特に断らない限り、この天然型ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０の二本鎖ＲＮＡ（アンビオン社の商品名：ＭＣ１７４９６）を「ｍｉＲ−Ｘ」と記載する。

（ａ）−２：塩基改変誘導体
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０（成熟ｍｉＲＮＡ）の二本鎖ＲＮＡの塩基改変誘導体の合成を、株式会社ジーンデザインに依頼した。当該塩基改変誘導体は、下記の４種類である。

以下、本実施例では、この塩基改変誘導体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−１」と記載する。

以下、本実施例では、この塩基改変誘導体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−２」と記載する。

以下、本実施例では、この塩基改変誘導体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−３」と記載する。

以下、本実施例では、この塩基改変誘導体を、特に断らない限り「ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−４」と記載する。

（ｂ）本発明の第二の二本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲ−７６６−５ｐ）
ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）をガイド鎖とする二本鎖ｍｉＲＮＡの合成を、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．：米国）に依頼して調達した。当該二本鎖ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−５ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）とｈｓａ−ｍｉＲ−７６６−３ｐ（成熟ｍｉＲＮＡ）からなる天然型の略相補鎖として、下記の構造を取ることが知られている。以下、本実施例では、この二本鎖ＲＮＡ（アンビオン社の商品名：ＭＣ２３８４７）を、特に断らない限り「ｍｉＲ−７６６−５ｐ」と記載する。

（ｃ）対照ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ
対照のｍｉＲＮＡは、コントロールｍｉＲＮＡ(ネガティブコントロール＃１)（アンビオン社）を用いた。

ＢＲＤ２（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ−００４９３５−０２−０００５）、ＢＲＤ３（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ−００４９３６−０１−０００５）、ＢＲＤ４（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ−００４９３７−０２−０００５）、ＥＧＦＲ（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ−００３１１４−０３−０００５）、ＣＤＫ２（ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：Ｍ−００３２３６−０４−０００５）に対するｓｉＲＮＡは、各々ダーマコン社から入手した。

（２）がん細胞株
膵がん細胞株（Ｐａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２細胞、ＣＦＰＡＣ１細胞、ＳＷ１９９０細胞）、乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＫ−ＢＲ３細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、ＣＲＬ１５００細胞、ＹＭＢ−１−Ｅ細胞）、肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＵＴ２９細胞、１１−１８細胞）、肝がん細胞株（Ｓｋ−Ｈｅｐ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞）はアメリカンカルチャーコレクション（米国）から購入した。ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞株（Ｔｙ−８２細胞）はＪＣＲＢ細胞バンクより購入した。食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０細胞）は嶋田裕博士（富山大学）より供与を受け、ＫＹＳＥ１５０シスプラチン耐性株は以前に樹立されたものを用いた（Fujiwara N ET AL., CANCER RES, 2015, vol 75, pages 3890-3901）。

Ｐａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２、ＫＹＳＥ１５０、ＫＹＳＥ１５０シスプラチン耐性株、ＣＦＰＡＣ１、ＳＷ１９９０、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＫ−ＢＲ３、Ｔ−４７Ｄ、ＣＲＬ１５００、ＹＭＢ−１−Ｅ細胞はダルベッコ改変イーグル培地に、Ａ５４９、ＨＵＴ２９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、Ｔｙ−８２、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、１１−１８細胞はＲＰＭＩ１６４０培地に、Ｓｋ−Ｈｅｐ１、Ｈｅｐ３Ｂ細胞はウイリアムＥ培地に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＬ１５培地に１０％ウシ胎児血清を添加して、５％ＣＯ２・３７℃で培養した。

大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６＋／＋細胞及びＨＣＴ１１６−／−細胞はＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ研究室より供与を受け、ダルベッコ改変イーグル培地に１０％ウシ胎児血清を添加して５％ＣＯ２・３７℃で培養した。

（３）抗体とＢＥＴ阻害剤
ウェスタンブロッティング用の抗体として、抗ＢＲＤ４抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＢＲＤ３抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、抗ＢＲＤ２抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＭＹＣ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、抗ＮＵＴ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＣＣＮＤ２抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＥＧＦＲ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）、抗ＣＤＫ２抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）、抗ＣＤＫ６抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗Ｖｉｎｃｕｌｉｎ抗体（シグマ社）、抗βアクチン抗体（シグマ社）を用いた。免疫組織染色用の抗ＢＲＤ４抗体（Ａｔｌａｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）、抗ＢＲＤ３抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、抗ＣＤＫ２抗体（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、抗ＥＧＦＲ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）を用いた。ＢＥＴ阻害剤は、ＪＱ１（ＡｐＥｘＢＩＯ社）を用いた。

（４）統計解析
サブグループ間の差はＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔおよびＰａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ（下記のｉｎ ｖｉｖｏ試験におけるマウスの腫瘍の重量の解析において用いた）で解析した。計算されたＰ値が０．０５未満の場合、統計学的な有意差ありと判断した。

２．実施例の開示
［実施例群Ａ］
実施例群Ａ（実施例Ａ１−Ａ５）は、ｍｉＲ−Ｘとその塩基改変誘導体におけるがん治療剤の有効成分としての検討を行った結果を示している。

＜実施例Ａ１＞ 細胞増殖を抑制するｍｉＲＮＡのスクリーニング
図１−１は細胞増殖を抑制するｍｉＲＮＡのスクリーニングの手順を示している。

Ｐａｎｃ１由来細胞＃１、＃２（３０００個／ｗｅｌｌ又は５０００個／ｗｅｌｌ）に、１０９０種類の前駆体ｍｉＲライブラリー［Ｐｒｅ−ｍｉＲ−ｍｉＲＮＡ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ−Ｈｕｍａｎ Ｖ１５（アンビオン社）］またはコントロールｍｉＲＮＡを１０ｎｍｏｌ／Ｌを導入し、３日後に細胞生存数をクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色アッセイで評価した。細胞はＰＢＳで洗浄し、０．２％ＣＶ含有１０％ホルムアルデヒドＰＢＳで５分間固定した。過剰なＣＶ溶液は除去し、完全に空気乾燥された後、染色細胞は２％ＳＤＳ溶液を加えて、プレートを１時間振盪することで溶解した。光学密度（ＯＤ）吸光度はマイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯｍｘ；ペルキンエルマー社）を用いて５６０ｎｍで計測し、吸光度百分率をウェル毎に算出した。コントロールウェルにおけるコントロールｍｉＲＮＡを導入した細胞のＯＤ吸光度値は、生存細胞の百分率を決定するため、任意に１００％に設定した。

図１−２は、上記のＰａｎｃ１＃１とＰａｎｃ１＃２におけるスクリーニングの結果を表している。１０９０個の前駆体ｍｉＲＮＡを導入したときの、コントロールｍｉＲＮＡと比べた時の細胞生存の比を示している。左がＰａｎｃ１＃１細胞の、右がＰａｎｃ１＃２細胞の結果を示す。コントロールｍｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の細胞数を１としたときの相対的な細胞数を示す。増殖抑制効果の基準としてコントロールとの比で０．６未満とした。

細胞増殖抑制のカットオフ値を０．６未満としたとき、Ｐａｎｃ１＃１、Ｐａｎｃ１＃２とも増殖抑制をみとめたのは１２種類のｍｉＲＮＡであった。図１−３は、この結果をベン図で表したものである。Ｐａｎｃ１＃１において細胞増殖抑制効果を認めたのは２９種類、Ｐａｎｃ１＃２において増殖抑制効果を認めたのは６５種類認め、両方に共通するものとして１２種類存在することを示している。

そのうち、ｍｉＲＢａｓｅのデータベース解析でその存在が確からしい（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ：ｈｉｇｈ）ｍｉＲＮＡは４種類であった。その４種類のうち、腫瘍抑制ｍｉＲＮＡとして報告が認められないｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−Ｘ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０）が特定された。

次に、１０ｎｍｏｌ／ＬのｍｉＲ−Ｘ（対照は、コントロールｍｉＲＮＡ(ネガティブコントロール＃１（アンビオン社）：ｍｉＲ−ＮＣ)を、それぞれにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロゲン社)を用いて、標的がん細胞株に、添付文書に従って導入した。

標的がん細胞株は、膵がん細胞株［Ｐａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２、ＣＦＰＡＣ１細胞、ＳＷ１９９０細胞］、乳がん細胞株［ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（トリプルネガティブ乳がん細胞株：トリプルネガティブ乳がんは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＨＥＲ２のいずれも腫瘍細胞に発現していない乳がんであって、これらの受容体等に着目したホルモン療法や分子標的薬の有効性が認められず、予後が悪いがんとして知られている）、ＳＫ−ＢＲ３細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、ＣＲＬ１５００細胞、ＹＭＢ−１−Ｅ細胞］、肺がん細胞株［ＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞、Ａ５４９細胞（非小細胞性肺がん細胞株）、ＨＵＴ２９細胞（非小細胞性肺がん細胞株）、１１−１８細胞］、肝がん細胞株［Ｓｋ−Ｈｅｐ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞］、食道がん細胞株［ＫＹＳＥ１５０と、そのシスプラチン（ＣＤＤＰ）耐性株ＫＹＳＥ１５０ ＣＤＤＰ−Ｒ］である。

図１−４に、上記導入７２時間後の、上記の２種類の膵がん細胞株（Ｐａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２）の顕微鏡写真である。それぞれの膵がん細胞株において、ｍｉＲ−Ｘ導入群で死細胞を多数認め、生存細胞が対照と比べて少ないことが示されている。

図１−５は、膵がん細胞株（Ｐａｎｃ１、 ＭＩＡＰａＣａ２）、 トリプルネガティブ乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、食道がん細胞株（ＫＹＳＥ１５０と、そのシスプラチン（ＣＤＤＰ）耐性株ＫＹＳＥ１５０ ＣＤＤＰ−Ｒ）、肝がん細胞株（Ｓｋ−Ｈｅｐ１）、非小細胞性肺がん細胞株（ＨＵＴ２９、Ａ５４９細胞）における、ｍｉＲ−ＮＣ又はｍｉＲ−Ｘ投与時の細胞増殖曲線を示している。いずれの細胞株においても、ｍｉＲ−Ｘ投与により、顕著な増殖抑制効果が認められた。

さらに、図１−５に図示したがん細胞株以外の、標的がん細胞株、すなわち、膵がん細胞株［ＣＦＰＡＣ１細胞、ＳＷ１９９０細胞］、乳がん細胞株［ＳＫ−ＢＲ３細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、ＣＲＬ１５００細胞、ＹＭＢ−１−Ｅ細胞］、肺がん細胞株［ＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞、１１−１８細胞］、肝がん細胞株［Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞］、においても、ｍｉＲ−Ｘ投与により、顕著な増殖抑制効果が認められた（図１−６）。

以上の結果から、ｍｉＲ−Ｘは、難治性のがんを含めて様々ながん種において、著明に増殖抑制効果を示すことが示された。

＜実施例Ａ２＞ ｍｉＲ−Ｘの機能的標的としてのＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫファミリー遺伝子の同定
上記のｍｉＲ−ＮＣ又はｍｉＲ−Ｘを導入した、Ｐａｎｃ１細胞、ＭＩＡＰａＣａ２細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して、遺伝子発現のアレイ解析を行った。当該遺伝子発現アレイ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ４ｘ４４Ｋ遺伝子発現アレイ（アジレントテクノロジー社）を用いて、その操作マニュアルに従って行った。遺伝子発現アレイ解析は、それぞれのｍiＲ導入がん細胞に対して２回ずつ行い、データはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフト（アジレントテクノロジー社）を用いて解析した。

図２−１は、上記遺伝子発現アレイ解析の結果と、Ｔａｒｇｅｔ Ｓｃａｎデータベースから予測される、ｍｉＲ−Ｘが３’ＵＴＲ領域に作用する標的遺伝子候補の数をベン図で示している。ｍｉＲ−ＮＣ導入群と比較して２倍を超えて発現が抑制されている遺伝子のうち、当該３種類のがん細胞株に共通する遺伝子は２２８個存在した。この共通遺伝子２２８個のうち、Ｔａｒｇｅｔ Ｓｃａｎデータベースで、ｍｉＲ−Ｘの３’ＵＴＲ領域の標的遺伝子候補として挙げられている遺伝子は９９個存在した。

これらの結果から、ｍｉＲ−Ｘの標的候補として、細胞増殖に関連する遺伝子であるＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子に着目した。図２−２は、実施例Ａ１において記した要領でｍｉＲ−Xを導入した、膵がん細胞株である、Ｐａｎｃ１細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞において、ウエスタンブロットを行った結果を示す写真図面である。ウエスタンブロットは、全細胞の溶解物でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパクをＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社）に転写し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０と５％スキムミルクを含有するＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングを行った後、当該膜を抗体と共に４℃で一晩反応させた。２次抗体の希釈倍率は、抗ＥＧＦＲ抗体(１／２００)、抗ＣＤＫ２抗体(１／２００)、抗ＣＤＫ６抗体(１／１０００)、抗β−アクチン抗体(１／５０００)であった。当該膜を洗浄後、ＨＲＰ結合抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ抗体（ともに１／５０００）で室温１時間暴露した。結合した抗体は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて視覚化した。その結果、これらの膵がん細胞にｍｉＲ−Ｘを導入することによる、ＣＤＫ２遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、及び、ＥＧＦＲ遺伝子の発現の抑制が認められた。

図２−３は、ＣＤＫ２遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子の３’ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、ｍｉＲ−Ｘのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証の結果を示している。ｍｉＲ−Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子共に一つずつ存在し、当該アッセイに用いるルシフェラーゼレポータープラスミドは、ｐｍｉＲＧｌｏ Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ(プロメガ社)のルシフェラーゼ遺伝子の下流に、当該相同領域を含むＣＤＫ２遺伝子又はＥＧＦＲ遺伝子の３'ＵＴＲ領域、あるいは、この領域に変異を入れた配列を挿入することで作成した。全ての部位特異的変異は、ＫＯＤ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて作成した。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、Ｐａｎｃ１細胞又はＭＩＡＰａＣａ２細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン社）を用いて添付文書に沿って導入し、次の日にｍｉＲ−Ｘ又はコントロールｍｉＲＮＡを導入した。２日後に、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて測定し、相対的ルシフェラーゼ活性は対応する内部標準コントロールのウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正することで、ホタルルシフェラーゼ活性を標準化し、算出した。

ＣＤＫ２遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子共、ｍｉＲ−Ｘ導入により、野生型の３’ＵＴＲ領域に対応するルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ−Ｘのガイド鎖の塩基配列とマッチする領域に変異を入れたベクターではルシフェラーゼ活性は回復した。これらの結果から、ｍｉＲ−Ｘは、ＣＤＫ２遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の３’ＵＴＲ領域への作用により、直接ＣＤＫ２遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の発現を抑制していることが示された。

図２−４は、膵がん細胞株であるＰａｎｃ１細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞にｓｉＲＮＡを作用させて、ＣＤＫ２遺伝子をノックダウンしたときの細胞増殖に対する効果を示している。ＣＤＫ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡの作用により、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＣ）を導入したときと比較した。ウエスタンブロットを実施例Ａ２に記した要領に従って行うことにより、ＣＤＫ２遺伝子の発現は抑制されていることが示された。また、ＭＩＡＰａＣａ２細胞においては、ＣＤＫ２遺伝子のノックダウンに伴い、細胞増殖が抑制されていた。これにより、ＣＤＫ２遺伝子の発現が実際にこれらの膵がん細胞株の増殖に寄与していることが確認された。また、本発明のがん治療剤の有効成分を作用させた場合よりも、細胞増殖の抑制度合いは僅かであることから、本発明のがん治療剤の有効性が明らかになっている。

図２−５は、膵がん細胞株であるＰａｎｃ１細胞と、肺がん細胞株であり、ＥＧＦＲがドライバーとなって癌の増殖を促進しているＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞にｓｉＲＮＡを作用させて、ＥＧＦＲ遺伝子をノックダウンしたときの細胞増殖に対する効果を示す。ＥＧＦＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの作用により、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＣ）を導入したときと比較した。ウエスタンブロットを行うことにより、ＥＧＦＲ遺伝子の発現は抑制されていることが示された。また、これらの細胞においては、ＥＧＦＲ遺伝子のノックダウンに伴い、細胞増殖が抑制されていた。これにより、ＥＧＦＲ遺伝子の発現が実際にこれらのがん細胞株の増殖に寄与していることが確認された。また、本発明のがん治療剤の有効成分を作用させた場合よりも、細胞増殖の抑制度合いは僅かであることから、本発明のがん治療剤の有効性が明らかになっている。

図２−６は、肺がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞に対して、ｍｉＲ−Ｘを導入したときの細胞増殖に対する効果を示している。上記のように、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞はＥＧＦＲがドライバーとなってがんの増殖を促進している肺がん細胞であり、ＥＧＦＲ阻害剤に対して抵抗性の変異を有することが知られている。このようなＥＧＦＲ阻害剤抵抗性の肺がん細胞に対しても、ｍｉＲ−Ｘを導入すると、ＥＧＦＲの発現が減少し、さらにＣＤＫ２の発現も低下することがウエスタンブロットにより示され、さらに、細胞増殖も著明に抑制されることが明らかになった。

これらの結果は、ｍｉＲ−Ｘが、ＣＤＫ２遺伝子と、ＥＧＦＲ遺伝子の３’ＵＴＲ領域に直接結合することで、これらの遺伝子発現を抑制し、さらに、細胞増殖の著しい抑制に寄与していることを示している。

＜実施例Ａ３＞ ｍｉＲ−Ｘの機能的標的としてのＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子の同定
膵がん細胞株であるＰａｎｃ１細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞、及び、トリプルネガティブ乳がん細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、実施例Ａ１に記した要領でｍｉＲ−ＮＣ又はｍｉＲ−Ｘを導入して、これらに上記の発現アレイ解析を行った。図３−１は、これらのｍｉＲ導入細胞に対して行った発現アレイの結果とＳｔａｒＭｉｒＤＢデータベースから予測されるｍｉＲ−Ｘのコーディング領域（ＣＤＳ）の標的遺伝子候補の数を、ベン図で示している。

ｍｉＲ−ＮＣ導入群と比較して発現が１／２未満に抑制されている遺伝子のうち、上記３種類のがん細胞株に共通する遺伝子は２２８個存在し、このうち、ＳｔａｒＭｉｒＤＢデータベースでｍｉＲ−ＸのＣＤＳの標的遺伝子候補として挙げられている遺伝子は１０３個存在した。

これらの結果から、ｍｉＲ−Ｘの標的候補として、細胞増殖に関連するＢＲＤ４遺伝子に着目した。

上記した要領により、ｍｉＲ−Ｘを導入した膵がん細胞株Ｐａｎｃ１細胞とＭＩＡＰａＣａ２細胞におけるＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＣｙｃｌｉｎＤ２、ＭＹＣ、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５））、ＳＴＡＴ３タンパクの発現を、β−ａｃｔｉｎタンパクの発現をポジティブコントロールとしたウエスタンブロットを行うことにより検討し、結果を図３−２の写真図面に示す。図３−２において、ｍｉＲ−Ｘの導入によるＢＲＤ４の発現抑制が顕著に認められ、さらに、ＢＥＴファミリーであるＢＲＤ２、ＢＲＤ３タンパクの発現抑制が認められた。ＢＲＤ４の下流のターゲットであるＭＹＣ、ｐ−ＳＴＡＴ３、ＣＣＮＤ２（ＣｙｃｌｉｎＤ２）の発現低下も認められた。

図３−２はＰａｎｃ１、ＭＩＡＰａＣａ２において、ｈｓａ−ｍｉＲ−Ｘを導入により、ＢＲＤ４の発現の抑制を認めた。さらに、ＢＲＤ４のみならず、ＢＥＴファミリーであるＢＲＤ２、ＢＲＤ３の発現の低下および、ＢＲＤ４の下流のターゲットであるＭＹＣ、リン酸化ＳＴＡＴ３、ＣＣＮＤ２の低下も認めた。

図３−３は、膵がん細胞株Ｐａｎｃ１にｓｉＲＮＡを用いて、ＢＲＤ２遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＢＲＤ４遺伝子をそれぞれノックダウンしたときの、遺伝子発現と細胞増殖に対する効果を、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＣ）を用いた場合と比較しつつ示している。ウエスタンブロットにより、これらの遺伝子の発現が抑制されていることが示され、細胞増殖も抑制されていた。

図３−４は、Ｐａｎｃ１細胞にＢＲＤ４発現ベクターを導入し、ＢＲＤ４遺伝子を過剰発現させたときの細胞増殖に対する影響を示す。ＢＲＤ４発現ベクターはＢＲＤ４のｃＤＮＡをカズサＤＮＡ研究所より購入し、プロメガ社より購入したｐＦＮ２８Ａ Ｈａｌｏｔａｇ ＣＭＶ−ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ ｖｅｃｔｏｒに組み込んで作製した。ＢＲＤ４遺伝子には、Ｈａｌｏｔａｇというタグをつけることで、外因性（ｅｘｏ）に導入したＢＲＤ４と内因性（ｅｎｄｏ）に発現しているＢＲＤ４を区別できるようにした。ＢＲＤ４発現ベクターの導入により、コントロールであるＥｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒを導入した細胞と比べ、外因性に導入されたＢＲＤ４の発現を認め、さらに、ＢＲＤ４の下流のターゲットであるＭＹＣの発現も上昇していることが、ウエスタンブロットの写真図面により示されている。そして、ＢＲＤ４遺伝子の導入によるＢＲＤ４の過剰発現により、細胞増殖が促進していることが分かった。

これらの結果から、ｍｉＲ−ＸはＢＲＤ４遺伝子を含むＢＥＴファミリー遺伝子を抑制し、がん細胞の増殖を抑制していることが示された。

次に、ｍｉＲ−ＸがＢＲＤ４遺伝子やＢＲＤ３遺伝子を直接制御しているかどうかを調べるために、ＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳ領域を、ルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、ｍｉＲ−Ｘのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証を、概ね実施例Ａ２に記した要領で行った。ｍｉＲ−Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳには近接して２ヶ所存在し、ＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳに一カ所存在する。この領域を含む野生型のＣＤＳ領域、又は、この領域に変異を入れた配列をルシフェラーゼレポーターベクターに組み込み、膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞に導入後、ｍｉＲ−Ｘを導入した。図３−５、図３−６上段はそれぞれＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳ配列のうち、ｍｉＲ−Ｘのガイド鎖の塩基配列と本来相同する領域の遺伝子配列と、上記の変異の導入配列を示す。図３−５、図３−６下段に示すように、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子共、ｍｉＲ−Ｘ導入により、野生型のＣＤＳではルシフェラーゼ活性の低下を認め、ｍｉＲ−Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域に変異を入れたベクターでは、ルシフェラーゼ活性は回復した。

また図３−７に示すように、ＢＲＤ３遺伝子の３’ＵＴＲ領域に存在するｍｉＲ−Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域で、上記と同様のルシフェラーゼレポーターアッセイを行ったが、ｍｉＲ−Ｘの導入によるルシフェラーゼ活性の低下は認められず、ｍｉＲ−Ｘは、ＢＲＤ３遺伝子の３’ＵＴＲ領域は標的にしていないことが示された。

さらにＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子の発現ベクター、及び、これらの遺伝子のＣＤＳにおけるｍｉＲ−Ｘのガイド鎖の塩基配列と相同する領域に、アミノ酸配列を変えないように変異を導入したコンストラクトを用いて、ｍｉＲ−Ｘが実際に、ＢＲＤ３遺伝子とＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳを介して遺伝子発現が制御されているか否かを検証した。図３−８、図３−９は、それぞれＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子の発現が、ｍｉＲ−ＸによりそれぞれのＣＤＳを介して抑制されていることを、ウエスタンブロットの写真図面で示している。これらの図面には、膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞に、ＢＲＤ４遺伝子又はＢＲＤ３遺伝子の発現ベクターと、これらの遺伝子変異ベクターを導入後、ｍｉＲ−Ｘを導入すると、野生型のＢＲＤ４遺伝子又はＢＲＤ３遺伝子を導入した細胞では、その発現がｍｉＲ−Ｘにより抑制されている一方、変異型のＢＲＤ４遺伝子又はＢＲＤ３遺伝子を導入した場合には、ｍｉＲ−Ｘによるこれらの遺伝子の発現抑制が解除されていることが示されている。

これらの結果から、ｍｉＲ−Ｘは、ＢＲＤ４遺伝子とＢＲＤ３遺伝子のＣＤＳ領域に直接結合することで、これらの遺伝子の発現を抑制していることが明らかになった。

＜実施例Ａ４＞ ｍｉＲ−Ｘの機能的標的としてのＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子の同定
稀ではあるが、極めて悪性度の高いＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの主病因は１５番染色体と１９番染色体の転座によってできるＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子であることが知られている。図４−１は、ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子のｍＲＮＡとｍｉＲ−Ｘの関係を示している。ｍｉＲ−Ｘは、前記のようにＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳを標的とするため、このＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子もまた標的であると予測した。

図４−２にＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの細胞株Ｔｙ−８２細胞にｍｉＲ−Ｘ導入した結果を、細胞増殖曲線とウエスタンブロットの写真図面にて示す。Ｔｙ−８２は、ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子を発現しているが、ｍｉＲ−Ｘの導入により、ＢＲＤ４−ＮＵＴの発現は抑制され、その下流であるＭＹＣも抑制され、その結果、細胞増殖は著明に抑制されたことが示されている。

また、ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａに対して、臨床試験においてＢＥＴ阻害剤が有効とされており、図４−３にＴｙ−８２に対するＢＥＴ阻害剤ＪＱ１の効果を示す。ＪＱ１濃度５００ｎＭで、ＢＲＤ４−ＮＵＴの下流であるＭＹＣは抑制され、細胞増殖は著明に抑制された。

次に、ｍｉＲ−ＸがＢＥＴ阻害剤の抵抗性を克服できるかどうかを検証するために、Ｔｙ−８２細胞を用いてＪＱ１耐性株を樹立した。すなわち、Ｔｙ−８２細胞に対してＪＱ１を低濃度加えた培養液で培養し、生き残った細胞をＪＱ１が含まれていない培養液で増殖させた後、これをＪＱ１の濃度を前回よりも増加させた培養液で培養し、再び生き残った細胞をＪＱ１が含まれていない培養液で増殖させた後、これをＪＱ１の濃度を前回よりも増加させた培養液で培養する。このＪＱ１の濃度を漸増させて生き残りの細胞を培養確保する工程を１ヶ月以上繰り返し、最終的にＪＱ１の濃度が２．５μＭの培養液でも生存できる細胞を確保し、これを樹立されたＪＱ１耐性株として用いた。

図４−４は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ システムを用いて測定した、Ｔｙ−８２細胞と新たに樹立したＴｙ−８２ＪＱ１耐性株の、ＪＱ１の用量反応曲線とＩＣ５０を示す。Ｔｙ−８２ＪＱ１耐性細胞はＴｙ−８２細胞と比べＩＣ５０が３倍程度高く、ＪＱ１抵抗性であることが示されている。

図４−５に、このＴｙ−８２ＪＱ１耐性細胞に対して、ｍｉＲ−Ｘを導入した結果を、細胞増殖曲線とウエスタンブロットの写真図面にて示す。ｍｉＲ−Ｘの導入により、Ｔｙ−８２ＪＱ１耐性細胞においても、ＢＲＤ４−ＮＵＴ遺伝子の発現と、下流のＭＹＣ遺伝子の発現が著明に抑制され、細胞増殖も著明に抑制されることが明らかになった。

これらの結果から、ｍｉＲ−ＸはＢＲＤ４−ＮＵＴ遺伝子の発現を抑制することで、ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａの増殖を抑制し、さらにＢＥＴ阻害剤ＪＱ１抵抗性をも克服することができることが示された。

＜実施例Ａ５＞ ｍｉＲ−Ｘの投与によるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍抑制効果
７週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスをオリエンタルバイオサービス社から購入し、無菌状態で飼育した。５×１０⁶個の膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞を含むＰＢＳ １００μｌをマウスの背側横腹に皮下注射した。図５−１は、この皮下注射以降のｉｎ ｖｉｖｏ試験のスケジュールである。１ｎｍｏｌのｍｉＲ−Ｘ、又は、コントロールｍｉＲＮＡと、２００μｌのＡｔｅｒｏＧｅｎｅ（ＫＯＫＥＮ社）の混合物を、腫瘍と皮膚の間の隙間に、計５回投与した（ＭＩＡＰａＣａ２細胞の注射から７、１１、１５、１８、２１日後）。細胞投与後２３日後、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。すべてのマウスに対して行った実験手順は東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を受けた。

図５−２は、ＭＩＡＰａＣａ２細胞の注射から２３日後の代表的なマウスの皮下腫瘍の外観を示す。

図５−３は摘出された腫瘍の写真を示す。各マウス毎に摘出した腫瘍の重量を軽量したところ、ｍｉＲ−Ｘの投与群の腫瘍の重量は、コントロールｍｉＲＮＡの投与群に比べて、有意に軽い結果であった。

腫瘍の体積は、ｍｉＲ−Ｘの投与により、コントロールｍｉＲＮＡの投与と比較し、有意に減少した（図５−４）。腫瘍の体積は（長径）×（短径）２×０．５で計算した。

図５−５は摘出された腫瘍におけるｍｉＲ−Ｘの発現解析を示している。ｈｓａ−ｍｉＲ−Ｘの発現レベルは定量ＲＴ−ＰＣＲによって算出した結果を示している。

この定量ＲＴ−ＰＣＲにおいては、腫瘍組織より全ＲＮＡを、ＴＲＩｓｕｒｅ試薬（バイオライン社）を用いて標準的方法で分離し、当該全ＲＮＡから調整された一本鎖ＲＮＡはｍｉＲ−Ｘに特異的なプライマーで増幅された。ｍｉＲ−Ｘに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社）、Ｔａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステム社）を用いて、これらの操作マニュアルに従って行った。ｍｉＲ−Ｘの発現レベルは、全ＲＮＡの初期量の標準化コントロールとしてＲＮＵ６Ｂの発現量により補正することで標準化した。

この定量ＲＴ−ＰＣＲによる検討の結果、腫瘍細胞におけるｍｉＲ−Ｘの発現は、ｍｉＲ−Ｘ投与群において著明に増加していることが確認できた。

図５−６には、上記のｍｉＲ−Ｘの発現増加に伴う、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、及び、ＣＤＫ２遺伝子の発現の低下を、摘出腫瘍の免疫染色で示した。

免疫染色において、腫瘍サンプルは１０％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、パラフィン包埋を行い、４μｍ厚の切片に薄切し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法でＢＲＤ４、ＢＲＤ３、ＥＧＦＲ、ＣＤＫ２の免疫組織化学染色を行った。パラフィンで包埋された腫瘍切片は、キシレンで脱パラフィン後、エタノールで再水和をおこなった。１０ｍＭ のクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で煮沸することで抗原の賦活化を行い、当該切片は内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために０．３％過酸化水素含有メタノールで処理した。その後、当該切片は、抗ＢＲＤ４抗体（１／５００希釈）、抗ＢＲＤ３抗体（１／５００希釈）、抗ＥＧＦＲ抗体（１／２００希釈）又は抗ＣＤＫ２抗体（１／５００希釈）で、４℃で一晩反応させた。結合した抗体は色抗原としてジアミノベンディジン（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ−ＥｌｕｔｅＡＢＣｋｉｔ：ベクターラボラトリー社）を用いて可視化し、その後、当該切片はヘマトキシリンで対比染色した。

これらの結果からｍｉＲ−Ｘの投与により、インビボの腫瘍組織において、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子及びＣＤＫ２遺伝子の発現が抑制され、腫瘍増殖が抑制されたことが示された。

＜実施例Ａ６＞ 塩基配列改変誘導体のがん細胞に対する抑制効果の検討
図６は、本発明のがん治療剤の有効成分の一部である４種類の第一の二本鎖ｍｉＲＮＡ（塩基配列改変型を含む）導入による腫瘍抑制効果を、ｍｉＲ−Ｘとの比較において検討した結果を示す図面である。すなわち、膵臓がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞に対して、実施例Ａ１に記した要領で、ｍｉＲ−ＮＣ（図中、ＮＣ）、ｍｉＲ−Ｘ（図中、ｍｉＲＶａｎａ）、ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−１、ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−２、ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−３、及び、ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−４を導入し、これらの導入細胞に対してウエスタンブロットの写真図面と、がん細胞の増殖を経時的に追って、これに基づく細胞増殖曲線を示した。

この結果により、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０の天然型二本鎖ＲＮＡと同等のがん抑制効果が、上記４種の塩基改変誘導体にも認められることが明らかになった。

＜実施例Ａ群のまとめ＞
図７は、上記の実施例Ａ群の結果から導かれる、ｍｉＲ−Ｘが腫瘍増殖を抑制する機序のまとめの図である。

上記の実施例Ａ群の結果から、ｍｉＲ−Ｘは、直接ＢＲＤ４遺伝子のコーディング領域を標的とすることでＢＲＤ４遺伝子のタンパク質レベルの発現を抑制し、さまざまながんにおいて抗がん効果を発揮することを見出した。さらに、ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子の転写産物ｍＲＮＡを直接標的とすること、ＥＧＦＲ遺伝子とＣＤＫ２遺伝子の３’ＵＴＲ領域を標的とすることも明らかになった。また、ＣＤＫ６遺伝子の発現を抑制することも明らかになった。

がんの治療においてはしばしば、薬剤抵抗性が問題となる。肺がんにおいてはＥＧＦＲ阻害剤が臨床応用され、実際に使用され、有効性も確認されているが、その一方でＥＧＦＲ阻害剤に対する抵抗性が問題となっている。この点上記実施例Ａ群に示したように、ｍｉＲ−Ｘの導入により、ＥＧＦＲ阻害剤抵抗性の肺がん細胞においてもＥＧＦＲそのものを減少させることで当該肺がん細胞の増殖を抑制できることが明らかになり、ｍｉＲ−Ｘが、ＥＧＦＲ抵抗性肺がんの薬剤抵抗性を克服できることを示している。

また、ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａは稀な悪性度の極めて高い予後不良のがんであり、その主病因はＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子であることもわかっているが、これまで治療方法はなく、臨床研究レベルでＢＥＴ阻害剤が用いられている（非特許文献１７）。この点上記実施例Ａ群に示したように、ｍｉＲ−ＸがＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子を直接抑制することで、ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞においても高い抗がん効果を発揮することを見出し、さらにはＢＥＴ阻害剤抵抗性のＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞に対してさえも、増殖を抑制できることを見出した。このことは、ｍｉＲ−Ｘが、難治性のＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａに対して極めて有効であることを示している。

さらに、ｍｉＲ−Ｘの塩基配列を一部改変した二本鎖ＲＮＡ（ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−１、ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−２、ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−３、及び、ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ−４）においても、ｍｉＲ−Ｘと同等のがん抑制効果が認められ、マイクロＲＮＡの構造的なアプローチによる改変により、有効成分の多様化を行うことも可能であることが明らかになった。

従来の研究によっても、一つのｍｉＲＮＡは各々の遺伝子のコーディング領域あるいは３'ＵＴＲ領域に直接結合することにより、複数の標的の発現を阻害することができることが示されており、このことはがんの活性化に関与する複数の経路を一つのｍｉＲＮＡが標的とすることを示している。例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａは、ＣＣＮＤ１遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＮＯＴＣＨ遺伝子といった複数の標的を介して、腫瘍増殖を抑制することが知られている（非特許文献１８、１９）。この点上記実施例Ａ群においては、ｍｉＲ−Ｘやその塩基改変誘導体の投与が、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、及び、ＣＤＫ６遺伝子を標的とすることで、ヌードマウスの皮下に形成された膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２細胞由来の腫瘍の増大を抑制する効果が認められた。

このように本発明は、特に、ＢＲＤ４遺伝子、ＢＲＤ３遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＣＤＫ２遺伝子、又は、ＣＤＫ６遺伝子が活性化した腫瘍、さらに、ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子を発現している腫瘍に対する有効性が認められるがん治療剤を提供するものである。

［実施例Ｂ］ ｍｉＲ−７６６−５ｐのがん抑制効果の検討
大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６＋／＋（ｐ５３遺伝子が野生型の細胞株）、ＨＣＴ１１６−／−（野生型のｐ５３遺伝子を欠失させた細胞株）、食道がん細胞株であるＫＹＳＥ１５０、及び、膵がん細胞株であるＭＩＡＰａＣａ２に対して、１０ｎｍｏｌ／ＬのｍｉＲ−７６６−５ｐをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロゲン社)を用いて、標的がん細胞株に、添付文書に従って導入し、導入後７２時間後の各導入細胞に対し、実施例Ａ２に記した要領で、ウエスタンブロットを、ＢＲＤ４とＭＹＣに対して行った。その結果を、図８−１に示す。

図８−１に示すように、ｍｉＲ−７６６−５ｐの導入により、上記のがん細胞のＢＲＤ４遺伝子と、その下流のＭＹＣ遺伝子の発現が抑制されていることが明らかになった。

次に、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域と３’ＵＴＲ領域をルシフェラーゼベクターに組み込んだコンストラクトを用いた、ｍｉＲ−７６６−５ｐのルシフェラーゼレポーターアッセイによる検証を行った。ｍｉＲ−７６６−５ｐの塩基配列と相同する領域は、ＣＤＳ領域に５カ所（Ｒ１−５）、３’ＵＴＲ領域に１カ所（Ｒ６）存在する（図８−２）。

当該アッセイに用いるルシフェラーゼレポータープラスミドは、ｐｍｉＲＧｌｏ Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ(プロメガ社)のルシフェラーゼ遺伝子の下流に、当該相同領域を含むＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域又は３'ＵＴＲ領域を挿入することで作成した。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６−／−細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン社）を用いて添付文書に沿って導入し、次の日にｍｉＲ−７６６−５ｐ又はコントロールｍｉＲＮＡを導入した。２日後に、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて測定し、相対的ルシフェラーゼ活性は対応する内部標準コントロールのウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正することで、ホタルルシフェラーゼ活性を標準化し、算出した。

図８−３は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ１とＲ２を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。このことより、ｍｉＲ−７６６−５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ１とＲ２を標的としていると考えられる。

図８−４は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ３を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。このことより、ｍｉＲ−７６６−５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ３を標的としていると考えられる。

図８−５は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ４を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。このことより、ｍｉＲ−７６６−５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ４を標的としていないと考えられる。

図８−６は、ＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域の相同部分のＲ５を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。このことより、ｍｉＲ−７６６−５ｐはＢＲＤ４のＣＤＳ領域のＲ５を標的としていると考えられる。

図８−７は、ＢＲＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域の相同部分のＲ６を標的とした場合の上記ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。このことよりｍｉＲ-７６６-５ｐはＢＲＤ４遺伝子の３'ＵＴＲ領域を標的にしていないことが示された。

以上の結果からｍｉＲ−７６６−５ｐはＢＲＤ４遺伝子のＣＤＳ領域のＲ１Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５を標的とし、ＢＲＤ４の発現を抑制しており、ＢＲＤ４遺伝子を過剰発現しているがんに対して抑制作用があることが示された。

Claims (10)

1. 下記（１）の二本鎖ＲＮＡ、及び／又は、下記（２）の二本鎖ＲＮＡ、を有効成分とするがん治療剤：
   （１）塩基配列「ＡＧＣＵＵＵＵＧＧＧＡＡＵＵＣＡＧＧＵＡｋ₁ｋ₂」［式中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、及び、Ｕはウラシルを表し、ｋ₁とｋ₂は同一又は異なって、Ｇ、Ｔ又はＵである］の一本鎖ＲＮＡ、並びに、塩基配列「ＵＡＣＣＵＧＡＡＵＵｈＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵ」［式中、ｈは、Ａ、Ｕ又はＣである］の一本鎖ＲＮＡからなる、略相補的な二本鎖ＲＮＡ；
   （２）塩基配列「ＡＧＧＡＧＧＡＡＵＵＧＧＵＧＣＵＧＧＵＣＵＵ」の一本鎖ＲＮＡ、並びに、塩基配列「ＡＣＵＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＵＣＡＧＣ」の一本鎖ＲＮＡからなる、略相補的な二本鎖ＲＮＡ。
2. ｈがＡ又はＵの場合に、塩基配列「ｋ₁ｋ₂」は「ＧＵ」であり、ｈがＣの場合に、塩基配列「ｋ₁ｋ₂」は「ＴＴ」又は「ＧＧ」である、請求項１に記載のがん治療剤。
3. 治療の対象となるがんは、ＢＲＤ４遺伝子を過剰に発現しているがんである、請求項１又は２に記載のがん治療剤。
4. 治療の対象となるがんは、ＢＲＤ４−ＮＵＴ融合遺伝子を発現しているがんである、請求項１−３のいずれか１項に記載のがん治療剤。
5. 塩基配列「ＡＧＣＵＵＵＵＧＧＧＡＡＵＵＣＡＧＧＵＡｋ₁ｋ₂」［式中、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、及び、Ｕはウラシルを表し、ｋ₁とｋ₂は同一又は異なって、Ｇ、Ｔ又はＵである］の一本鎖ＲＮＡ、並びに、塩基配列「ＵＡＣＣＵＧＡＡＵＵｈＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵ」［式中、ｈは、Ａ、Ｕ又はＣである］の一本鎖ＲＮＡからなる、略相補的な二本鎖ＲＮＡを有効成分とするがん治療剤の治療の対象となるがんは、ＣＤＫ２遺伝子を過剰に発現しているがんである、請求項１−４のいずれか１項に記載のがん治療剤。
6. 治療の対象となるがんは、ＢＲＤ３遺伝子を過剰に発現しているがんである、請求項５に記載のがん治療剤。
7. 治療の対象となるがんは、ＥＧＦＲ遺伝子を過剰に発現しているがんである、請求項５又は６に記載のがん治療剤。
8. 治療の対象となるがんは、ＣＤＫ６遺伝子を過剰に発現しているがんである、請求項５−７のいずれか１項に記載のがん治療剤。
9. 治療の対象となるがんは、膵がん、肝がん、食道がん、肺がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、皮膚がん、腎がん、血液腫瘍、及び、ＮＵＴ ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、からなる群から選ばれるがんである、請求項１−８のいずれか１項に記載のがん治療剤。
10. 治療の対象となるがんは、前記がん治療剤の局所への投与が可能ながんである、請求項１−８のいずれか１項に記載のがん治療剤。