JP2009541304A5 - - Google Patents

Description

抗癌治療としてのオーロラキナーゼＢのＲＮＡ干渉媒介阻害およびその組み合わせ

関連特許出願への相互参照
この出願は、２００６年６月２１日に出願された、インド国仮出願第９７４／ＭＵＭ２００６号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、オーロラ（Ａｕｒｏｒａ）Ｂ（ＡｕｒｋＢ）発現を調節する小核酸分子の化合物、組成物および使用を含む、遺伝子およびタンパク質の発現を調節するための短い核酸分子、例えば短い鎖干渉性核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用に関する。本発明の化合物および方法は、単独でまたは他の治療と併用して癌の治療に適用される。

発明の背景
オーロラキナーゼは、セリン／スレオニンキナーゼのファミリーである。オーロラＡおよびＢキナーゼは、細胞周期の有糸分裂事象と関連し、オーロラＣキナーゼは、精巣のみに発現している（非特許文献１）。オーロラ−Ａキナーゼは、オーロラ−２、ＳＴＫ６、ＡＲＫ１およびオーロラ／ＩＰＬ−１関連キナーゼとも呼ばれ、有糸分裂中の中心体および微小管と関連している。オーロラＡキナーゼ（以下、「オーロラＡ」）は中心体に局在し、細胞周期機構と中心体との間の関連を制御している（非特許文献２；非特許文献３）。

オーロラＢキナーゼは、オーロラキナーゼＢ、オーロラＢ、オーロラ−１としても知られ、以下「ＡｕｒｋＢ」とし、細胞質分裂における前期から中期の動原体、中心紡錘体および中央体（ｍｉｄｂｏｄｙ）に局在している（非特許文献４）。ＡｕｒｋＢは、染色体パッセンジャータンパク質、内部セントロメアタンパク質（ｉｎｎｅｒ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＩＮＣＥＮＰ）、スルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）およびボレアリン（Ｂｏｒｅａｌｉｎ）タンパク質と結合して、４（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）染色体パッセンジャー複合体を形成し、そのサブ複合体（ＡｕｒｋＢおよびＩＮＣＥＮＰ）とともに、それぞれ、紡錘体チェックポイント、細胞質分裂およびヒストンＨ３のリン酸化に必要であると考えられている。（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＪＭ，Ｇｏｌｄｅｎ Ａ，およびＤｏｎｏｖａｎ Ｐ．ＡＩＲ−２：Ａｎ Ａｕｒｏｒａ／Ｉｐｌｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｍｉｄｂｏｄｙ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｙ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｃａｎｅｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８；１４３：１６３５−１６４６；Ｔｅｒａｄａ Ｙ，Ｔａｔｓｕｋａ Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｆ，Ｙａｓｕｄａ Ｙ，Ｆｕｊｉｔａ Ｓ，およびＯｔｓｕ Ｍ．ＡＩＭ−１：ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｄｂｏｄｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９８；１７：６６７−６７６；Ｇｉｅｔ ＲおよびＧｌｏｖｅｒ ＤＭ．Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ ａｕｒｏｒａ Ｂ Ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｏｒｇａｎｉｚｅ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｐｉｎｄｌｅ ｄｕｒｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎａｓｉｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；１５２：６６９−６８２）。ＡｕｒｋＢは、ＭＣＡＫをリン酸化し、したがって、有糸分裂中に二方向の制御において重要な役割を果たしている（Ｇｉｅｔ Ｒ，Ｐｅｔｒｅｔｔｉ ＣおよびＰｒｉｇｅｎｔ Ｃ．Ａｕｒｏｒａ Ｋｉｎａｓｅｓ，ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ，ａ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｒ ａ ｒｅａｌ ｌｉｎｋ？ Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００５；５：２４１−２５０）。

オーロラキナーゼの機能におけるいずれかの相違により、癌の顕著な特徴である、異数性または倍数性をもたらす有糸分裂異常が引き起こされ得る。実際に、染色体の不安定性は、癌を引き起し、癌の発生、したがって治療への耐性と明確に関連付けられる（Ｄｕｅｓｂｅｒｇ Ｐら，“Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ”Ｃｅｌｌ Ｏｎｃｏｌ．２００５；２７（５−６）：２９３−３１８；Ｄｕｅｓｂｅｒｇ Ｐら，“Ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ．”Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ Ｕｐｄａｔ．２００７ Ｍａｒ ２６）。オーロラキナーゼは、染色体の不安定性と結びつけられてきた。さらに、オーロラキナーゼの機能不全は、多数の癌、例えば非小細胞肺癌、表皮癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、並びにあらゆる頭部および頸部癌を含む口腔癌に見られる。（Ｋｅｅｎ Ｎ．およびＴａｙｌｏｒ Ｓ．Ａｕｒｏｒａ−ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ ２００４；４：９２７−９３６）。ＡｕｒｋＢの阻害は、姉妹染色分体の不適切な分離および細胞質分裂の障害をもたらす。ＡｕｒｋＢの過剰発現は、結果として悪性となる細胞増殖および侵襲性腫瘍の発生に結びつけられている。（Ｏｔａ Ｔ，Ｓｕｔｏ Ｓ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｈ，Ｈａｎ Ｚ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｆ，Ｍａｅｄａ ら Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ ｔｏ ＡＩＭ−１／Ａｕｒｏｒａ−Ｂ ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；６２：５１６８−５１７７；Ｖｉｓｃｈｉｏｎｉ Ｂ，Ｏｕｄｅｊａｎｓ ＪＪ，Ｖｏｓ Ｗ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＡ ａｎｄ Ｇｉａｃｃｏｎｅ Ｇ．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｕｒｏｒａ Ｂ Ｋｉｎａｓｅ，ａ ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ，ｉｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００６；５：２９０５−２９１３；Ｓｍｉｔｈ ＳＬ，Ｂｏｗｅｒｓ ＮＬ，Ｂｅｔｔｉｃｈｅｒ ＤＣ，Ｇａｕｔｓｃｈｉ Ｏ，Ｒａｔｓｃｈｉｌｌｅｒ Ｄ，Ｈｏｂａｎ ＰＲ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｕｒｏｒａ Ｂ Ｋｉｎａｓｅ（ＡＵＲＫＢ） ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔ，ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｄｒｉｖｅｎ ｆｒｏｍ ｏｎｅ ａｌｌｅｌｅ，ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００５；１９：７１９−２９）。これまでの試験では、オーロラの機能不全が癌の原因または結果であるのかどうか示されていない。ＡｕｒｋＢは、染色体の不安定性の防止に深く関与している。（Ｌｉｕ Ｑ，Ｋａｎｅｋｏ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｌ，Ｆｅｌｄｍａｎ ＲＩ，Ｎｉｃｏｓｉａ ＳＶ，Ｃｈｅｎ Ｊら Ａｕｒｏｒａ−Ａ Ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ２１５．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４；２７９：５２１７５−５２１８２；Ｋａｔａｙａｍａ Ｈ，Ｓａｓａｉ Ｋ，Ｋａｗａｉ Ｈ，Ｙｕａｎ Ｚ，Ｂｏｎｄａｒｕｋ Ｊら ＢＲＣＡＩ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ Ａ ｉｎｄｕｃｅｓ Ｍｄｍ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００４；３６：５５−６２；Ｏｕｃｈｉ Ｍ，Ｆｕｊｉｕｃｈｉ Ｎ，Ｓａｓａｉ Ｋ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｈ，Ｍｉｎａｍｉｓｈｉｍａ ＹＡら ＢＲＣＡＩ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｕｒｏｒａ−Ａ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ２ ｔｏ Ｍ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：１９６４３−１９６４８）。ＡｕｒｋＢ複合体の一部であるスルビビンは、アポトーシスおよび／または有糸分裂異常に対する主要な保護因子である（Ａｎｄｒｅｗｓ ＰＤ．Ａｕｒｏｒａ Ｋｉｎａｓｅｓ：ｓｈｉｎｉｎｇ ｌｉｇｈｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｏｒｉｚｏｎ？ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５；２４：５００５−５０１５）。したがって、ＡｕｒｋＢは、腫瘍形成において直接的な役割を有するように考えられる。

何人かの著者がオーロラ阻害剤を報告している（Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＶＬ，Ｔｉｇｈｅ Ａ，Ｅｌｌｓｔｏｎ Ｒ，Ｈａｗｏｒｔｈ Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｔら。Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｃｏｕｐｌｅｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｎａｐｈａｓｅ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＢｕｂＲ１，Ｍａｄ２ ａｎｄ Ｃｅｎｐ−Ｅ ｔｏ ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００４；１６１：２６７−２８０；Ｈａｕｆ Ｓ，Ｃｏｌｅ ＲＷ，Ｔｅｒｒａ Ｓ，Ｚｉｍｍｅｒ Ｃ，Ｓｃｈｎａｐｐ Ｇ，Ｗａｌｔｅｒ Ｒら。Ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｈｅｓｐｅｒａｄｉｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｉｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ−ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｉｎｄｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３；１６１：２８１−２９４ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＥＡ，Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ Ｄ，Ｍｏｏｒｅ Ｊ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ＲＫ，Ａｊｏｓｅ−Ａｄｅｏｇｕｎ ＡＯ，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．ＶＸ−６８０，ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅｓ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ ２００４；１０：２６２−２６７）。これらの阻害剤には、オーロラを別として、１３個の他のキナーゼの阻害を示すＺＭ４４７４３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａによる）が含まれる。ＡＺＤ１１５２（アストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）による）は、有糸分裂時に紡錘体凝集を阻害することが示されており、オーロラキナーゼの特異的阻害剤としてその効果を測定し、増殖性腫瘍における細胞分裂に対する影響を測定するために評価されている。ヘスペラジン（Ｈｅｓｐｅｒａｄｉｎ）（ベーリンガー・インゲルハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）による）は、ＡｕｒｋＢおよび２５個の他のキナーゼを阻害するが、オーロラＡおよびＣを阻害せず、細胞生存率に明らかな損失もなく倍数性だけをもたらす。

ＶＸ−６８０（バーテックス（Ｖｅｒｔｅｘ））は、３つのオーロラを全て阻害し、一連の癌細胞では、増殖を阻害し、アポトーシス誘導を増加させ、腫瘍細胞死を誘導することが見出された。現在、メルク（Ｍｅｒｃｋ）は、血液癌、再発もしくは非応答性固形腫瘍、または標準的な治療が現存しない癌を患っている患者において、ＶＸ−６８０の３つの臨床試験を行っている。これらの試験では、２４時間の連続注入または５日間の連続注入として投与された場合のＶＸ−６８０の安全性および耐容性が評価されている。臨床試験中のオーロラ阻害剤のうち、ＶＸ−６８０だけがオーロラに非常に特異的であるが、毒性骨髄副作用と関連し、腫瘍細胞死のメカニズムは、完全には理解されていない（Ｇｉｅｔ Ｒ，Ｐｅｔｒｅｔｔｉ ＣおよびＰｒｉｇｅｎｔ Ｃ．Ａｕｒｏｒａ Ｋｉｎａｓｅｓ，ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ，ａ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｒ ａ ｒｅａｌ ｌｉｎｋ？ Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００５；５：２４１−２５０）。

更なるオーロラ阻害剤が記載されている。日本特許出願の特開２００５−２７８４７２には、オーロラタンパク質に特異的に結合する、内部セントロメアタンパク質のＡｕｒｋＢの活性を阻害するペプチドが記載され；また、医薬組成物、スクリーニング法、およびキットも記載されている。日本特許出願の特開２００５−３２０３５１には、トリ−およびテトラ−置換されたピリミジン類を調製する方法、オーロラキナーゼ阻害剤の調製におけるその使用、治療方法が記載されている。特許文献１には、ＡｕｒｋＢの発現を調節するための組成物および方法が記載され、低分子干渉ヌクレオチドを含む、化学的に修飾されたヌクレオチドを用いることが含まれる。化学的に修飾されたヌクレオチドの使用は、望ましくない副作用の潜在的なリスクを有する。

上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、またはヒトではＨＥＲ１としても知られている）は、タンパク質チロシンキナーゼである。ＥＧＦＲの活性化は、核への増殖シグナルの伝達をもたらし、転写因子の活性化を介して、増殖の増加、移動の増加、接着の増加、血管新生の増加、プログラムされた細胞死経路の阻害をもたらす（Ｂｕｎｄｙ，Ｌ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｓ．，Ｓｅａｌｙ，Ｌ．“Ｃ／ＥＢＰｂｅｔａ−２ ｃｏｎｆｅｒｓ ＥＧＦ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ａｃｉｎａｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．２００５；４：４３）。ＥＧＦＲは、多数の癌、例えば、頭部および頸部の扁平上皮癌腫（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＮＳＣＣ）、非小細胞肺癌腫（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、胃癌、表皮癌および皮膚癌において過剰発現している。ＥＧＦＲは、多くの非常に侵襲的な腫瘍において構造的に発現し（Ｒｕｓｃｈ Ｖ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ｊ，Ｄｍｉｔｒｏｖｓｋｙ Ｅ．“Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．”Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １９９６；７：１３３−４１；Ｓａｌｏｍｏｎ ＤＳ，Ｂｒａｎｄｔ Ｒ，Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ Ｆ，Ｎｏｒｍａｎｎｏ Ｎ．“Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．”Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９５；１９：１８３−２３２）、ＥＧＦＲの過剰発現を示している腫瘍は、多くの場合、化学療法薬に耐性であることが分かっている（Ｊａｍｅｓ Ｈ．Ｄｏｒｏｓｈｏｗ“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＥＧＦＲ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００５；３５３（２）：２００−２００２）。

セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍｂ）、エルボリチン（ｅｒｂｏｌｉｔｉｎ）などのＥＧＦＲ阻害剤が知られている。ＥＧＦＲ阻害剤の殺腫瘍作用を強化するために、治療処置には、多くの場合、シスプラチン、フォールドフォックス（ｆｏｌｄｆｏｘ）などの細胞毒性化学療法薬の使用が含まれる。しかしながら、無作為化された臨床試験では、細胞毒性の化学療法と併用した場合のＥＧＦＲ阻害剤は、標準的な化学療法だけと比較して、利点を示さなかった（Ｓｕｉ Ｇ．，Ｓｏｏｈｏｏ Ｃ，ｅｌ Ａｆｆａｒ Ｂ．，Ｇａｙ
Ｆ．，Ｓｈｉ Ｙ．，Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ Ｗ．Ｃ．＆Ｓｈｉ Ｙ．Ａ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９，５５１５−５５２０）。したがって、さらに、改善されたＥＧＦＲ阻害剤も必要である。

化学的に合成された短い核酸分子、例えばｓｉＮＡは、特異的および効果的に、相同性特異的な転写後の遺伝子サイレンシングを指向させることができ、したがって、非常に効果的であり、選択的であり、強力な治療薬として用いることができ、その副作用は最小である。ＡｕｒｋＢを特異的に阻害する分子は、細胞分裂のメカニズムをブロックすることができ、それゆえ併用療法において非常に有用である。同様に、ｓｉＮＡを用いて、ＥＧＦＲ発現をブロックすることができる。

本発明は、非常に安定であり、ＡｕｒｋＢおよび／またはＥＧＦＲに特異的である、いずれの化学的修飾も伴わない強力な短い核酸分子を提供し、単独の治療として、または癌に対する他の治療と併用して有用である。

米国特許出願公開第２００５/０２６７０６５号明細書

Ｓａｓａｉ Ｋ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｈ，Ｓｔｅｎｏｉｅｎ ＤＬ，Ｆｕｊｉｉ Ｓ，Ｈｏｎｄａ Ｒ，Ｋｉｍｕｒａ Ｍら，Ａｕｒｏｒａ−Ｃ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｃａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｕｒｏｒａ−Ｂ ｋｉｎａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，２００４；５９：２４９−２６３ Ｈｉｒｏｔａ Ｔ，Ｋｕｎｉｔｏｋｕ Ｎ，Ｓａｓａｙａｍａ Ｔ，Ｍａｒｕｍｏｔｏ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｄ，Ｎｉｔｔａ Ｍ．Ａｕｒｏｒａ−Ａ ａｎｄ ａｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔｈｅ ＬＩＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｊｕｂａ，Ａｒｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｍｉｔｏｔｉｃ Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ ２００３；１１４：５８５−５９８ Ｄｕｔｅｒｔｒｅ Ｓ，Ｃａｚａｌｅｓ Ｍ，Ｑｕａｒａｎｔａ Ｍ，Ｆｒｏｍｅｎｔ，Ｃ，Ｔｒａｂｕｔ，Ｖ，Ｄｏｚｉｅｒ，Ｃ．ら Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＣ２５Ｂ ｂｙ Ａｕｒｏｒａ−Ａ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇ２−Ｍ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．２００４；１１７：２５２３−２５３１ Ｃａｒｍｅｎａ Ｍ．およびＥａｒｎｓｈａｗ ＷＣ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ａｕｒｏｒａ Ｋｉｎａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３；４：８４２−８５４

発明の要旨
本発明は、ＡｕｒｋＢの遺伝子発現を調節するための短い核酸分子を提供する。関連する態様では、本発明は、子宮頸癌、前立腺癌、乳癌、肺癌および口腔癌を含む癌を治療するためのＡｕｒｋＢを標的にする短い核酸分子を提供する。このような分子は、単独で、または癌の管理および治療のための他の治療を併用して用いられてもよい。一態様では、ＡｕｒｋＢを標的にする短い核酸分子は、ＥＧＦＲを標的にする短い核酸分子と組み合わせて提供される。他の態様では、本発明の短い核酸は、脂質、ポリマーおよびモノクローナル抗体などの結合体と組み合わせられてもよい。

本発明は、特異的に標的化される短い核酸分子を含む。いくつかの態様では、この短い核酸分子はＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡが含まれる。また、本発明は、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの阻害、癌の関連治療に対して好都合に安定であり、および／または強力な核酸分子を含む。

いくつかの態様では、本発明は、１９〜３０ヌクレオチド、２５〜２９ヌクレオチド、または２７ヌクレオチドを有するｓｉＮＡを提供し、この場合、その配列は、ＡｕｒｋＢ遺伝子発現のノックダウン（即ち、低下）におけるさらに良好な安定性および有効性のために設計されている。このようなｓｉＮＡは、単独でまたは他の治療と併用して用いることができる。本発明は、コレステロールと結合させるかまたは結合させないで、ｓｉＮＡの安定な組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、ＡｕｒｋＢ遺伝子発現の調節において、２７ｍｅｒの短い干渉性核酸分子の化合物、組成物および使用を包含する。本発明の化合物は、単独でまたは他の処置もしくは治療と組み合わせて、癌の治療に有用である。

一態様では、また、本発明の短い核酸分子は、短い干渉性核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（μＲＮＡ）、および／または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。短い核酸分子は、未修飾であるかまたは化学的に修飾されてもよい。いくつかの態様では、本発明は、２７ヌクレオチドを有する短い干渉性ＲＮＡに関する。

一態様では、本発明の核酸分子は、１９〜３０ヌクレオチド、２５〜２９ヌクレオチド、または２７ヌクレオチドを有する。一態様では、本発明の核酸分子は、ＡｕｒｋＢ核酸配列を有するＲＮＡに相補的な１９〜３０ヌクレオチドを含む。

本発明のヌクレオチドは、化学的に合成されるか、ベクターから発現されるか、または酵素的に合成されてもよい。

一態様では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡを含み、ここで、このＲＮＡの１つの鎖は、ＡｕｒｋＢのＲＮＡに相補的である。別の態様では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡを含み、ここで、このＲＮＡの１つの鎖は、ＡｕｒｋＢ配列を有するＲＮＡの配列の一部を含む。

一態様では、本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ−００４２１７に記載されるＡｕｒｋＢを標的にする。しかしながら、本発明は、ＡｕｒｋＢのある変異体を標的にするヌクレオチドに限定されないが、ＡｕｒｋＢの１ヌクレオチド多型、ＡｕｒｋＢ相同体、並びにＡｕｒｋＢスプライスおよび転写変異体を含むＡｕｒｋＢ関連分子を標的にするヌクレオチドも含む。また、本発明は、ＡｕｒｋＢを制御する手段として、ＡｕｒｋＢ制御経路に関与する遺伝子（複数）を標的にするヌクレオチドを意図している。

他の態様では、本発明は、ＡｕｒｋＢを制御するために用いられる組成物および方法を提供する。ＡｕｒｋＢは、直接的にＡｕｒｋＢを標的にする小核酸分子によって、またはＡｕｒｋＢ経路を制御する分子を標的にすることによって制御され得る。ＡｕｒｋＢを標的にする小核酸分子は、単独でまたは他の小核酸分子もしくは小化学分子と組み合わせて用いられてもよい。関連する態様では、ＡｕｒｋＢの標的化を用いて、癌、またはその細胞におけるＡｕｒｋＢの発現レベルの調節に応答する疾患状態を制御する。

いくつかの態様では、長さにして２７ヌクレオチドの化学的に合成されたｓｉＮＡを用いて、単独でまたは種々の癌に関与している遺伝子に指向された他の小核酸分子、例えばＥＧＦＲを併用して、ＡｕｒｋＢの発現レベルを低下させる。いくつかの態様では、表１または２に開示されている小核酸分子は、癌の治療に単独でまたは組み合わせて用いることができる。

さらに関連する態様では、ｓｉＮＡによる癌の制御は、癌の管理および治療に適している。このようにして、本発明は、子宮頸癌、口腔癌、肺癌、皮膚癌および前立腺癌などの癌を治療するための短い核酸分子を提供する。

別の態様では、本発明は、癌のバイオマーカーを用いて、ｓｉＮＡの有効性を検証するための技術を提供する。例えば、本発明は、ＰＣＮＡおよびＫｉ−６７抗原発現などの癌の特異的バイオマーカーを用いる有効性試験を提供する。

一態様では、本発明は、癌の治療として、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲを標的にする小核酸分子の組み合せを提供する。いくつかの態様では、適切な小核酸分子には、表１および２に列挙されたものが含まれる。

一態様では、本発明は、本発明の小核酸分子を含む哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を特徴とする。

本発明は、細胞においてＡｕｒｋＢ活性をダウンレギュレートする方法を特徴とし、オーロラキナーゼ活性のダウンレギュレートに適した条件下で、細胞と本発明の酵素核酸分子もしくはアンチセンス核酸分子、または他の核酸分子とを接触させることを含む。

また、本発明は、ＡｕｒｋＢの上昇に関連した状態を有する被験体の治療方法を特徴とし、この治療に適した条件下で、被験体の細胞と本発明の酵素核酸分子もしくはアンチセンス核酸分子または他の核酸分子とを接触させることを含む。

本発明は、細胞においてオーロラキナーゼ活性をダウンレギュレート（「ノックダウン」とも呼ばれる）する方法を特徴とし、オーロラキナーゼ活性のダウンレギュレートに適した条件下で、細胞と本発明の酵素核酸分子もしくはアンチセンス核酸分子または他の核酸分子とを接触させることを含む。

一態様では、また、本発明は、ＡｕｒｋＢのレベルと関連した状態を有する被験体を治療する方法を特徴とし、この治療に適した条件下で、被験体の細胞と本発明の酵素核酸分子もしくはアンチセンス核酸分子または他の核酸分子とを接触させることを含む。

一態様では、本発明の治療方法は、この治療に適した条件下で、１以上の薬物治療の使用を含む。

また、本発明は、癌、例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、リンパ腫、神経膠腫、または多剤耐性癌を治療する方法を特徴とし、この治療に適した条件下で、本発明の酵素核酸分子もしくはアンチセンス核酸分子または他の核酸分子を被験体に投与することを含む。

別の態様では、本発明によって意図される他の薬物治療には、モノクローナル抗体、化学療法、もしくは放射線療法またはそれらの組み合せが含まれる。

本発明は、医薬として許容される担体中に本発明の酵素核酸分子および／またはアンチセンス核酸分子を含む組成物を特徴とする。

また、本発明は、細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に本発明の核酸を投与する方法を特徴とする。このような細胞は、培養中またはヒトなどの哺乳動物内にあってもよい。この投与方法は、このような投与に適した条件下で、細胞と本発明の酵素核酸分子もしくはアンチセンス分子または他の核酸分子とを接触させることを含む。投与方法は、送達試薬、例えば脂質、陽イオン性脂質、リン脂質、またはリポソームの存在下であってもよい。

下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある種の局面をさらに明示するために含められ、本発明は、本明細書に示された具体的な態様の詳細な説明とともに、これらの図面の１以上を参照することにより、より良く理解され得る。
本発明によれば、例えば以下の組成物などが提供される：
（項目１）
ＡｕｒｋＢ発現を調節する短い核酸分子を含む組成物であって、該短い核酸分子が、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、組成物。
（項目２）
前記短い核酸分子が、
配列番号７のセンス鎖および配列番号８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ１；
配列番号９のセンス鎖および配列番号１０のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２；ならびに
配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３
からなる群から選択される配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
ＥＧＦＲの発現を調節する第２の短い核酸分子をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記第２の短い核酸分子が、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記第２の短い核酸分子が、
配列番号１３のセンス鎖および配列番号１４のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ４；
配列番号１５のセンス鎖および配列番号１６のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ５；ならびに
配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６
からなる群から選択される配列を含む、項目３に記載の組成物。
（項目６）
前記短い核酸分子が、配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３を含み、前記第２の短い核酸分子が、配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６を含む、項目３に記載の組成物。
（項目７）
項目１に記載の組成物、および医薬として許容される担体を含む、癌を治療するための組成物。
（項目８）
脂質、ポリマーおよび／またはモノクローナル抗体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記短い核酸分子がコレステロールに結合している、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
細胞と短い核酸分子とを接触させることを含む、該細胞におけるＡｕｒｋＢ発現を調節するための方法であって、該短い核酸分子が配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目１１）
前記短い核酸分子が、ＡｕｒｋＢの発現を直接調節する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記短い核酸分子が、ＡｕｒｋＢの発現を調節する少なくとも１つの分子に結合する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記短い核酸分子が、ＡｕｒｋＢ発現を阻害する、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記短い核酸分子が、短い干渉性核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（μＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および干渉性ＤＮＡ（ＤＮＡｉ）分子からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記短い核酸分子が、１９〜３０ヌクレオチド、２５〜２９ヌクレオチド、または２７ヌクレオチドである、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記短い核酸分子が、全長ＡｕｒｋＢヌクレオチド配列内の配列に相補的である１９〜３０ヌクレオチドを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記短い核酸分子が、
配列番号７のセンス鎖および配列番号８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ１；
配列番号９のセンス鎖および配列番号１０のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２；ならびに
配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３
からなる群から選択される配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む短い核酸分子を個体に投与することを含む、癌を治療するための方法であって、ここで、該短い核酸分子の投与が該個体の癌細胞におけるＡｕｒｋＢの発現を減少させる、方法。
（項目１９）
第２の短い核酸分子を前記個体に投与することをさらに含み、ここで、該第２の短い核酸分子の投与が該個体の癌細胞におけるＥＧＦＲの発現を減少させる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
脂質、陽イオン性脂質、リン脂質、およびリポソームからなる群から選択される送達因子を提供することをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
モノクローナル抗体、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせを前記個体に施すことをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、リンパ腫、神経膠腫、および多剤耐性癌からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
項目１または３に記載の組成物を個体に投与することを含む、癌を治療するための方法。
（項目２４）
配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む短い核酸分子を個体に投与することを含む増殖性疾患を治療する方法であって、該短い核酸分子の投与が該個体の癌細胞におけるＡｕｒｋＢの発現を減少させる、方法。
（項目２５）
第２の短い核酸分子を前記個体に投与することをさらに含み、ここで、該第２の短い核酸分子の投与が該個体の癌細胞におけるＥＧＦＲの発現を減少させる、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記短い核酸分子が、
配列番号７のセンス鎖および配列番号８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ１；
配列番号９のセンス鎖および配列番号１０のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２；
配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３
からなる群から選択される配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２の短い核酸分子を個体に投与することをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
前記第２の短い核酸分子が、
配列番号１３のセンス鎖および配列番号１４のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ４；
配列番号１５のセンス鎖および配列番号１６のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ５；
配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６
からなる群から選択される配列を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記短い核酸分子が、配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３であり、前記第２の短い核酸分子が、配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
細胞とＡｕｒｋＢの発現を調節する短い核酸分子とを接触させることを含む癌細胞の増殖を阻害するための方法であって、ここで、該短い核酸分子が配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目３１）
前記短い核酸分子が、
配列番号７のセンス鎖および配列番号８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ１；
配列番号９のセンス鎖および配列番号１０のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２；ならびに
配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３
からなる群から選択される配列を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞と第２の短い核酸分子とを接触させることをさらに含み、ここで、該第２の短い核酸分子がＥＧＦＲの発現を調節する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記第２の短い核酸分子が、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記第２の短い核酸分子が、
配列番号１３のセンス鎖および配列番号１４のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ４；
配列番号１５のセンス鎖および配列番号１６のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ５；ならびに
配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６
からなる群から選択される配列を有する、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記短い核酸分子が、配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３であり、前記第２の短い核酸分子が、配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６である、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、前記癌細胞の増殖を減少させ、および／または該癌細胞の壊死を増加させることを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞と第２の短い核酸分子とを接触させることをさらに含み、該第２の短い核酸分子がＥＧＦＲの発現を調節する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
癌細胞と、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む短い核酸分子とを接触させることを含む、該癌細胞をＧ２期に停止させる方法。
（項目３９）
癌細胞と、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む短い核酸分子とを接触させることを含む、該癌細胞の老化を誘導する方法。
（項目４０）
前記細胞と、ＥＧＲＦの発現を調節する第２の短い核酸分子とを接触させることをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
実施例および図面において実質的に本明細書に例証され、上記に請求される、ＡｕｒｋＢ発現を調節する短い核酸分子を含む組成物およびその方法。

ＡＲＰＥ−１９（正常な２倍体の網膜色素上皮細胞、レーン１）、ＨｅＬａ（子宮頸癌、レーン２）、Ａ４３１（類表皮癌、レーン３）、Ａ５４９（非小細胞肺癌、レーン４）およびＰＣ３（前立腺癌細胞、レーン５）におけるＡｕｒｋＢの発現は、ＡｕｒｋＢ（４１ＫＤａ）、および内在性の対照としてチューブリン（５０ＫＤａ）の発現について分析された。 細胞株ＨｅＬａ（子宮頸癌、レーン１）、ＰＣ３（前立腺癌細胞、レーン２）、Ａ５４９（非小細胞肺癌、レーン３）、Ａ４３１（類表皮癌、レーン４）、ＳＣＣ−４（舌の扁平上皮細胞癌腫、レーン５）、ＨＦＦ−２（正常な２倍体の線維芽細胞、レーン６）およびＡＲＰＥ−１９（正常な２倍体の網膜色素上皮細胞、レーン７）におけるＥＧＦＲの発現。ＥＧＦＲ（１７０ＫＤａ）、チューブリン（５０ＫＤａ）。 Ｃｙ３標識したｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞。矢印は、トランスフェクションの１６時間の終りにおける、細胞質内に分布したＣｙ３標識したｓｉＲＮＡを示す。 ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の形態。スケールバー１ｃｍ＝１１μｍ。４Ａ 模擬（ｍｏｃｋ）（ｓｉＲＮＡ７および８）でトランスフェクトされた。矢印は、基質に堅固に接着し、正常に増殖している細胞を指す。４Ｂ ｓｉＲＮＡ ３でトランスフェクトされた細胞。矢印は、基質からの剥離および崩壊前の球形をとっている細胞を指す。 種々の長さのｓｉＲＮＡで処理されたＰＣ３（前立腺癌細胞株）へのＢｒｄＵ取り込み。統計的な有意性（両側ｔ−検定、Ｐ≦０．０５）は、模擬処理された細胞と全てのｓｉＲＮＡで処理された細胞との間、ｓｉＲＮＡ２と３との間、ｓｉＲＮＡ４と５との間、ｓｉＲＮＡ５と６との間、並びにｓｉＲＮＡ４と６との間で見られた。 ｓｉＲＮＡ３によるトランスフェクション後のＡｕｒｋＢ発現の阻害。レーン１．ｓｉＲＮＡ３でトランスフェクトされたＡ５４９細胞株であり、矢印は、ＡｕｒｋＢ、４１ｋＤａタンパク質の微かなバンドを指す。レーン２．模擬処理された試料であり、ＡｕｒｋＢタンパク質は、ｓｉＲＮＡで処理された試料と比較して、僅かに良好な量で検出された。レーン３．レインボー低分子量マーカー。 ｓｉＲＮＡ６によるトランスフェクション後のＥＧＦＲ発現の阻害。レーン１．ｓｉＲＮＡ６でトランスフェクトされたＡ５４９細胞株であり、矢印は、ＥＧＦＲ、１７０ｋＤａタンパク質のバンドがないことを指す。レーン２．模擬処理された試料であり、ＥＧＦＲタンパク質は、ｓｉＲＮＡで処理された試料と比較して、僅かに良好な量で検出された。レーン３．レインボー高分子量マーカー。 種々のｓｉＲＮＡで処理された異なる細胞株の代謝活性。対をなす両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞との間の統計的な有意性が示され、ここではＰ≦０．０５であった。 模擬（Ａ−Ｃ）またはｓｉＲＮＡ３および６（Ｄ−Ｆ）でトランスフェクトされたＰＣ３細胞のコロニー形成アッセイ。 ｓｉＲＮＡ３（１０ｎＭ）、ｓｉＲＮＡ６（１０ｎＭ）および各１０ｎＭと５ｎＭでのｓｉＲＮＡ３とｓｉＲＮＡ６の組み合わせで処理された種々の細胞株のコロニー形成効率。コロニー形成能の有意な阻害（両側ｔ−検定、Ｐ≦０．０５）は、模擬処理された細胞と比較して、ｓｉＲＮＡで処理された細胞の全てにおいて観察された。 ＡｕｒｋＢおよび／またはＥＧＦＲの抑制後のＬＤＨ放出。 ＳＩＲＮＡ３と６との組み合わせを用いてトランスフェクトされたＡ５４９細胞株における、経時的な、スクラッチの周辺からの細胞移動を示すスクラッチアッセイ。Ａ−Ｃ：ｓｉＲＮＡ３と６をトランスフェクトされたＡ５４９細胞株。Ｄ−Ｆ：模擬トランスフェクトされた細胞株。ＡおよびＤ：スクラッチ負荷の０時間。ＢおよびＥ：スクラッチ負荷の８時間。ＣおよびＦ：スクラッチ負荷の２４時間。 スクラッチアッセイによって測定された細胞移動に対するｓｉＲＮＡの効果。 ＭＴＳによって測定された、（ｓｉＲＮＡ３、６または３＆６による）トランスフェクションの日から８日間にわたる類表皮癌細胞株Ａ４３１の増殖率。 ＭＴＳアッセイによって測定されるように、（ｓｉＲＮＡ３、６または３＆６による）トランスフェクションの日から８日間にわたる前立腺癌細胞株ＰＣ３の増殖率を模擬処理された細胞の増殖率と比較した。 ＭＴＳアッセイによって測定された、模擬処理された細胞の増殖率と比較した、（ｓｉＲＮＡ３、６または３＆６による）トランスフェクションの日から８日間にわたる非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９の増殖率。 ＭＴＳアッセイによって測定されるように、トランスフェクションの日から８日間にわたる正常な２倍体の網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ−１９の増殖率を模擬処理された細胞の増殖率と比較した。 ３７℃、４８時間のインキュベーション後のｓｉＲＮＡ３の血清安定性は、２．５％アガロースゲル電気泳動上で血清−ｓｉＲＮＡ混合物を分離し、その後のゲルのエチジウム・ブロマイド染色によって導き出された。ｓｉＲＮＡ３単独、アンチセンス鎖で３’−コレステロールと結合したｓｉＲＮＡ３、センス鎖で３’−コレステロールと結合したｓｉＲＮＡ３。レーン１＆９．それぞれ０および４８時間のｓｉＲＮＡ３単独。レーン２＆１０．それぞれ０および４８時間のハイパーフェクト（Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ）トランスフェクション試薬と複合体化したｓｉＲＮＡ３。レーン３＆１１．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含むｓｉＲＮＡ３アンチセンス鎖。レーン４＆１２．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含み、ハイパーフェクト・トランスフェクション試薬と複合体化されたｓｉＲＮＡ３アンチセンス鎖。レーン５＆１３．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含むｓｉＲＮＡ３センス鎖。レーン６＆１４．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含み、ハイパーフェクト・トランスフェクション試薬と複合体化されたｓｉＲＮＡ３センス鎖。矢印は、３７℃で４８時間、１００％血清とともにインキュベーション後でさえも残っているｓｉＲＮＡ３を指す。 ３７℃、４８時間のインキュベーション後のｓｉＲＮＡ６の血清安定性は、２．５％アガロースゲル電気泳動上で血清−ｓｉＲＮＡ混合物を分離し、その後のゲルのエチジウム・ブロマイド染色によって導き出された。ｓｉＲＮＡ６単独、アンチセンス鎖で３’−コレステロールと結合したｓｉＲＮＡ６、センス鎖で３’−コレステロールと結合したｓｉＲＮＡ６。レーン１＆９．それぞれ０および４８時間のｓｉＲＮＡ６単独。レーン２＆１０．それぞれ０および４８時間のハイパーフェクト・トランスフェクション試薬と複合体化したｓｉＲＮＡ６。レーン３＆１１．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含むｓｉＲＮＡ６アンチセンス鎖。レーン４＆１２．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含み、ハイパーフェクト・トランスフェクション試薬と複合体化されたｓｉＲＮＡ６アンチセンス鎖。レーン５＆１３．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含むｓｉＲＮＡ６センス鎖。レーン６＆１４．それぞれ０および４８時間のコレステロールを含み、ハイパーフェクト・トランスフェクション試薬と複合体化されたｓｉＲＮＡ６アンチセンス鎖。矢印は、３７℃で４８時間、１００％血清とともにインキュベーション後でさえも残っているｓｉＲＮＡ６を指す。 マイクロアレイ分析を用いた前立腺癌細胞ＰＣ３におけるｓｉＲＮＡ３によるＡｕｒｋＢの抑制の効果。マイクロアレイ分析は、図に示されるようにアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた合計で８２９個の遺伝子を同定している。 マイクロアレイ分析を用いた前立腺癌細胞ＰＣ３におけるｓｉＲＮＡ６によるＥＧＦＲの抑制の効果。マイクロアレイ分析は、図に示されるようにアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた合計で９３１個の遺伝子を同定している。 マイクロアレイ分析を用いた前立腺癌細胞ＰＣ３におけるｓｉＲＮＡ３および６によるＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの同時抑制の効果。マイクロアレイ分析は、図に示されるようにアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた合計で２４９個の遺伝子を同定している。 腫瘍内送達によるｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処置された、異種移植された前立腺癌の雄性ＳＣＩＤマウス。 腫瘍のウェスタンブロット。Ｒ１は、ｓｉＲＮＡ３および６の組み合せで処置された動物１を表し、Ｒ２は、ｓｉＲＮＡ３で処置された動物番号２を表す。Ｐは、プラセボ処置された動物を表す。Ｍは、分子量マーカーを表す。矢印は、４１ＫＤａのＡｕｒｋＢおよび５０ＫＤａのチューブリンを指す。 ｓｉＲＮＡ３（グループＡ、ｎ＝６）、ｓｉＲＮＡ６（グループＢ、ｎ＝６）ｓｉＲＮＡ３と６との組み合せ（グループＣ、ｎ＝５）およびプラセボ（グループＤ、ｎ＝７）で処置された、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウスの腫瘍体積。図では、平均の腫瘍体積は、それらの標準偏差とともに表されている。示された全てのデータは、分散の相同性を用いたＦ因子を測定し、その後、対にした両側ｔ−検定によって、統計学的に検証され、ここではＰ≦０．０５であった。バーは、平均のＳ．Ｅ．を表す。 ｓｉＲＮＡ３とｓｉＲＮＡ６の組み合せ（グループＣ）およびプラセボ（グループＤ）で処置された、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウス。矢印は、動物Ｃ８およびＣ７において、処置開始から３５日後の前立腺腫瘍の完全な退縮を示したが、プラセボで処置された動物Ｄ１０は、異種移植された腫瘍の存在を示していた。 ｓｉＲＮＡ６（グループＢ、動物２６）、ｓｉＲＮＡ３と６との組み合せ（グループＣ、動物６）およびプラセボ（グループＤ、動物１０）で処置された、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウスは、３５日の処置後に回収された。矢印は、回収された腫瘍組織を表す。 ｓｉＲＮＡ３（グループＡ）およびプラセボ（グループＤ）で処置された、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウス。矢印は、処置開始から３５日後の前立腺腫瘍の血管新生を指す。 ｓｉＲＮＡ３およびプラセボで処置された、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウス。処置の３５日の終わりで、腫瘍を回収し、肉眼的な病理学について比較した。「Ｄ」は、プラセボで処置された動物３２を表す。「Ａ」は、ｓｉＲＮＡ３で処置された動物番号２８を表す。 プラセボで処置された、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウス。矢印は、処置開始から３５日後の前立腺腫瘍の血管新生を指す。 ｓｉＲＮＡ３で処置された、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウス。矢印は、処置開始から３５日後に前立腺腫瘍の血管新生がないことを指す。 ｓｉＲＮＡ６（レーン１）または模擬（レーン２）を用いたトランスフェクションの７２時間後の乳癌細胞株ＳＫＢＲ３におけるＥＧＦＲ発現（１７０ｋＤａ）のウェスタンブロット。内因性の対照であるチューブリン（５０ｋＤａ）。レーンＭ：レインボー高分子量マーカー。 ｓｉＲＮＡ６（レーン１）または模擬（レーン２）を用いたトランスフェクションの７２時間後の乳癌細胞株ＭＣＦ−７におけるＥＧＦＲ発現（１７０ｋＤａ）のウェスタンブロット。内因性の対照であるチューブリン（５０ｋＤａ）。レーンＭ：レインボー高分子量マーカー。 ｓｉＲＮＡ３（レーン１）または模擬（レーン２）を用いたトランスフェクションの７２時間後の乳癌細胞株ＭＣＦ−７におけるＡｕｒｋＢ発現のウェスタンブロット。 ｓｉＲＮＡ３（１０ｎＭ）、ｓｉＲＮＡ６（１０ｎＭ）、各濃度が１０ｎＭのｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処理された乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびＨＣＣ−３８のＭＴＳアッセイによって測定された代謝活性。１０ｎＭのｓｉＲＮＡ７を模擬対照として与えた。統計的な有意性は、対にした両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞との間で測定され、ここではＰ≦０．０５であった。 ｓｉＲＮＡ（３、６または３＆６の組み合せ）で処理された乳癌細胞株（ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびＨＣＣ−３８）へのＢｒｄＵ取り込み。１０ｎＭのｓｉＲＮＡ７を模擬対照として与えた。 模擬処理と比較した、ｓｉＲＮＡ３および／またはｓｉＲＮＡ６で処理された乳癌細胞によるＬＤＨ放出。１０ｍＭのｓｉＲＮＡ７を模擬対照として与えた。 模擬と比較した、ｓｉＲＮＡ３（１０ｎＭ）、ｓｉＲＮＡ６（１０ｎＭ）または１０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処理された乳癌細胞株のコロニー形成効率。１０ｎＭのｓｉＲＮＡ７を模擬対照として与えた。 ｓｉＲＮＡ３（ＡｕｒｋＢに対する）または模擬ｓｉＲＮＡ７でトランスフェクトされたＨｅＬａ子宮頸癌細胞の細胞周期分析。Ａ：ｓｉＲＮＡ３（ＡｕｒｋＢに対する）でトランスフェクトされた細胞−７７％がＧ２期にあり、６％がＳ期にあり、１６％がＧ１期にあった。Ｂ：模擬ｓｉＲＮＡ７でトランスフェクトされた細胞−１７％がＧ２期にあり、３６％がＳ期にあり、４６％がＧ１期にあった。 ＨｅＬａ子宮頸癌細胞は、ｓｉＲＮＡ３とｓｉＲＮＡ６を同時にトランスフェクトされ、トランスフェクションの７２時間後に老化誘導に関して染色された。細胞のβ−グリコシダーゼ活性の検出（染色を介する）は、老化経路の活性化に対応した。矢印は、青色になった細胞の一例を指し、β−グリコシダーゼ活性を示している。画像は、倍率２００×を示す。

発明の詳細な説明
定義：
用語「短い核酸分子」とは、遺伝子発現を調節することができる任意の核酸分子を指す。用語「短い干渉性核酸」、「ｓｉＮＡ」または「ｓｉＮＡ分子、「短い干渉性核酸分子」、「短い干渉オリゴヌクレオチド分子」とは、遺伝子発現を阻害するかまたはダウンレギュレートすることができる任意の核酸分子を指す。

典型的には、短い干渉性核酸分子は、主にＲＮＡから構成され、「短い干渉性ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる場合がある。しかしながら、ｓｉＮＡには、ＲＮＡ以外にヌクレオチド、例えばＤＮＡｉ（干渉性ＤＮＡ）、または他の修飾された塩基が含まれる。このようにして、用語「ＲＮＡ」とは、本明細書中で使用するとき、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味し、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、部分的に精製されたか、純粋であるかまたは合成されたＲＮＡ、組換え的に生成されたＲＮＡ、並びに変性されたＲＮＡ、例えば類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体が含まれる。

用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」とは、１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットもしくはペプチドをコードしている遺伝子の発現またはＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、あるいは１以上のタンパク質サブユニットまたはペプチドの活性が、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされ、その結果、この発現、レベル、または活性が調節因子のない場合に観察されるよりも大きいかまたは小さいことを意味する。用語「調節する」には、「阻害する」が含まれる。

用語「模擬処理された」とは、ｓｉＲＮＡ７および８が適用された試料を指し、これらは、それぞれ遺伝子ＡｕｒｋＢ、およびＥＧＦＲについてスクランブルされたｓｉＲＮＡである。配列のスクランブリングのため、これらのｓｉＲＮＡは、対象とするいずれの遺伝子も標的にしない。模擬処理は、本明細書では、標準的な陰性対照である。

用語「遺伝子」とは、本明細書中で使用するとき、ＲＮＡ配列をコードする核酸を意味し、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に限定されない。

用語「ＡｕｒｋＢ」とは、本明細書中で使用するとき、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ ００４２１７によってコードされたような、オーロラキナーゼまたはＡｕｒｋＢファミリー活性を有する任意のＡｕｒｋＢタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す：それは、アイソフォーム、変異体遺伝子、スプライス変異体および多型を有するＡｕｒｋＢタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする任意の核酸配列を指す。

用語「標的核酸」とは、本明細書中で使用するとき、その発現または活性が調節されるべき任意の核酸配列を意味する。この標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。

用語「センス領域」とは、本明細書中で使用するとき、標的核酸配列に相補性を有する小核酸分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、小核酸分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。

用語「アンチセンス領域」とは、本明細書中で使用するとき、標的核酸配列に相補性を有する小核酸分子のヌクレオチド配列を意味する。また、それは、小核酸分子のセンス領域に相補性を有する核酸配列を含むことができる。

用語「相補性」または「相補的」とは、本明細書中で使用するとき、ある核酸が別の核酸分子と水素結合を形成し得ることを意味する。

用語「癌」または「増殖疾患」とは、本明細書中で使用するとき、当該技術分野において知られている制御されていない細胞増殖または複製によって特徴付けられる任意の疾患、状態、特性、遺伝子型または表現型を意味する。それには、細胞または組織における疾患に関連したＡｕｒｋＢ遺伝子発現の調節に、単独であるかまたは他の治療を併用して応答可能な全てのタイプの癌、腫瘍、リンパ腫、癌腫が含まれ得る。

ｓｉＮＡ設計および試験
一態様では、本発明は、短い干渉性核酸（ｓｉＮＡ）分子、ＡｕｒｋＢ遺伝子発現の調節におけるそれらの使用を提供する。実施される試験の主な特徴は、下記の通りである：１．ｓｉＮＡの設計
２．ｓｉＮＡの調製
３．化合物の効力試験
４．２１、２２、および２７ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡの比較データ
５．動物モデルでの有効性評価。

適切なｓｉＮＡの設計は、化学的に修飾しないで、ＡｕｒｋＢを調節するための２１、２３、および２７ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡの設計を含んだ。ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ標的遺伝子は、接近可能な部位についてスクリーニングされ、ｓｉＲＮＡは、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）配列を考慮して合成された。下記の一般的な要件は、ｓｉＮＡ設計において考慮された：
ｉ．１列でＡ、Ｔ、Ｇ、またはＵが４個以上連続しない
ｉｉ．下記の配列は、インターフェロン応答を誘導し得るため、避けた。Ａ）５’−ＵＧＵＧＵ−３’およびＢ）５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３’
ｉｉｉ．最初の２００塩基は、制御エレメントへの結合を避けるために開始コドンから除外された
ｉｖ．各々のｓｉＮＡ二重鎖は、下記のパラメータを考慮して、ＢＬＡＳＴ検索で行われる非特異的な（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果のサイレンシングを避けるためにインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で検証された：
Ａ．低複雑性フィルタリングは、限定されたかまたはクエリーなしのシークエンサーに帰着するＢＬＡＳＴによる無意味性を避けるために除外された
Ｂ．語長は、最小値アルゴリズムである７文字に設定された
Ｃ．期待される閾値は、短い配列の出現の可能性を避けるために１０００に設定された。

さらに、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲなどの標的遺伝子は、接近可能な部位についてスクリーニングされ、ｓｉＮＡは、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのＯＲＦ配列を考慮して合成された。

化学的に保護されたホスホロアミダイト単量体を用いて、市販されている方法（例えば、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））によって、ｓｉＮＡ合成を行った。得られたオリゴマーは、ＰＡＧＥ、脱塩、またはＩＥ−ＨＰＬＣによって精製された。各ｓｉＮＡの量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析され、収率は、統合された分光光度計によって測定された。

分子の効力試験は、種々の細胞株において行われた。下記の細胞株は、ＡＴＣＣから入手され、ＡＴＣＣの推奨通りに培養された：ＰＣ３（前立腺癌）；ＨｅＬａ（子宮頸癌）およびＳＣＣ−４（口腔癌）；Ａ５４９（非小肺癌）；Ａ４３１（皮膚癌）；ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびＨＣＣ−３８（乳癌）；ＨＦＦ−２（正常な２倍体の線維芽細胞）；およびＡＲＰＥ−１９（正常な２倍体の網膜色素上皮細胞）。

本明細書中の他の箇所で詳述されるように、コンフルエントな単層をｓｉＮＡでトランスフェクトし、インキュベートした。トランスフェクション効率は、Ｃｙ−３標識したｓｉＮＡでトランスフェクションし、トランスフェクションの１６時間後のＣｙ−３標識された細胞をカウントすることによって測定された。また、細胞を、未処理の細胞と比較した形態変化について調べた。

増殖能に対する効果
種々のｓｉＲＮＡの有効性は、様々なパラメータを用いて、癌細胞株の増殖を阻害するそれらの能力を評価することによって試験された。

細胞に対する直接的なアッセイ
ｓｉＲＮＡによって誘導される細胞毒性は、細胞壊死により培地中に放出されるＬＤＨの量を分析することによって試験された。

ｓｉＲＮＡの濃度と比較したコロニー形成アッセイによって測定された増殖能。また、ＢｒｄＵが活発に増殖している細胞にのみ取り込まれるため、ＢｒｄＵの取り込みによって増殖能を測定した。７２時間のｓｉＲＮＡのトランスフェクション後、カビオケム（Ｃａｂｉｏｃｈｅｍ）のプロトコールに従って、細胞をＢｒｄＵとともにインキュベートした。取り込まれたＢｒｄＵの量を、模擬処理された細胞と比較して、吸光度値によって推定した。

ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに対する効果
ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞は、リアルタイムの定量的ＰＣＲ分析またはノーザンブロット分析を用いて特異的なｍＲＮＡレベルの低下について分析された。リアルタイムＰＣＲでは、上記のための第１鎖ｃＤＮＡの調製は、キアジェンのキットを用いて行った。ｓｉＲＮＡ、模擬および未処理の試料からの第１鎖のｃＤＮＡは、鋳型として用いられ、ｍＲＮＡ量は、内部対照に対して正規化することによって検出された。ｍＲＮＡレベルの倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）は、Ｋｅｎｎｅｔｈ ＪＬおよびＴｈｏｍａｓ ＤＳ（“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ２^{−ΔΔＣｔ} ｍｅｔｈｏｄ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１；２５：４０２−４０８）のプロトコールによって測定された。

また、ｓｉＲＮＡで処理された癌細胞株の増殖能および転移能は、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）１またはｐＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）のｍＲＮＡのレベルを測定することによって試験された。これらのマーカーは、とりわけ、頭部および頸部癌、口腔癌、および肺癌の増殖および転移の指標である。

タンパク質
ＡｕｒｋＢのタンパク質レベルをウェスタンブロットによって分析した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションはｍＲＮＡレベルの減少をもたらしたが、細胞は、ｍＲＮＡレベルの喪失に対処し得る様々なメカニズムを有する。

また、セントロメアおよび動原体に局在したＡｕｒｋＢの量は、処理された細胞と模擬処理された細胞との間の差異を測定するために試験された。これは、ＡｕｒｋＢの抑制が細胞分裂と干渉するには十分であるかの洞察を与える。

ｓｉＮＡ組成物
本ｓｉＮＡは、追加の因子を伴うかまたは伴わないで用いられてもよい。しかしながら、また、本発明は、ＰＥＩと複合体化されたＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのコレステロール結合ｓｉＮＡを提供する。これらの分子の血清安定性を試験した。また、本発明は、抗ＥＧＦＲのモノクローナル抗体のチオール化されたＦ（ａｂ）２断片に連結したＡｕｒｋＢおよびＥＧＲ１のコレステロール結合ｓｉＮＡを提供する。これらの結合したｓｉＮＡの効果は、それらのインターフェロン応答について評価された。

動物モデル
本発明は、ｓｉＮＡ組成物が、動物モデルにおいて腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を引き起こすことができたことを示す。したがって、本組成物および方法は、癌および増殖疾患の治療に適し、効果的である。

治療
本発明は、ＡｕｒｋＢおよび／またはＥＧＦＲ発現、したがって活性を阻害するための方法および組成物を提供する。このような阻害は、癌および他の増殖疾患の治療および管理に有用である。

下記の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれている。続く実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者によって見出された技術を表し、したがって、その実施のために好ましい様式を構成するように考慮され得ることは当業者に承認されなければならない。しかしながら、当業者は、本開示の観点から、多くの変更が、開示されている特定の態様においてなされ、さらに、本発明の精神および範囲から逸脱せずに同等のまたは類似結果を得られることを承認する。

（実施例１）：ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲを阻害するための２１、２２、２３、および２７ヌクレオチドｓｉＲＮＡの設計
標的部位の同定：
長さにして２１、２３または２７ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、文献（Ｈｅｎｓｃｈｅｌ，Ａ．，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．，Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ＤＥＱＯＲ：ａ ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２：Ｗ１１３−Ｗ１２０；Ｕｉ−Ｔｅｉ Ｋ，Ｎａｉｔｏ Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｆ，Ｈａｒａｇｕｃｈｉ Ｔ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｄ ｃｈｉｃｋ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４；３２（３）：９３６−４８；Ｓｕｉ Ｇ．，Ｓｏｏｈｏｏ Ｃ，ｅｌ Ａｆｆａｒ Ｂ．，Ｇａｙ Ｆ．，Ｓｈｉ Ｙ．，Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ Ｗ．Ｃ．＆Ｓｈｉ Ｙ．Ａ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２；９９：５５１５−５５２０；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ Ｊ，Ｗｅｂｅｒ Ｋ，Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２；２６（２）：１９９−２１３；Ｋｉｍ ＤＨ，Ｂｅｈｌｋｅ ＭＡ，Ｒｏｓｅ ＳＤ，Ｍ−Ｓ ｃｈａｎｇ Ｓ Ｃｈｏｉ，Ｒｏｓｉｉ ＪＪ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｓＲＮＡ ｄｉｃｅｒ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＲＮＡｉ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５；２３（２）：２２２−６；Ｈｏｒｎｕｎｇ Ｖ，Ｇｕｅｎｔｈｎｅｒ−Ｂｉｌｌｅｒ Ｍ，Ｂｏｕｒｑｕｉｎ Ｃ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ−α ｂｙ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＬＲ７．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００５；１１：２６３−２７０；Ｊｕｄｇｅ ＡＤ，Ｓｏｏｄ Ｖ，Ｓｈａｗ ＪＲ，Ｆａｎｇ Ｄ，ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ Ｋ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉＲＮＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５；２３（４）：４５７−６２）に開示されている一般的な方法を用いて設計された。

下記の基本的な要件は、ｓｉＲＮＡを設計する場合に満たされた：
２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡの設計に関して：
１．ＧＣ含量は、３０〜５０％である
２．各ｓｉＲＮＡの３’はｄＴｄＴの突出を有する。

２２および２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡの設計に関して：
１．全てのｓｉＲＮＡはＧまたはＣにより５’−で開始する
２．各ｓｉＲＮＡ鎖の３’はｄＴｄＴの突出を有する
３．二重鎖のＧＣ含量は、４０〜５０％である
４．アンチセンス鎖の５’−末端鎖の最初の７塩基において少なくとも５Ａ／Ｕ塩基。

２７ヌクレオチドｓｉＲＮＡの設計に関して
１．二重鎖のＧＣ含量は、４０〜５５％である
２．センス鎖は２５ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’−末端で２ヌクレオチドの突出をもたらす２７ヌクレオチドである。
３．３’−センス鎖の最後の２ヌクレオチドはリボ糖骨格の代わりにデオキシ糖を含む。４．センス鎖の５’−は突出を含み、３’−は平滑末端である。

標的部位：
ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ遺伝子の配列は、オンラインで利用可能である様々なアルゴリズムを用いて、上述した基準を満たす接近可能な部位についてスクリーニングされ、この分析は手作業検査で補充された。これらの基準に基づいて、下記の部位がＡｕｒｋＢに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１〜３）およびＥＧＦＲに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ４〜６）について考慮された。具体的には、ｓｉＲＮＡ１〜６（下記の表２に示される）は、下記の表１に示されるように、ＯＲＦにおける標的配列に基づいて生じさせた。

表１：ｓｉＲＮＡが合成されたＡｕｒｋＢ（ｓｉＲＮＡ１〜３）およびＥＧＦＲ（ｓｉＲＮＡ４〜６）の標的ＯＲＦ配列

（実施例２）：ｓｉＲＮＡ分子の調製
ｓｉＲＮＡ分子は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ベックマン（Ｂｅｃｋｍｅｎ）などの様々な会社から市販されている機械類を用いて化学的手段により合成された。これらは、下記の標準的な化学的方法のいずれかによって合成されるか、またはキアジェンから入手可能であった。化学的方法は、リボース糖の２’−炭素位置で取り込まれる保護基のタイプに基づいて分類された−
１．２^１−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）
２．２^１−Ｏ−トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）
３．２^１−アセトキシエトキシ化学（ＡＣＥ）
オリゴヌクレオチドの化学合成は、当該技術分野において周知であり、さらには詳述しない。

精製：
ｓｉＲＮＡは、脱塩、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）またはＩＥ−ＨＰＬＣ（イオン交換−高速液体クロマトグラフィー）によって精製された。各ＲＮＡ鎖の品質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析され、収率は、統合された分光光度計を用いて２６０ｎｍの吸光度で測定された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる品質管理中に、４原子質量単位の差異は、理論的に予測されるものからの許容される最大の差異であった。２６０ｎｍでの吸光度によって測定される各鎖に対して同程度の収率を得た後、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングし、次に、真空で凍結乾燥させた。実験時に、凍結乾燥した粉末は、ＲＮＡ懸濁バッファー（１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中に懸濁させ、１分間、９０℃で加熱し、凍結乾燥した粉末を溶解するために３７℃で１時間インキュベートされた。これらの製造プロトコールに従って、種々の３’−末端修飾および長さを有する下記のｓｉＲＮＡを合成した（表２）。

表２：ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ遺伝子のために合成されたｓｉＲＮＡおよびそれらの末端修飾

^＊ｓｉＲＮＡ７および８は、それぞれ、遺伝子ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲに対してスクランブルされたｓｉＲＮＡである。これは、これらのｓｉＲＮＡが対象とするいずれの遺伝子も標的にしないことを意味する。これらは、陰性対照として用いられ、常に、模擬処理される実験において参照された。

（実施例３）：種々の癌細胞株におけるＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの発現分析
定量的リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析
種々の癌細胞株におけるＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのｍＲＮＡレベルを正常な２倍体の細胞のものと比較した。遺伝子の発現レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲによって比較された。この試験で用いられた細胞株には、ＰＣ３（前立腺癌）、Ａ５４９（非小細胞肺癌）、Ａ４３１（類表皮癌）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＳＣＣ−４（舌の扁平上皮細胞癌）が含まれ；正常な細胞の中には、ＨＦＦ−２（正常な２倍体の線維芽細胞）およびＡＲＰＥ−１９（２倍体の網膜色素上皮細胞）が含まれる。リアルタイムＰＣＲ分析用の第１鎖のｃＤＮＡの調製は、小さな変更を含むが、キアジェンのファースト・レーン（Ｆａｓｔ ｌａｎｅ）細胞ｃＤＮＡキット（カタログ番号２１５０１１）を用いて行った。要約すると、２０，０００個の細胞をペレットにし、一回洗浄し、溶解し、ｇＤＮＡワイプアウト（ｗｉｐｅｏｕｔ）バッファー（キアジェン）を添加し、４２．５℃で３０分間インキュベートすることによってゲノムＤＮＡ汚染を取り除いた。第１鎖のｃＤＮＡは、４２．５℃、４５分間、クオンチスクリプト（Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素を添加し、次に、９５℃で３分間インキュベーションすることによって合成された。調製された第１鎖のｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ用に即座に用いられるかまたはさらに使用するまで−２０℃で保存された。

癌細胞（ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＰＣ３およびＡ４３１）は、コンフルエントの６０〜７０％で維持された。回収の２４時間前に新鮮な培地を添加した。第１鎖のｃＤＮＡは、ファースト・レーン細胞ｃＤＮＡキット（キアジェン）のプロトコールに従って、上述されるように実験細胞から調製された。アンチセンス、模擬および未処理の試料からの第１鎖のｃＤＮＡは鋳型として用いられ、内部対照のβ−アクチンに対して正規化することによってｍＲＮＡレベルを定量した。

ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの発現は、正常な２倍体の癌細胞と比較して数倍変化した。前立腺癌細胞株ＰＣ３を除いて、表３に示されるように、この試験で試験された他の全ての癌細胞株は、対照細胞より、多くのＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ両方のｍＲＮＡを発現させた。

表３．２倍体の細胞と比較した癌細胞におけるＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのｍＲＮＡの相対的な発現

ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのウェスタンブロット分析
細胞を回収する２４時間前に培地を交換して、細胞を６０〜７０％のコンフルエントになるまで増殖させた。タンパク質の溶解物は、製造業者のプロトコールに従って、哺乳動物のタンパク質抽出試薬（ＭＰＥＲ、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））を用いて作製した。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の総タンパク質の推定に基づいて、ＡｕｒｋＢについては１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ＥＧＦＲについては１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で等量のタンパク質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離されたタンパク質は、予め染色されたレインボー分子量マーカー（カタログ番号ＲＰＮ７５５、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））とともに、プレウェットのニトロセルロースメンブレン上に１１０Ｖ、７０分間でウェスタンブロット転写に供された。エレクトロ・ブロッティングによるタンパク質の転写は、ポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓ染色（シグマ（Ｓｉｇｍａ））によって確認された。振動台上で、室温で１時間、このブロットをブロッキング溶液（５％スキムミルク粉末）中でインキュベートした。ウサギ抗ＡｕｒｋＢ（カタログ番号Ａ５１０２、シグマ）、内部対照としてのマウスアルファチューブリン抗体（カタログ番号Ｔ６１９９、シグマ）とともにインキュベートする前に、このブロットは、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）に交換して、各々５分で３回、オービタル（ｏｒｂｉｔａｌ）シェーカー上で洗浄された。次に、ブロットを一次抗体とともに一晩、４℃でインキュベートし、その後、上述のようにＰＢＳＴで洗浄し、あらゆる非特異的に結合した一次抗体を取り除いた。ＰＢＳＴで洗浄後、アルカリホスファターゼを結合させた二次抗体とともに、オービタルシェーカー上で２時間、室温でこのブロットをインキュベートした。これらの二次抗体には、チューブリンを検出するためのアルカリホスファターゼを結合されたウサギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ３４３８、シグマ）が含まれ、ヤギ抗ウサギ抗体（カタログ番号１１１−０５５−００３、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ））は、ＡｕｒｋＢ抗体を検出するために用いられた。ブロットをそれぞれＰＢＳＴで各々１０分間、３回洗浄し、その後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（カタログ番号Ｂ６４０４、シグマ）を用いて発色させた。ＡｕｒｋＢ（４１ＫＤａ）、ＥＧＦＲ（１７０ＫＤａ）および内因性の対照としてのチューブリン（５０ＫＤａ）に対応するタンパク質バンドが、図１および２に示されるように検出された。

図１では、細胞株ＡＲＰＥ−１９（正常な２倍体の網膜色素上皮細胞、レーン１）、ＨｅＬａ（子宮頸癌、レーン２）、Ａ４３１（類表皮癌、レーン３）、Ａ５４９（非小細胞肺癌、レーン４）およびＰＣ３（前立腺癌細胞、レーン５）をオーロラキナーゼＢの発現について分析した。それぞれの細胞株からの粗タンパク質溶解物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースメンブレン上にブロットした。転写されたタンパク質含むメンブレンは、ヤギ抗ウサギ抗体ＡＬＰ結合のＡＬＰを結合したヤギ抗マウス抗体によって検出されるウサギ抗オーロラキナーゼＢ抗体とマウス抗アルファチューブリンモノクローナル抗体で探査された。ブロット中の４１ＫＤａは、ＡｕｒｋＢを表し、５０ＫＤａは、内因性の対照としてのチューブリンを表す。ＡｕｒｋＢは、全ての細胞に発現している。

図２では、細胞株ＨｅＬａ（子宮頸癌、レーン１）、ＰＣ３（前立腺癌細胞、レーン２）、Ａ５４９（非小細胞肺癌、レーン３）、Ａ４３１（類表皮癌、レーン４）、ＳＣＣ−４（舌の扁平上皮細胞癌腫、レーン５）、ＨＦＦ−２（正常な２倍体の線維芽細胞、レーン６）およびＡＲＰＥ−１９（正常な２倍体の網膜色素上皮細胞、レーン７）は、上皮細胞増殖因子受容体１（ＥＧＦＲ）の発現について分析された。それぞれの細胞株からの粗タンパク質溶解物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ニトロセルロースメンブレン上にブロットされた。転写されたタンパク質を含むメンブレンは、ヤギ抗ウサギＡＬＰ結合した、およびＡＬＰと結合したヤギ抗マウス抗体によって検出されるウサギ抗ＥＧＦＲ抗体およびマウス抗アルファチューブリンモノクローナル抗体で探査された。ブロットでは、１７０ＫＤａはＥＧＦＲを示し、５０ＫＤａは内因性の対照として検出されたチューブリンを示す。ＥＧＦＲは、全ての細胞に発現されるが、類表皮癌種細胞株Ａ４３１および舌の扁平上皮細胞癌腫ＳＣＣ−４は、より多量に発現した。

（実施例４）：有効性の試験
Ａ．種々の細胞株において：
オリゴヌクレオチドのトランスフェクション／ｓｉＲＮＡトランスフェクション：
ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＳＣＣ−４（口腔癌）、Ａ５４９（非小細胞肺癌）、Ａ４３１（類表皮癌）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＨＦＦ−２（正常な２倍体の線維芽細胞）およびＡＲＰＥ−１９（正常な２倍体の網膜色素上皮細胞）細胞株をＡＴＣＣから入手し、Ｔ−２５フラスコ（カタログ番号１５６３６７、ヌンク（Ｎｕｎｃ））中で、トランスフェクションの２４時間前に培地を交換して、７０〜８０％のコンフルエントで維持された。細胞株は、他に指示がなければ、継代数が１０に到達する前にｓｉＲＮＡの全てのトランスフェクションのために用いられた。トランスフェクション時に、細胞をトリプシン処理し、２４ウェルプレート（カタログ番号１４３９８２、ヌンク）、または任意の他の標準的な組織培養のディスポーザブルプラスチック製品に適切な細胞密度で再度播種した。実験のために、他に記載がなければ、全てのトランスフェクションは、所定の実験に用いられる細胞株に依存して細胞密度を変化させて、２４ウェルプレート中で行った。２４ウェルプレートの各ウェルは、４００μＬを超えない増殖培地を用いて、トランスフェクションの１時間前に適切な細胞密度で細胞が播種され、５％ＣＯ_２、３７℃でインキュベートされた。この培地に、希釈したｓｉＲＮＡが最終濃度１０ｎＭ（２０μＭストックから０．３μＬのｓｉＲＮＡを添加した９７μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ）まで添加した。次に、リポソームを形成する陰イオン性および陽イオン性脂質の両方を含むトランスフェクション試薬であるハイパーフェクト（キアジェン）３μＬを添加し、ボルテックスによって混合し、その後、室温で１０分間インキュベートした。ＥＧＲＦおよびＡｕｒｋＢなどのｓｉＲＮＡの組み合わせについては、個々のｓｉＲＮＡを、各々１０ｎＭ混合し、用いた。全ての実験では、ｓｉＲＮＡ７および／またはｓｉＲＮＡ８の模擬対照を用いた。

インキュベーションの終わりに、ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体を十分に混合し、細胞を含む各ウェルに静かに滴下し、混合し、次に、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。トランスフェクション効率は、トランスフェクションの１６時間後に、Ｃｙ３標識されたｓｉＲＮＡを示す細胞数をカウントすることによって各細胞について得られた。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁した。倒立蛍光顕微鏡で細胞を観察し、１５箇所の異なる視野で蛍光細胞の数と細胞の総数をカウントした。Ｃｙ３標識された細胞の割合は、トランスフェクション効率に対応し、ＨｅＬａ細胞の９７％からＡ５４９細胞の７０％の範囲であった。表４および図３（ｓｉＲＮＡ７を用いたトランスフェクションの例を示す）を参照されたい（ｓｉＲＮＡ１〜８は全て類似の結果を与えた）。

表４．種々の細胞に対するＣｙ３標識したｓｉＲＮＡによって測定されたトランスフェクション効率

Ｂ）ｓｉＲＮＡを用いた細胞株のトランスフェクションの際に観察された形態的特徴
トランスフェクションの４８時間後、細胞（Ａ４３１、ＳＣＣ−４、Ａ５４９およびＨｅＬａ）は、未処理の細胞株と比較して、多様な形態的特徴を示した。ｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせは、有意な細胞死および形態変化を引き起こした。有意な細胞死は、ｓｉＲＮＡ６を用いてトランスフェクトされた細胞において認められたが、形態変化はなかった。ｓｉＲＮＡ３を用いて処理された細胞は、図４に示されるように、球形をとり、７２時間のトランスフェクションによって培養プレートから徐々に剥離した。

Ｃ）癌細胞株の増殖阻害において設計された種々のｓｉＲＮＡの有効性の同定
ＰＣ３（前立腺）およびＨｅＬａ（子宮頸部）癌細胞株は、種々のｓｉＲＮＡ（長さが異なる）を単独で、組み合わせてトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり８０００個の密度で細胞を三連で撒いた。７２時間後、キット（カタログ番号ＱＩＡ５８、カルビオケム）の使用説明書に従って、ＢｒｄＵとともに細胞を３時間インキュベートした。ＢｒｄＵの取り込みは、固定試薬の添加によって停止され、細胞を透過性にして、抗ＢｒｄＵ抗体による標識を可能にした。この抗体は、５４０ｎｍの参照フィルターを使用して、４５０ｎｍでの吸光度値によって測定される発色生成物にＨ_２Ｏ_２を変換するセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合されている。吸光度は、模擬処理された細胞と比較して、ｓｉＲＮＡでの処理後にＳ期にある細胞の比率の推定をもたらす。

全ての実験は、三連で行い、それらの平均値および標準偏差が得られた。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡで処理された細胞との間で測定され、ここではＰ≦０．０５であった。ｓｉＲＮＡ３と６を用いたトランスフェクション後のＢｒｄＵの取り込みは、それぞれ、模擬処理された細胞における取り込みの３０および５８％であった。また、ｓｉＲＮＡ１、２、４または５を用いた細胞の処理により、模擬と比較してＢｒｄＵ取り込みを減少させたが、ｓｉＲＮＡ３または６を用いて処理された細胞ほどではなかった（図５）。統計的な有意性は、模擬処理された細胞と全てのｓｉＲＮＡで処理された細胞との間、ｓｉＲＮＡ２と３との間、ｓｉＲＮＡ４と５との間、ｓｉＲＮＡ５と６との間、並びにｓｉＲＮＡ４と６との間に見られた。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ３がｓｉＲＮＡ２よりも強力であり、ｓｉＲＮＡ６がｓｉＲＮＡ４と５よりも強力であることを示している。

Ｄ）リアルタイム定量的ＰＣＲ分析：
理論に拘束されないで、ｓｉＲＮＡを用いた細胞のトランスフェクションは、結果としてＲＮＡｉ経路を活性化させ、そこでは、このｓｉＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解され、それにより、ｍＲＮＡレベルおよびそのｍＲＮＡによってコードされる生じるタンパク質のレベルを低下させると考えられる。ｓｉＲＮＡの有効性は、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のｍＲＮＡレベルを測定することによって決定することができる。定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた種々の細胞株の中でＡｕｒｋＢとＥＧＦＲの両方のｍＲＮＡレベルを測定し、模擬でトランスフェクトされた細胞と比較した（表５）。

表５．リアルタイムＰＣＲによって測定された、種々の癌細胞株のｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後のＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ発現レベルの倍数減少

概して、ｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせは、ｓｉＲＮＡ３または６単独よりもＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ ｍＲＮＡの低下に効果的であった。

Ｅ）ＡｕｒｋＢタンパク質レベルの分析：
ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＰＣ３、Ａ４３１、Ａ５４９およびＨｅＬａ細胞は、トランスフェクションの７２時間後に総タンパク質抽出に供された。ｓｉＲＮＡ処理は、模擬処理された試料と比較して、ＡｕｒｋＢタンパク質発現を９０％も（例えば、図６）およびＥＧＦＲを９５％も（例えば、図７）低下させた。タンパク質発現の減少は、リアルタイムＰＣＲで見られたｍＲＮＡレベルの減少を反映している。

例えば、図６では、肺癌細胞株Ａ５４９をｓｉＲＮＡ３で処理し、７２時間後にＡｕｒｋＢ発現について分析し、模擬処理された細胞と比較した。等量のタンパク質を全てのウェルに入れ、同程度の量の、転写されたタンパク質を確実するために、内因性の対照のタンパク質アルファチューブリン（５０ｋＤａ）もブロットで検出した。レーン１．ｓｉＲＮＡ３でトランスフェクトされたＡ５４９細胞株、ここでは、矢印はオーロラＢ、４１ｋＤａタンパク質の薄いバンドを指している。レーン２．模擬処理された試料、ここでは、オーロラＢタンパク質はｓｉＲＮＡで処理された試料と比較して、かなり良好な量で検出された。レーン３．レインボー低分子量マーカー。

図７は、ｓｉＲＮＡ６を用いたトランスフェクションの７２時間後のＡ５４９細胞のウェスタンブロットを示す。等量のタンパク質を全てのウェルに積層し、同程度の量の、転写されたタンパク質を確実するために、内因性の対照のチューブリン（５０ｋＤａ）もブロットで検出した。レーン１．ｓｉＲＮＡ６でトランスフェクトされたＡ５４９細胞株、ここでは、矢印は、１７０ｋＤａタンパク質であるＥＧＦＲのバンドがないことを指している。レーン２．模擬処理された試料、ここでは、ＥＧＦＲタンパク質は、ｓｉＲＮＡ処理された試料と比較して、かなり良好な量で検出された。レーン３．レインボー高分子量マーカー。

Ｆ）アンチセンスＲＮＡで処理された癌細胞株の増殖能および転移能の測定：
１）細胞増殖効率についてのバイオマーカー分析：Ｋｉ−６７抗原および増殖性細胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）は、癌の増殖および転移のマーカーである。これらの抗原の発現は、不良な臨床予後と相関している。

トランスフェクションの７２時間後、Ｋｉ−６７発現をＥＬＩＳＡによって測定した（Ｓｕｉ Ｇ．，Ｓｏｏｈｏｏ Ｃ，ｅｌ Ａｆｆａｒ Ｂ．，Ｇａｙ Ｆ．，Ｓｈｉ Ｙ．，Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ Ｗ．Ｃ．＆Ｓｈｉ Ｙ．（２００２）Ａ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，５５１５−５５２０）。モノクローナル抗Ｋｉ−６７抗原抗体（Ｓｉｇｍａ）は、一次抗体として用いられ、ヤギ抗マウスＩｇＭ−μ鎖特異的ＨＲＰ結合抗体は、二次抗体として用いられた。吸光度値を４５０ｎｍで得て、それらの平均および標準偏差を模擬処理および未処理の対照と比較した。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた癌細胞は、未処理細胞と比較して、Ｋｉ−６７抗原の発現レベルの減少を示し、未処理細胞の９１．３％から未処理の３９％程度の低さまでの範囲であった（表６）。Ｋｉ−６７のレベル減少は、ＡｕｒｋＢ、ＥＧＦＲ、またはそれらの両方の阻害がトランスフェクトされた細胞の有糸分裂指数を減少することを支持している。

表６．ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＡｕｒｋＢ、ＥＧＦＲまたはそれらの両方の阻害がＫｉ−６７抗原の発現を減少させる。

ＰＣＮＡ ｍＲＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＰＣ３、Ａ４３１、ＳＣＣ−４およびＡ５４９細胞株において測定された（表７）。ｓｉＲＮＡ３による肺癌細胞株Ａ５４９の処理により、ＰＣＮＡレベルが有意に低下した。ｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせは、ＳＣＣ−４細胞において、個別に処理されたｓｉＲＮＡと比較して、ＰＣＮＡレベルの低下において相加効果を示した。模擬処理された試料と比較して、ＰＣＮＡの発現レベルの低下は、これらの細胞株の増殖能が大幅に低下したことを示している。

表７．ＡｕｒｋＢおよび／またはＥＧＦＲに対するｓｉＲＮＡを用いた種々の細胞株のトランスフェクションに対するＰＣＮＡ発現の倍数減少

Ｆ）細胞増殖アッセイ：
ｓｉＲＮＡ３および６は、それらの模擬または未処理試料と比較して、それぞれのｍＲＮＡ、並びにタンパク質レベルを首尾よく低下した。細胞の代謝に対するこのような阻害の影響は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰをそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに還元するトランスフェクトされた細胞の能力を測定することによって決定された。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後、細胞（ＨｅＬａ、Ａ４３１、Ａ５４９およびＰＣ３）をトリプシン処理し、カウントし、９６ウェルプレートでウェル当たり１０００個の細胞の濃度で再度播種した。細胞をさらに４８時間インキュベートして、その後、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の細胞−タイター９６ 水性非放射性アッセイキット（カタログ番号Ｇ５４２１）のプロトコールに従って細胞の代謝状態を測定した。要約すると、１００μＬの増殖培地を９６ウェルプレートから回収し、それに２０μＬの細胞タイター９６水溶液を添加し、４時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。６３０ｎｍの参照フィルターを使用して、プレートを４９０ｎｍで読み取った。三連のものからの吸光度値の平均および標準偏差を測定し、代謝的に活性な細胞の割合または細胞増殖を模擬処理された細胞と比較して推測した。増殖効率は、細胞株、ｓｉＲＮＡの正体、およびｓｉＲＮＡ濃度に依存して変化した。ｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせによるトランスフェクションは、図８に示されるように、代謝活性を大きく低下させた。

図８は、ｓｉＲＮＡ３（１０ｎＭ）、ｓｉＲＮＡ６（１０ｎＭ）およびそれぞれ１０ｎＭと５ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせで処理された種々の細胞株を示す。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞との間で測定され、ここではＰ≦０．０５であった。有意な増殖阻害は、全ての細胞株（ＰＣ３、Ａ５４９、Ａ４３１およびＨｅＬａ）において得られ、そこでは、ＡｕｒｋＢ、ＥＧＦＲまたはその両方が標的にされた。しかしながら、両方のｍＲＮＡが、組み合わせでのｓｉＲＮＡ３と６を使用して同時に阻害された場合には、細胞株のいずれにおいても相加効果はなかった。

Ｅ）コロニー形成アッセイ：
コロニー形成アッセイを用いて、腫瘍を引き起し、成長させるｓｉＲＮＡ処理された細胞の能力を評価した。２４ウェルプレートで細胞（ＨｅＬａ、Ａ４３１、Ａ５４９およびＰＣ３）のトランスフェクションの２４時間後、これらの細胞をトリプシン処理し、カウントし、三連で６ウェルプレート当たり３００個の細胞の濃度で再度播種した。模擬処理および未処理の細胞株の対照も調製した。１０日間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３００μＬの０．１％クリスタルバイオレットで５分間染色し、その後、ＰＢＳで３回洗浄した。これは、トランスフェクトされ、６ウェルプレートで３００細胞／ウェルの密度で、三連で播種された前立腺癌細胞株ＰＣ３を示す図９において容易に見ることができる。図９では、Ａ〜Ｃは、模擬処理された細胞を表し、Ｄ〜Ｆは、ｓｉＲＮＡ３と６で処理された細胞を表す。

少なくとも５０個の細胞を含むコロニーの数を倒立顕微鏡でカウントした。標準偏差は、三連のものから導き出され、コロニー形成阻害の割合は下記の式：
コロニー形成阻害率＝（対照のコロニー形成率−実験のコロニー形成率）／対照のコロニー形成率×１００
を用いて得た。

種々の癌細胞の処理は、用量依存的な様式で１００〜５７％、コロニー形成能力を阻害した。図１０は、ｓｉＲＮＡ３（１０ｎＭ）、ｓｉＲＮＡ６（１０ｎＭ）およびそれぞれ１０ｎＭと５ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせで処理された種々の細胞株のコロニー形成効率を示す。ｓｉＲＮＡ３および６で処理された全ての細胞株は、模擬処理および未処理の細胞株と比較して、コロニーを形成する異なるレベルの阻害を示した。細胞株ＨｅＬａは、ｓｉＲＮＡ３で処理されると、１００％のコロニー形成阻害を示し、これは、ＡｕｒｋＢタンパク質に子宮頸癌が１００％依存していることを示唆している。細胞株ＰＣ３、Ａ５４９およびＡ４３１では、ＡｕｒｋＢ阻害は、模擬処理された細胞と比較して、コロニー形成能力の有意な阻害をもたらした。また、ＥＧＦＲ抑制は、コロニー形成能力の減少をもたらした。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞との間で測定され、ここではＰ≦０．０５であった。コロニー形成能力の有意な阻害は、模擬処理された細胞と比較して、ｓｉＲＮＡで処理された全ての細胞で観察された。しかしながら、模擬処理細胞と未処理細胞との間のコロニー阻害において得られた結果は有意ではなかった。また、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの同時抑制によっても相加効果は観察されなかった。

Ｆ）癌細胞死および／または膜の完全性に対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果
ＬＤＨ放出を用いて、トランスフェクトされた細胞における低下したレベルのＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの細胞毒性を測定した。細胞株（ＰＣ３、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＡＲＰＥ−１９およびＨＦＦ−２）をｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、三連で２４ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。７２時間後、細胞を軽く遠心分離して、死んで浮遊した細胞を取り除き、１００μＬの使用済みの培地を別の９６ウェルプレートに回収し、シグマＬＤＨアッセイキット（カタログ番号ＴＯＸ−７）のプロトコールに従ってＬＤＨを評価した。６９０ｎｍの参照フィルターを使用して、４９０ｎｍでの吸光度値を測定した。平均および標準偏差は、三連のウェルから計算し、未処理の細胞株と比較した。図１１に示されるように、ＬＤＨは、ＡｕｒｋＢおよび／またはＥＧＦＲのｍＲＮＡを阻害した後に放出され、これは、細胞壊死および／または膜の完全性の損傷を指示している。正常な２倍体の細胞株ＡＲＰＥ−１９は、試験された癌細胞と比較して、部分的にしか影響されないままである。Ａ５４９とＡ４３１におけるＡｕｒｋＢの阻害は、模擬処理された細胞と比較して、それぞれ１５０％および６０％のＬＤＨ放出をもたらし、ＰＣ３およびＨｅＬａは、６５％および５２％のＬＤＨ放出を示した。比較すると、ＥＧＦＲの抑制は、模擬処理された試料と比較して、ＰＣ３、Ａ５４９、Ａ４３１およびＨｅＬａ細胞からのそれぞれ１５０％、９０％、４７％および１００％のＬＤＨ放出をもたらした。ＥＧＦＲとＡｕｒｋＢの同時の抑制は、ＬＤＨ放出におけるいずれの相加効果も引き起こさなかった。全てのｓｉＲＮＡ処理された細胞は、ＡｕｒｋＢ阻害後に有意性が見られなかったＡＲＰＥ−１９細胞の場合を除いて、模擬処理された細胞と比較して、統計的に有意な（Ｐ≦０．０５）ＬＤＨ放出を示した。癌細胞と比較して正常な細胞から放出されたＬＤＨの制限された量は、ＡｕｒｋＢまたはＥＧＦＲの喪失に対処する癌細胞の場合において固有の不安定性があることを示している。

Ｇ）アポトーシスに対するＡｕｒｋＢおよび／またはＥＧＦＲ阻害の効果
ｓｉＲＮＡトランスフェクションがアポトーシスを誘導するかどうかを決定するために、トランスフェクトされたＰＣ３、Ａ５４９、Ａ４３１、ＨｅＬａ、ＨＦＦ−２およびＡＲＰＥ−１９細胞においてアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖを調べた。カルビオケムのアネキシンＶ−ＰＥアポトーシス検出キットに従って、細胞をトリプシン処理し、バッファーに懸濁し、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後に種々の時間間隔（８時間、１６時間、２４時間、４８時間および７２時間）でＰＥ標識したアネキシンＶを用いて染色した。アネキシンＶへの結合を示す細胞数を全体で試料当たり１５０個の細胞から記録した。アポトーシス誘導は観察されなかった。

（実施例５）：組み合わせのインビトロ試験
Ａ）癌細胞浸潤アッセイ：
癌細胞の転移する能力は、それらによるマトリックスメタロプロテイナーゼの分泌、およびＥ−カドヘリンの発現によって強められる。細胞株（Ａ５４９およびＰＣ−３）は、三連でのトランスフェクション直後に、３×１０^４細胞／ウェルの密度でコラーゲンＩＶコートされた２４ウェルプレートに播種された。２４ウェルプレートへ播種してから２４時間後、１０μＬのピペットチップを用いて、細胞の単層が確立されたウェルを横切ってスクラッチを与えた。スクラッチされた領域へ移動した細胞の数は、スクラッチの８時間後および２４時間後にカウントされた。これは図１２で見ることができ、このスクラッチアッセイは、肺癌細胞株Ａ５４９の浸潤性を示している。コラーゲン（０．３ｍｇ／ｍＬ）コートされた２４ウェルプレートに３×１０^４／ウェルの密度で細胞を播種した。ｓｉＲＮＡ３および６のトランスフェクションは、各５ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて前記で説明したように三連で行った。トランスフェクションの２４時間後、ピペットチップでスクラッチを与え、増殖培地を添加して、使用済みの培地と交換した。スクラッチした領域（長方形の点の黒色ボックスによって示される）に移動した細胞の数は、スクラッチを与えて８時間後および２４時間後にカウントされた。

Ａ〜Ｃ：ｓｉＲＮＡ３および６でトランスフェクトされたＡ５４９細胞株。Ｄ〜Ｆ：模擬でトランスフェクトされた細胞株。

ＡおよびＤ：スクラッチを与えてから０時間。ＢおよびＥ：スクラッチを与えてから８時間。ＣおよびＦ：スクラッチを与えてから２４時間。

図１３に示されるように、この効果を定量した。細胞株ＰＣ３およびＡ５４９は、２４ウェルプレート中でｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた。２４時間のトランスフェクションの終わりに、１０μＬのピペットチップを用いて、２４ウェルプレートの各ウェルを横切ってスクラッチを作った。ウェルをＰＢＳで１回洗浄し、新鮮な増殖培地を添加し、スクラッチ作製の最中に剥離した細胞および死んだ細胞を除去した。スクラッチを与えてから８時間後、およびスクラッチを与えてから２４時間後に細胞を観察した。スクラッチに移動した細胞数を記録した。細胞株ＰＣ３およびＡ５４９のうち、細胞の移動において、それぞれ６０％および４７％の阻害を示した。２４時間では、ｓｉＲＮＡ３に晒された細胞（ＡｕｒｋＢノックダウン細胞）のほんの４５％および１７％が、それぞれＰＣ３およびＡ５４９細胞の場合に移動した。ｓｉＲＮＡ６に晒された細胞（ＥＧＦＲノックダウン細胞）の場合には、４７％および２３％の細胞が、それぞれＰＣ３およびＡ５４９細胞について移動した。細胞移動は、ｓｉＲＮＡ３および６の両方に晒された場合、即ち、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの両方がそれぞれＰＣ３およびＡ５４９細胞についてノックダウンされた場合に５７％および９％であった。これは、Ａ５４９細胞株の場合にＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの同時ノックダウンによって、細胞移動の阻害に対して相加効果があったことを示している。得られた結果は、対をなす両側ｔ−検定によって、２４時間で、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡで処理された細胞との間に統計的な有意性があることが分かり、ここではＰ≦０．０５であった。

全体で、ｓｉＲＮＡ３のトランスフェクションは、結果としてＰＣ３およびＡ５４９細胞株の移動をそれぞれ７０％および５０％阻害した。ｓｉＲＮＡ６トランスフェクションは、細胞株ＰＣ３およびＡ５４９に対して、それぞれ４０％および７０％の程度まで細胞移動を阻害した。ｓｉＲＮＡ３と６によるトランスフェクションは、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲの両方を阻害し、細胞株Ａ５４９およびＰＣ３について、それぞれ８５％および８０％、スクラッチへの細胞移動を阻害した。

Ｂ）ｓｉＲＮＡで処理された種々の癌細胞株の増殖動力学
癌細胞株および正常な２倍体の細胞株は、２４ウェルプレートでｓｉＲＮＡ３および／または６でトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、細胞をトリプシン処理し、三連で、９６ウェルプレートに１０００細胞／ウェルの密度で播種した。４８時間後、代謝的に活性である細胞の数は、トランスフェクション後の８日まで、２４時間ごとに、プロメガの細胞−タイター９６水溶液キットを用いて測定された。２４時間ごとに存在している細胞の数を測定し、したがって、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の増殖率は、細胞の代謝状態を示すＭＴＳアッセイによるものであった。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって測定され、ここではＰ≦０．０５であった。結果を図１４〜１７に要約する。

図１４は、ＭＴＳによって測定した、（ｓｉＲＮＡ３、６または３と６による）トランスフェクションの日から８日間にわたる類表皮癌腫細胞株Ａ４３１の増殖率を示す。統計的に有意なデータは、下記について得られた：第３および４日−ｓｉＲＮＡ（３、６および３と６）で処理された試料と模擬処理された試料との間。さらに、ｓｉＲＮＡ３、ｓｉＲＮＡ６およびｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処理された細胞の間。第５、６、７および８日−ｓｉＲＮＡ（３および３と６）で処理された試料と模擬処理された試料との間。さらに、ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処理された細胞の間。ＡｕｒｋＢとＥＧＦＲの両方の阻害が、最も低い増殖率を示した。

図１５は、模擬処理された細胞と比較した、（ｓｉＲＮＡ３、６または３と６による）トランスフェクションの日から８日間にわたる前立腺癌細胞株ＰＣ３の増殖率パーセントを示す。統計的に有意なデータは、下記について得られた：第３日−ｓｉＲＮＡ３で処理された細胞と模擬処理された細胞との間；第４、５および６日−ｓｉＲＮＡ３ならびにｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処理された細胞と模擬処理された細胞との間；第７および６日−組み合せで処理された細胞と模擬処理された細胞との間。

図１６は、模擬処理された細胞と比較した、（ｓｉＲＮＡ３、６または３と６による）トランスフェクションの日から８日間にわたる非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９の増殖率を示す。統計的に有意なデータは、下記について得られた：第３および４日−ｓｉＲＮＡ３で処理された細胞と模擬処理された細胞との間。

図１７は、模擬処理された細胞と比較した、トランスフェクションの日から８日間の正常な２倍体の網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ−１９の増殖率を示す。統計的に有意なデータは、下記について得られた：第４および５日−有意な増殖阻害は、ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処理された細胞と模擬処理された細胞との間で観察された。ｓｉＲＮＡ６で処理された細胞を用いた場合、いずれの日でも増殖率の有意な減少はなかった。ｓｉＲＮＡで処理された細胞の増殖率の増加は、第８日で観察され、これは模擬処理された細胞におけるコンフルエントによるものであった。ｓｉＲＮＡで処理された細胞は、トランスフェクションの第４日までに観察されたこれらの細胞の増殖の阻害に起因して、徐々にコンフルエントに到達する。

処理された全ての細胞のうち、癌細胞Ａ４３１（類表皮癌）は、トランスフェクションの８日後でさえ、最大の阻害効果を示した。しかしながら、正常な２倍体の細胞であるＡＲＰＥ−１９は、細胞増殖の阻害に対する非常に制限された効果を示した。これは、ｓｉＲＮＡが癌細胞を選択的に阻害することを示している。

Ｃ）癌細胞株の細胞周期に対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果：
癌細胞は、常に増殖状態を維持しているので、所定時間に細胞周期のＳ期で維持している細胞の数が腫瘍の増殖能を決定する。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（細胞株ＰＣ−３およびＨｅＬａ由来）は、９６ウェルプレートにウェル当たり８０００個の細胞の密度で播種され、細胞周期に対するｓｉＲＮＡ３および／または６の効果、したがって、腫瘍細胞株の増殖指標を制御する能力を測定した。トランスフェクションの７２時間後、細胞をＢｒＤｕ取り込みに供し、上述したように細胞周期のＳ期にある細胞の数を測定した。吸光度値から、細胞周期のＳ期にある細胞の割合は、模擬処理された細胞を参照して得られた。全ての実験は、三連で行われ、それらの平均および標準偏差が得られた。前立腺癌細胞株ＰＣ３を用いて、ｓｉＲＮＡ３および／または６によるトランスフェクションは、細胞周期のＳ期を経て進行する細胞の能力を阻害した。阻害は、ＰＣ３（対照の２５％）で最も高く、ＨｅＬａ細胞は、模擬処理された対照の７５〜８０％であり、より少ない阻害を示した。また、データは、ｓｉＲＮＡ３と６の両方を用いたＰＣ３に対するトランスフェクションの相加効果を示した。

Ｄ）コレステロールと結合したｓｉＲＮＡおよびハイパーフェクト・トランスフェクション試薬と複合体化されたｓｉＲＮＡの血清安定性：
コレステロールは、ｓｉＲＮＡ３もしくは６のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの３’−末端に結合された。コレステロールを結合したｓｉＲＮＡは、血清安定性、並びにインビトロでのＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ発現を阻害する能力について、結合していないｓｉＲＮＡと比較された。

血清安定性は、１μｇのｓｉＲＮＡについて試験され、１０μＬの１００％ヒト血清とともに、３７℃、２４時間、４８時間および７２時間インキュベートされた。インキュベーションの終わりで、ｓｉＲＮＡは、１％アガロースゲル電気泳動上で試験された。コレステロールと結合したｓｉＲＮＡにおいて観察された移動度シフトは、様々な血清タンパク質の結合、したがって、血清ヌクレアーゼによる分解からのｓｉＲＮＡの保護に起因していた。図１８および１９に見られるように、コレステロールと結合したセンス鎖は、結合したアンチセンス鎖または結合していないｓｉＲＮＡよりも安定であった。さらに、ｓｉＲＮＡとハイパーフェクト・トランスフェクション試薬との複合体化は、血清安定性を増強しなかった。センス鎖の３’−末端でコレステロールと結合したｓｉＲＮＡは、より安定であることが分かり、１００％血清条件で３７℃、４８時間のインキュベーション後でさえ検出することができた。２つのｓｉＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡ６は、ｓｉＲＮＡ３と比較してより安定であることが分かった。これは、ＧＣ含量の増加および得られる高いＴｍに起因している可能性がある。

ｍＲＮＡを阻害する能力をＨｅＬａ細胞で試験した。コレステロールを結合したｓｉＲＮＡ３および６は、結合していないｓｉＲＮＡと比較して、それぞれＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのｍＲＮＡの阻害において３倍および４倍強力であった。

Ｅ）種々の癌細胞株のｓｉＲＮＡトランスフェクションによるインターフェロン−α応答の誘導
コレステロールを結合したｓｉＲＮＡ３（ＡｕｒｋＢ）およびｓｉＲＮＡ６（ＥＧＦＲ）は、他に記載したように、種々の癌細胞株（ＰＣ−３、Ａ４３１、Ａ５４９およびＨＦＦ−２）に組み合わせてまたは個々にトランスフェクトされ、２４ウェルプレートで７２時間インキュベートされた。７２時間の終わりに、プレートを遠心分離し、死細胞を除去し、１００μＬの上清を回収した。丸底ＥＬＩＳＡプレートで上清を一晩、４℃でインキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で簡単に洗浄し、非結合の抗原を取り除き、５％スキムミルク粉末で３０分間、室温でインキュベートし、ＰＢＳＴ中で各５分、３回洗浄し、その後、抗ウサギ抗インターフェロアルファ抗体で１時間、室温でインキュベートした。次に、前述の通り、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ結合したヤギ抗ウサギ抗体でさらに１時間、室温でインキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、ＨＲＰ基質を添加した。５６０ｎｍの参照フィルターを使用して、４５０ｎｍで吸光度値を記録した。模擬処理された試料および未処理の試料と比較した吸光度値に基づいて、インターフェロン応答が得られた。それらの標準偏差値は三連のものから測定され、結果を図８に示した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、多くの場合、ＩＦＮアルファ産生と関連付けられる。しかしながら、処理または未処理の細胞において、ＩＦＮアルファの統計的に有意な放出はなく、これは、ｓｉＲＮＡ３および６がいずれのＩＦＮアルファ応答も導き出さないことを示した。

表８．インターフェロンα応答の誘導に対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果

^＊は、統計的に、Ｐ≦０．０５では、有意性が観察されなかったことを示す。

Ｇ）転写に対する効果
標的ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの特異性は、前述されるように、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた前立腺癌細胞（ＰＣ３）において試験された。トランスフェクションの７２時間後、総ＲＮＡは、キアジェンの総ＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ）のプロトコールに従って調製され、全量２μｇのＲＮＡを１０μＬの水に懸濁させた。ＲＮＡの質は、変性ホルムアルデヒドゲル上で検証し、ＯＤ比は、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の分光光度計を用いて測定された。アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のナノ・インビトロ転写増幅キットのプロトコールに従って、１μｇの総ＲＮＡをＤＩＧ標識したｃＲＮＡに変換させた。得られた増幅ＲＮＡの１４μｇをヒトゲノム・サーベイアレイにハイブリダイズさせ、これは、２９，０９８遺伝子の照合のための一連の６０ｂｐのプローブを含む。このアレイは、５５℃、１７時間でハイブリダイズされ、その後、洗浄し、アルカリホスファターゼと連結させたＤＩＧに対する抗体に結合させた。化学発光検出基質を添加後、アレイをスキャンした。自動グリッド化（ａｕｔｏｇｒｉｄｄｉｎｇ）は、画像化ソフトウェアによって行い、各遺伝子の強度を数値に変換する結果ファイルを作成し、シグナルが高くなり、数値が高くなると、試料に存在する遺伝子の量が増す。

逆転写（ＲＴ）、インビトロ転写（ＩＶＴ）、ハイブリダイゼーションおよび化学発光検出から開始されるアッセイの各工程および全ての工程に対しては、対照を加えた。品質レポートは、マイクロアレイ実験の成功を確かめるのに役立つこれらの対照について生じさせた。一度、ＱＣレポートを満たしたら、スポットファイアー（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を用いて二次解析を進めた。このソフトウェアは、データを正規化し、「ｔ検定」を実行して、２つの条件の間で異なって発現した遺伝子を決定した。また、複製を平均化し、２つの条件に対する倍数変化値を測定した。異なって発現されたプローブＩＤは、Ｐａｎｔｈｅｒデータベースを経て分類され、どの経路または生物学的プロセスが異なって発現された遺伝子の中で影響を受けるかを決定し、ダウンレギュレートされたかまたは制御されなかった遺伝子の数を決定した。最小の１から４．５を超える倍数変化の範囲におよぶ転写発現レベルの変化を図２０〜２２に示し、ここでは、前立腺癌細胞は、ＡｕｒｋＢ（ｓｉＲＮＡ３）（図２０）、ＥＧＦＲ（ｓｉＲＮＡ６）（図２１）または両方（ｓｉＲＮＡ３と６）（図２２）に対して阻害された。これらの図は、未処理の対照と比較して、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされたｍＲＮＡの数を示している。観察された転写変化は、ＡｕｒｋＢとＥＧＦＲの両方が個々にではなく同時にノックダウンされる場合に、全般的に遺伝子抑制がないことを示している。ＡｕｒｋＢの下流標的物であるヒストンＨ３、およびＥＧＦＲ下流標的物であるＡＫＴが阻害された。さらに、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲをノックダウンされた細胞における転写のプロフィールは、メタル・プロテアーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰＳ）、カスパーゼ（アポトーシスの誘導に関する）の全体にわたる活性化、および血管形成に必要とされるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の阻害があることを示している。

（実施例６）：ｓｉＲＮＡはインビボにおける前立腺腫瘍に対して効果的であった
１．ＳＣＩＤマウスにおける有効性試験
インビボでｓｉＲＮＡの有効性を試験するために、異種移植片の前立腺癌腫瘍を、１００μＬの体積のＰＢＳ中３×１０^６細胞ｍＬ^−１の密度でヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３を一方の側腹に皮下注射することによって、６〜８週齢の雄性ＳＣＩＤマウスに誘導した。マウスは、３週間の終わりまでに、約４０〜５０ｍｍ^３の腫瘍を発生させた。マウスを２つのグループに分けた。グループＲは、ｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせで処置された５匹の動物からなっていた。グループＣは、ＰＢＳ中のトランスフェクション試薬のみを受けた３匹の動物からなっていた。ｓｉＲＮＡ処置の８日後、腫瘍の大きさを評価し、それらの標準偏差を図２３に示されるように観察した。試験された２つのグループのうち、ｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせで処置された動物は、プラセボ処置された動物と比較して、腫瘍増殖の約５０％の減少を示した。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって測定され、ここではＰ≦０．０５であった。腫瘍退縮を引き起こすという観点からの統計的な有意性は、第３、４および５日で処置された動物とプラセボ処置された動物との間で観察された。

腫瘍組織を動物から回収し、全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット分析に供した。癌組織からの全タンパク質溶解物は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、抗ＡｕｒｋＢ抗体、並びに内因性の対照としての抗チューブリン抗体を用いて探査した。図２４に示されるように、ｓｉＲＮＡ３と６の組み合わせを用いた処置により、結果として、ＡｕｒｋＢ発現を完全に阻害し、ｓｉＲＮＡ３だけで処置されたマウスは、ＡｕｒｋＢ発現の部分的な阻害を示した。

２．ヌードマウスにおける有効性試験
異種移植片の前立腺癌におけるｓｉＲＮＡの有効性を試験するために、腫瘍を、１００μＬ体積のＰＢＳ中３×１０^６細胞ｍＬ^−１の密度で前立腺癌細胞株ＰＣ３を側腹の一方に皮下注射することによって、４０匹の６〜８週齢の雄性無胸腺ヌードマウスに誘導した。マウスは、３週の終わりまでに約５０〜１００ｍｍ^３の腫瘍を発生させた。腫瘍を発生させたマウスは下記の４グループに分けた
１．グループＡ−１００μｇのｓｉＲＮＡ３で処置されたマウス
２．グループＢ−１００μｇのｓｉＲＮＡ６で処置されたマウス
３．グループＣ−１００μｇのｓｉＲＮＡ３と１００μｇのｓｉＲＮＡ６の組み合わせで処置されたマウス
４．グループＤ−プラセボで処置されたマウス。

センス鎖でコレステロールと結合され、ハイパーフェクト・トランスフェクション試薬と複合体化された１００μｇのｓｉＲＮＡは、各マウスに腫瘍内に注射された。１００μｇのｓｉＲＮＡの週に一度の投薬を４週間継続した。陽イオン性および陰イオン性リポソーム処方物の混合物と複合体化した、コレステロールを結合したｓｉＲＮＡの送達は、直接的な腫瘍内送達、並びに等量の異種移植された腫瘍の部位での皮下送達を伴う。グループＤにおけるプラセボで処置された動物は、ｓｉＲＮＡを欠如している処方物を全て受けた。腫瘍測定は、デジタルのワーナー・キャリパー・スケールを用いて、週に２回行われた。腫瘍の体積は、下記の式を用いて得た。腫瘍の体積＝（Ｗ^２ＸＬ）２、ここで、Ｗは腫瘍の幅であり；Ｌは、腫瘍の長さであり、デジタルキャリパー・スケールによって測定された。３５日の終わりに動物を屠殺し、肉眼的な病理学について観察した。肉眼的な病理学的観察は下記であった：
１．プラセボで処置された動物は、異種移植された前立腺腫瘍の非常に高い血管新生を示した。
２．プラセボで処置された動物は、淡色の腎臓を示した。リンパ系への腫瘍の転移／増殖が観察された。
３．プラセボで処置された動物は、ｓｉＲＮＡ処置された動物と比較して、行動観察から弱く、不健康であった。

３５日の終わりに、各グループについて腫瘍退縮は、図２５に示されるように得られた。図２５では、前立腺癌を異種移植された雄性無胸腺ヌードマウスは、ｓｉＲＮＡ３（グループＡ、ｎ＝６）、ｓｉＲＮＡ６（グループＢ、ｎ＝６）ｓｉＲＮＡ３および６の組み合せ（グループＣ、ｎ＝５）およびプラセボ（グループＤ、ｎ＝７）で処置された。統計的に有意な腫瘍退縮は、プラセボと比較して、同様にｓｉＲＮＡ３および／または６で処置されたマウスにおいて見られた。試験された全てのグループのうち、ｓｉＲＮＡ３＆６の組み合せが最も良い結果を示し、プラセボに対して８０％の腫瘍の退縮を示し；ｓｉＲＮＡ３で処置された動物は、６７％の退縮を示し；ｓｉＲＮＡ６は、プラセボで処置された動物に対して７０％の腫瘍の退縮を示した。得られた結果は、プラセボ、並びに下記の測定日での他の動物のグループと比較して有意であり、実験が終了するまで継続した：
第２１日：データは、グループＣ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
データは、グループＢ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
第２８日：データは、グループＣ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
データは、グループＢ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
データは、グループＡ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
第３５日：データは、グループＣ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
データは、グループＢ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
データは、グループＡ（腫瘍退縮）対グループＤに関して有意であった
データは、グループＣ（腫瘍退縮）対グループＡに関して有意であった。

図２５に示されたデータの概要は、さらに、図２６〜３１に示されるように、異種移植片の前立腺癌を含むヌードマウスの観察された病理学によって理解され得る。図２６では、ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ６の組み合せを用いたマウスの処置は、動物Ｃ８およびＣ７における処置開始から３５日後の、前立腺腫瘍の完全な退縮に影響を及ぼし、腫瘍は、プラセボで処置された動物Ｄ１０において明確に存在していた。図２７では、プラセボ（グループＤ、動物１０）から、３５日後に単離した前立腺腫瘍が、ｓｉＲＮＡ６（グループＢ、動物２６）またはｓｉＲＮＡ３＆６組み合せ（グループＣ、動物６）で処置された動物から単離されたものよりも非常に大きいことは明らかである。同様な結果は、図２９においても見られる。

また、ｓｉＲＮＡ処置は、異種移植された前立腺腫瘍の血管新生を減少させた。この現象は、ＥＧＦＲの阻害だけに因らない。なぜなら、それは、ＡｕｒｋＢを標的にしているｓｉＲＮＡ３で処置されたマウスにおいても観察されたためである。例えば、図２８は、プラセボで処置されたマウスは、ｓｉＲＮＡ３で処置されたマウス（グループＡ）と比較して、目立つ血管新生した腫瘍（グループＤ）を有することを示す。図３０では、矢印は、処置の３５日後にプラセボで処置されたマウスにおける前立腺腫瘍の血管新生を指している。比較すると、ｓｉＲＮＡ３で処置されたマウスにおいては血管新生はない（図３１）。

得られた結果は、前立腺腫瘍の退縮については、腫瘍の臨界体積および投薬量があることを示している。試験した全てのｓｉＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡ３と６の組み合せは、８１％の腫瘍退縮を引き起した（図２５〜２７）。他方で、グループＡ（ｓｉＲＮＡ３、ＡｕｒｋＢ）動物は、プラセボで処理された動物と比較して、６７％の退縮を示した（図２５、２８および２９）。グループＢ（ｓｉＲＮＡ、ＥＧＦＲ）動物は、プラセボで処理された動物と比較して、７０％退縮を示した（図２５および２７）。肉眼的な病理学の観察から、図３０および３１において観察されるように、ＡｕｒｋＢを標的にすることは、血管形成の阻害と関連付けられることが示唆された。

また、これらの結果は、前立腺腫瘍の初期の体積と必要とされる投薬量が、治療薬としてｓｉＲＮＡ３、６およびそれらの組み合せの効果的な応用について測定することが必要であることを示している。ｓｉＲＮＡ処置された動物および未処置の動物の得られた腫瘍退縮、肉眼的な病理学の観察および全般的な行動パターンは、実際にこれらのｓｉＲＮＡが臨床条件下で治療薬として適用されるという可能性を有することを示している。

（実施例７）：ｓｉＲＮＡは乳癌細胞に対して効果的であった
乳癌細胞のために用いられるプロトコールは、他に指示がなければ、他の癌について上述された通りである。乳癌細胞株ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ−７は、ｓｉＲＮＡ６でトランスフェクトされ、７２時間後、ＥＧＦＲタンパク質発現についてウェスタンブロットにより分析された。対照として、細胞は、模擬でトランスフェクトされ、即ち、細胞はｓｉＲＮＡ７でトランスフェクトされた。等量のタンパク質を全てのウェルに装填し、転写されたタンパク質が同程度の量であることを確実にするために、内因性の対照としてアルファチューブリンに対するブロットも試験された。図３２（ＳＫＢＲ３）および図３３（ＭＣＦ−７）に示されるように、ｓｉＲＮＡ６トランスフェクションは、ＥＧＦＲ発現（１７０ｋＤａバンド）を強力に抑制した
ｓｉＲＮＡ３（ＡｕｒｋＢを標的にする）によるＭＣＦ−７のトランスフェクションは、ＡｕｒｋＢ発現を抑制した。図３４に示されるように、トランスフェクトされた細胞は、僅かに検出可能なＡｕｒｋＢタンパク質を発現し、ＡｕｒｋＢは、模擬処理された細胞において容易に観察された。ｓｉＲＮＡ３、６または３と６を用いる主な目的は、それぞれのタンパク質ＡｕｒｋＢ、ＥＧＦＲまたはその両方の発現レベルを阻害することである。ｓｉＲＮＡでトランスフェクト細胞において視認できるバンドがない場合、それは、対象とするタンパク質の発現のノックダウンにおけるｓｉＲＮＡの有効性を示している。さらに、等量のタンパク質がゲルに装填され、タンパク質アルファチューブリン（５０ｋＤａ）も対照として検出された。

ウェスタンブロットにより得られた結果は、前述の通り、リアルタイムＰＣＲを用いたｍＲＮＡレベルの試験によって確かめられた。下記の表９は、ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡ３および／またはｓｉＲＮＡ６でトランスフェクトされた細胞において抑制されたことを示している。

表９．種々の癌細胞株のｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後のＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲレベルの発現における倍数減少

ｓｉＲＮＡ３（１０ｎＭ）、ｓｉＲＮＡ６（１０ｎＭ）および各１０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ３と６の組み合せで処理された種々の細胞株の代謝活性は、ＭＴＳアッセイによって測定された。図３５に示されるように、ｓｉＲＮＡ３および６で処理された全ての細胞株は、模擬処理された細胞株および未処理の細胞株と比較して阻害を示す。細胞株ＨＣＣ−３８は、１０ｎＭ濃度で有意な増殖阻害を示し、これは、最大の遺伝子抑制に必要とされる最適濃度が細胞間で変化し得ることを示唆している。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞との間で測定され、ここではＰ≦０．０５であった。有意な増殖阻害は、ＡｕｒｋＢ、ＥＧＦＲまたは同時にその両方について阻害された全ての細胞株（ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ−７およびＨＣＣ−３８）において観察された。ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲ発現の同時の抑制は、ＡｕｒｋＢまたはＥＧＦＲ発現のいずれか単独での抑制よりも増殖を阻害した。

ＢｒｄＵ取り込みは、図３６に示されるように、ｓｉＲＮＡ（３、６および３と６の組み合せ）または模擬、ｓｉＲＮＡ７でトランスフェクトされた後、ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびＨＣＣ−３８細胞株において試験された。トランスフェクションの４８時間後、細胞は、一晩、ＢｒｄＵとともにインキュベートされ、４５０ｎｍで吸光度値を測定することによってＢｒｄＵについて分析された。全ての実験は、三連で行い、それらの平均の吸光度値は、細胞増殖／腫瘍の増殖能の指標となる、細胞周期のＳ期における細胞の割合として示された。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡで処理された細胞との間で測定され、ここでは、Ｐ≦０．０５であった。統計的な有意性は、模擬処理された細胞と全てのｓｉＲＮＡで処理された細胞との間、並びにＡｕｒｋＢ、ＥＧＦＲおよびそれらの組み合せで処理された細胞間に見出された。

また、ＡｕｒｋＢ、ＥＧＦＲまたは同時にその両方の抑制は、結果として、培地中へのＬＤＨ放出をもたらす壊死の誘導または膜の完全性の損傷を誘導する。図３７は、模擬処理された細胞に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞からのＬＤＨ放出を示す。試験された全ての細胞株のうち、ＡｕｒｋおよびＥＧＦＲ両方の同時抑制は、ＡｕｒｋＢまたはＥＧＦＲ単独と比較して、より多くのＬＤＨ放出をもたらした。試験された細胞株のうち、ＭＣＦ−７は、模擬に対して１５０〜３００％の最大ＬＤＨ放出を示し、模擬処理された試料に対して、それぞれ、ＳＫＢＲ−３は、５０〜１５０％を示し、ＨＣＣ−３８は、２０〜７０％を示した。全ての実験は、三連で行われ、統計的な有意性（Ｐ≦０．０５である）は、模擬処理された細胞およびｓｉＲＮＡで処理された細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ３で処理された細胞、ｓｉＲＮＡ６で処理された細胞、およびｓｉＲＮＡ３と６で処理された細胞の間で見出された。しかしながら、ＨＣＣ−３８では、ｓｉＲＮＡ３処理とｓｉＲＮＡ６処理との間に有意な差はなかった。

また、コロニー形成効率は、ｓｉＲＮＡ３（１０ｎＭ）、ｓｉＲＮＡ６（１０ｎＭ）、各１０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ３と６との組み合せ、および１０ｎＭの模擬で処理された乳癌細胞株において調べた。統計的な有意性は、対をなす両側ｔ−検定によって、模擬処理された細胞とｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞との間で測定され、ここではＰ≦０．０５であった。図３８に示されるように、コロニー形成能の有意な阻害は、模擬処理された細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ３、ｓｉＲＮＡ６、またはｓｉＲＮＡ３と６の両方で処理された全ての細胞において観察された。しかしながら、ｓｉＲＮＡ３および６で処理されたＭＣＦ−７細胞、ＭＣＦ−７で処理されたものにおいて見られた有意な差はなかった。ＳＫＢＲ−３細胞株においては、ｓｉＲＮＡ３単独は、コロニー形成を８０％阻害することができた。

（実施例８）：ＡｕｒｋＢ ｓｉＲＮＡは細胞周期のＧ２期に癌細胞を停止させた。

ＡｕｒｋＢについてｓｉＲＮＡ３およびＥＧＦＲについてｓｉＲＮＡ６を用いて独立にまたは同時にトランスフェクトされた癌細胞株（ＨｅＬａ、Ａ５４９およびＰＣ３）は、７２時間後に回収された。細胞をＰＢＳで洗浄し、７０％氷冷エタノール中で４℃、６０分間固定された。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（０．１％のクエン酸ナトリウム中、５μｇ／Ｌのヨウ化プロピジウムおよび０．２ｍｇ／ｍＬ^−１のＲＮａｓｅ）で３０分間、４℃で処理された。ヨウ化プロピジウムで染色された細胞は、（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ））を用いてフロー分析に供された。Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて１０，０００回のゲートイベントについてデータを取得し、ＭｏｄＦｉｔＬＴ２．０（ベリティー・ソフトウェア・ハウス（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）、メイン州トップシャム（Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥ））を用いて分析した。

ＡｕｒｋＢのノックダウンは細胞周期のＧ２期での癌細胞の停止をもたらす
図３９Ａに示されるように、（ｓｉＲＮＡ３を用いた）ＡｕｒｋＢのノックダウンは、結果として、細胞周期のＧ２期での細胞の停止をもたらした。表１０に示されるように、例えば、ｓｉＲＮＡ３でトランスフェクトされたＨｅＬａ子宮頸癌細胞では、７７％の細胞がＧ２期にあり、Ａ５４９およびＰＣ３のトランスフェクトされた細胞は、それぞれ２２％および３７％の細胞がＧ２期にあった。オーロラキナーゼが小分子阻害剤によって阻害された場合、同様の結果が以前に報告された（Ｒｏｊａｎａｌａ Ｓ，Ｈａｎ Ｈ，Ｍｕｎｏｚ Ｒ，Ｂｒｏｗｎｅ Ｗ，Ｎａｇｌｅ Ｒ，Ｖｏｎ Ｈｏｆｆ Ｄ ａｎｄ Ｂｅａｒｓｓ Ｄ．Ｔｈｅ ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，Ａｕｒｏｒａ−２，ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２００４；４５１−４５７）。しかしながら、ＥＧＦＲノックダウン細胞（ｓｉＲＮＡ６でトランスフェクトされた）においては、Ｇ２捕捉は示されなかった。さらに、細胞におけるＧ２停止の誘導における相加効果は、ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ６の両方でトランスフェクトされた細胞（即ち、ここでは、ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲはノックダウンされた）では示されなかった。本試験で試験された細胞株は、アポトーシスを示さなかった。

表１０：ヨウ化プロピジウム染色、その後のフローサイトメトリー分析によって測定されるように、ＡｕｒｋＢのノックダウン（ｓｉＲＮＡ３を用いたトランスフェクションによる）は有糸細胞分裂のＧ２期に癌細胞の停止をもたらす。

ＨｅＬａ細胞は、ｓｉＲＮＡ３（ＡｕｒｋＢに対する）および模擬ｓｉＲＮＡ７を用いてトランスフェクトされた。７２時間後、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメーターを用いた細胞周期の分析のためにヨウ化プロピジウムで標識された。図３９Ａに示されるように、ｓｉＲＮＡ３（ＡｕｒｋＢに対する）でトランスフェクトされた細胞では、７７％がＧ２期にあり、６％がＳ期にあり、ほんの１６％がＧ１期にあった。対照的に、図３９Ｂに示されるように、模擬ｓｉＲＮＡ７でトランスフェクトされた細胞では、たった１７％がＧ２期にあり、３６％がＳ期にあり、４６％がＧ１期にあった。これは、ＡｕｒｋＢについてノックダウンされた細胞がＧ２停止に移行し、Ｓ期に移行する可能性はほとんどなく、アポトーシス誘導を示さないことを明示している。

これらの結果は、細胞死が、ＡｕｒｋＢ（ｓｉＲＮＡ３を用いる）のノックダウンの際にＧ２期での細胞の停止によって誘導されるのに対して、ＥＧＦＲのノックダウン（ｓｉＲＮＡ６を用いる）によって細胞周期に影響しないことを示している。これは、ＡｕｒｋＢのノックダウンの場合に膜の完全性の損傷を受けている細胞による、培地中へのＬＤＨの放出の理由であり得る。

（実施例９）：ＡｕｒｋＢおよびＥＧＦＲのｓｉＲＮＡは単独でまたは共に癌細胞の老化を誘導する。

ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞は、上述されるように、独立にまたは同時にｓｉＲＮＡ３および６を用いて、２４ウェルプレートにおいてトランスフェクトされた。７２時間後、トランスフェクトされた細胞は、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）老化アッセイキットのプロトコールに従って、老化アッセイに供された。要約すると、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、固定溶液で３０分間、室温で固定した。固定後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ溶液とともに一晩、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、光学顕微鏡を用いて、総合倍率２００倍で細胞を観察した。デジタルカメラを用いて、２４ウェルプレートの各ウェルについて１０箇所の異なる視野で画像を回収した。デジタルで取り込んだ画像は、所定の画像内における青色を示す細胞数と細胞の総数をカウントすることによって分析された。老化を示す細胞の割合は、細胞の総数から得た。全ての実験は三連で行い；統計的な有意性は、ｔ−検定によって測定し、ここではＰ≦０．０５であった。

ＡｕｒｋＢのノックダウンは、単独でまたはＥＧＦＲノックダウンと共に癌細胞の老化を誘導する：
ＡｕｒｋＢのノックダウン（ｓｉＲＮＡ３を用いてトランスフェクトすることによる）は、模擬処理された細胞（ｓｉＲＮＡ７を用いる）と比較して、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞の２７％において老化を誘導した。ｓｉＲＮＡ７（模擬）またはｓｉＲＮＡ６（ＥＧＦＲに対する）でトランスフェクトされた細胞では、老化の有意な誘導は見られなかった。一方、表１１および図４０に示されるように、ＡｕｒｋＢとＥＧＲＲの両方が同時にノックダウンされた（ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ６の両方でトランスフェクトされた細胞による）場合、増大された老化の誘導が観察された。データは、同様の結果がＡ４３１上皮癌細胞において生じることを示す。

表１１．ＡｕｒｋＢのノックダウンは、単独でまたはＥＧＦＲのノックダウンと共に子宮頸癌細胞における老化の誘導をもたらす。

^＊模擬に対して統計的に有意、Ｐ≦０．０５。

大部分の癌細胞は、模擬処理された細胞と比較して、ＡｕｒｋＢもしくはＥＧＦＲのいずれか、またはそれらの同時のノックダウンの７２時間後、老化経路の刺激を示す。これは、Ｇ２停止とは別に、老化経路の活性化はＡｕｒｋＢのｓｉＲＮＡによって誘導される細胞死の更なるメカニズムであることを示している。

（実施例１０）：ｓｉＲＮＡ処置はインビボにおいて乳癌腫瘍に対して有効である。

ｓｉＲＮＡ３および／またはｓｉＲＮＡ６がインビトロにおいて種々の癌に対して効果的であり、インビトロの結果も前立腺腫瘍を用いたインビボ実験における結果を反映したことが示されているため、ｓｉＲＮＡの有効性をヒトの乳癌に対して試験する。乳癌細胞についてのプロトコールは、他に指示がなければ、他の癌について上述された通りである。

乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびＨＣＣ−３８は全て、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成することができる。実施例６に記載されるＰＣ３前立腺癌細胞を用いて使用されるプロトコールに従って、乳癌細胞をマウスに注射し、腫瘍を形成することができる。次に、ｓｉＲＮＡを腫瘍に毎週注射される。その後、マウスは、一般的な健康、腫瘍サイズ、腫瘍血管新生および肉眼的な病理学について試験される。

結果は、統計的に有意な乳房腫瘍の退縮が、プラセボと比較して、ｓｉＲＮＡ３および／または６を用いて処置されたマウスにおいて生じることを示す。結果は、ｓｉＲＮＡ３および／６が異種移植された乳房組織の血管新生も減少させ、この現象は、ＥＧＦＲの阻害だけに起因しないことを示す。

乳房腫瘍の最初の容積および必要とされる投薬量は、治療薬としてｓｉＲＮＡ３、６およびそれらの組み合せの有効な適用について調べなければならない。他の癌に加えて、これらのｓｉＲＮＡは、臨床条件下での乳癌に対する治療薬として適用される可能性がある。

本明細書に開示され、請求されている全ての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作製し実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様の観点で記載されているが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変更が、本明細書に記載された組成物および／または方法、並びに方法の工程または工程の順番に適用されてもよいことは明らかである。より具体的には、化学的または生理学的に関連するある種の薬物は、本明細書に記載された薬物と置換することができ、同じであるかまたは類似した結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかであるこのような類似の置換および修飾の全ては、本発明の精神、範囲および概念に含まれるものとみなされる。

Claims (25)

1. ＡｕｒｋＢ発現を調節する短い核酸分子であって、該短い核酸分子が、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、分子。
2. 前記短い核酸分子が、
   （ａ）配列番号７のセンス鎖および配列番号８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ１；
   （ｂ）配列番号９のセンス鎖および配列番号１０のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２；ならびに
   （ｃ）配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３
   からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の分子。
3. （ａ）ＡｕｒｋＢの発現を直接調節するか；または
   （ｂ）ＡｕｒｋＢの発現を調節する少なくとも１つの分子に結合するか；または
   （ｃ）ＡｕｒｋＢ発現を阻害する、請求項１に記載の分子。
4. 前記短い核酸分子が、短い干渉性核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（μＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および干渉性ＤＮＡ（ＤＮＡｉ）分子からなる群から選択される、請求項１に記載の分子。
5. 前記短い核酸分子が、１９〜３０ヌクレオチド、２５〜２９ヌクレオチド、または２７ヌクレオチドであるか；または
   該短い核酸分子が、全長ＡｕｒｋＢヌクレオチド配列内の配列に相補的である１９〜３０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の分子。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の分子、および医薬として許容される担体を含む、組成物。
7. 脂質、ポリマーおよび／またはモノクローナル抗体をさらに含むか、または前記短い核酸分子がコレステロールに結合している、請求項６に記載の組成物。
8. ＥＧＦＲの発現を調節するかまたはＥＧＦＲの発現を減少させる第２の短い核酸分子をさらに含む、請求項６または７に記載の組成物。
9. （ａ）前記第２の短い核酸分子が、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むか；
   （ｂ）前記第２の短い核酸分子が、
   （ｉ）配列番号１３のセンス鎖および配列番号１４のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ４；
   （ｉｉ）配列番号１５のセンス鎖および配列番号１６のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ５；ならびに
   （ｉｉｉ）配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６
   からなる群から選択される配列を有するか；または
   （ｃ）前記短い核酸分子が、配列番号１１のセンス鎖および配列番号１２のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ３を含み、前記第２の短い核酸分子が、配列番号１７のセンス鎖および配列番号１８のアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ６を含む、請求項８に記載の組成物。
10. 前記組成物は、脂質、陽イオン性脂質、リン脂質、およびリポソームからなる群から選択される送達因子と組み合わせて使用されることを特徴とするか；または
    前記組成物は、モノクローナル抗体、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせと組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
11. 前記短い核酸分子が、配列番号３の配列全体に相補的であって長さが３０ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の組成物。
12. 前記短い核酸分子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が配列番号１１を含み、該アンチセンス鎖が配列番号１２を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. ＥＧＦＲの発現を調節する第２の短い核酸分子をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
14. 前記第２の短い核酸分子が、配列番号６に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記第２の短い核酸分子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が配列番号１７を含み、該アンチセンス鎖が配列番号１８を含む、請求項１３に記載の組成物。
16. ＡｕｒｋＢの発現を調節する短い核酸分子を含む組成物であって、該短い核酸分子は長さが２２〜３０ヌクレオチドであり、該分子中の少なくとも２２連続するヌクレオチドが配列番号３中の少なくとも２２連続するヌクレオチドと１００％相補的である、組成物。
17. 細胞におけるＡｕｒｋＢの発現を調節するための、癌細胞の増殖を阻害するための、癌細胞の増殖を減少させ、および／もしくは癌細胞の壊死を増加させるための、癌細胞をＧ２期に停止させるための、または癌細胞の老化を誘導するための、インビトロにおける方法であって、該細胞を、請求項１〜５のいずれかに記載される短い核酸分子または請求項６〜１６のいずれかに記載の組成物と接触させる工程を包含する、方法。
18. 癌もしくは増殖性疾患を処置するため、または癌細胞の増殖を減少させ、および／もしくは癌細胞の壊死を増加させるため、癌細胞をＧ２期に停止させるため、または癌細胞の老化を誘導するための方法において使用するための請求項１〜５のいずれかに記載の分子。
19. 前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、リンパ腫、神経膠腫、および多剤耐性癌からなる群から選択される、請求項１８に記載の分子。
20. 癌もしくは増殖性疾患を処置するため、または癌細胞の増殖を阻害するため、または癌細胞の増殖を減少させ、および／もしくは癌細胞の壊死を増加させるため、癌細胞をＧ２期に停止させるため、または癌細胞の老化を誘導するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載の分子の使用。
21. 治療によるヒトまたは動物の身体の処置方法において使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載の分子。
22. 癌もしくは増殖性疾患を処置するため、または癌細胞の増殖を減少させ、および／もしくは癌細胞の壊死を増加させるため、癌細胞をＧ２期に停止させるため、または癌細胞の老化を誘導するための方法において使用するための、請求項６〜１６のいずれかに記載の組成物。
23. 癌もしくは増殖性疾患を処置するため、または癌細胞の増殖を阻害するため、または癌細胞の増殖を減少させ、および／もしくは癌細胞の壊死を増加させるため、癌細胞をＧ２期に停止させるため、または癌細胞の老化を誘導するための医薬の製造における、請求項６〜１６のいずれかに記載の組成物の使用。
24. 治療によるヒトまたは動物の身体の処置方法において使用するための、請求項６〜１６のいずれかに記載の組成物。
25. 前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頸癌、頭部および頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、リンパ腫、神経膠腫、および多剤耐性癌からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。

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