JP6478916B2 - 薬物耐性乳癌の予後判定および処置のための治療アジュバントおよびバイオマーカーとしてのmiRNA - Google Patents
薬物耐性乳癌の予後判定および処置のための治療アジュバントおよびバイオマーカーとしてのmiRNA Download PDFInfo
- Publication number
- JP6478916B2 JP6478916B2 JP2015542832A JP2015542832A JP6478916B2 JP 6478916 B2 JP6478916 B2 JP 6478916B2 JP 2015542832 A JP2015542832 A JP 2015542832A JP 2015542832 A JP2015542832 A JP 2015542832A JP 6478916 B2 JP6478916 B2 JP 6478916B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mir
- hsa
- mirna
- cells
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2012年11月16日に提出された米国特許仮出願第61/727,481号の優先権の恩典を主張する。
本発明は、癌を処置するためのマイクロRNA(miRNA)の使用、ならびに癌を処置するためのこれらの組成物の使用に関する。
B.関連技術の説明
乳癌全体のおよそ15〜20%がトリプルネガティブ乳癌(TNBC)である。これらの癌は典型的に、明確な侵攻性の転移パターンを示す。TNBCの診断を受けている患者の予後はしばしば不良であり、そのため乳癌による死亡数は不釣り合いなほど多い。TNBC疾患の初期段階では化学療法に対する奏効率が良好であるにもかかわらず、60%を超えるTNBC患者が化学療法に対する耐性を生じ、これによって早期再発および生存期間の短縮が起こる。
hsa-miR-204またはその相同体の発現が低下している癌細胞を有するまたは有することが疑われる対象に、hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物の有効量を投与する段階を含む、癌細胞の増殖を低下させるための方法。
[本発明1002]
癌細胞が、脳由来神経栄養因子(BDNF)またはエズリンを過剰発現する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
癌細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、または小児腎腫瘍細胞である、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
乳癌細胞がトリプルネガティブ乳癌(TNBC)細胞である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
癌細胞の増殖が転移性である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
癌細胞におけるhsa-miR-204またはその相同体のレベルを決定する段階をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
hsa-miR-204またはその相同体のレベルが、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)またはアレイハイブリダイゼーションを用いて決定される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
対象から得た血液試料中のhsa-miR-204またはその相同体のレベルが決定される、本発明1006または1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
血液試料中のhsa-miR-204またはその相同体のレベルが、対照と比較して低下している、本発明1008の方法。
[本発明1010]
hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物が全身投与のために製剤化される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物が、静脈内注射により投与される、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物が、脂質ベースの送達媒体またはナノ粒子ベースの送達媒体をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
対象が、第二の活性物質を含む組成物をさらに投与される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
第二の活性物質が、細胞傷害性化学療法剤、ナノバイオコンジュゲート、またはhsa-miR-204もしくはその相同体以外のmiRNAを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
細胞傷害性化学療法剤がタキサンである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
タキサンがパクリタキセルである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物が、第二の活性物質を含む組成物と同時に投与される、本発明1013〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物が、第二の活性物質を含む組成物が投与される前または後に投与される、本発明1013〜1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物と第二の活性物質を含む組成物との投与の時間間隔が1から30日である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
第二の活性物質を含む組成物が、hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物の前に投与される、本発明1018または1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
癌細胞が第二の活性物質に対して耐性となっている、本発明1013〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
第二の活性物質がパクリタキセルである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
hsa-miR-204またはその相同体を含む組成物が薬学的に許容される担体を含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1024]
調製物が、無菌性、発熱物質、および微粒子、または他の混入物に関する薬局方の要件を満たしている、本発明1023の方法。
[本発明1025]
調製物が全身投与のために製剤化されている、本発明1023または1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
対象が哺乳動物である、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
対象がヒトである、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
対象の細胞におけるhsa-miR-204またはその相同体のレベルを決定する段階を含む、癌細胞の増殖を低下させるための治療から効果が得られる可能性がある対象を同定するための方法。
[本発明1029]
対象の細胞におけるhsa-miR-204またはその相同体のレベルが、qRT-PCRまたはアレイハイブリダイゼーションを用いて決定される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
対象から得た血液試料中のhsa-miR-204またはその相同体のレベルが決定される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
血液試料中のhsa-miR-204またはその相同体のレベルが、対照と比較して低下している、本発明1030の方法。
[本発明1032]
阻害されると、治療活性物質の亜致死濃度で培養した癌細胞株の細胞の生存率を増加させる有望な増感剤miRNAをスクリーニングするための方法であって、
候補増感剤miRNAの阻害物質と共に治療活性物質の亜致死濃度を含むmiRNA阻害物質含有培養物中で癌細胞株の細胞を培養する段階;
治療活性物質の亜致死濃度を含むが候補増感剤miRNAの阻害物質が添加されていないmiRNA阻害物質欠如培養物中で癌細胞株の細胞を培養する段階;ならびに
一定期間後に、miRNA阻害物質含有細胞集団と、miRNA阻害物質欠如細胞集団の生存率を決定する段階であって、miRNA阻害物質含有細胞集団の生存率が、miRNA阻害物質欠如細胞集団の生存率より有意に高ければ、候補増感剤miRNAが有望な増感剤miRNAとして同定される、段階
を含む、方法。
[本発明1033]
有望な増感剤miRNAが、hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、hsa-miR-367-5p、またはhsa-miR-133A、またはそれらの相同体である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
有望な増感剤mRNAがhsa-miR-204またはその相同体である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
治療活性物質の亜致死濃度が、癌細胞株の細胞の80%が72時間培養後になおも生存可能である濃度である、本発明1032〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
治療活性物質がパクリタキセルである、本発明1032〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
パクリタキセルの亜致死濃度が2〜8 nMである、本発明1035の方法。
[本発明1038]
癌細胞株の細胞がTNBC細胞である、本発明1032〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
阻害されると、治療活性物質の亜致死濃度中で培養した癌細胞株の細胞の生存率を低下させる有望な減感剤miRNAをスクリーニングするための方法であって、
候補減感剤miRNAの阻害物質と共に治療活性物質の亜致死濃度を含むmiRNA阻害物質含有培養物中で癌細胞株の細胞を培養する段階;
治療活性物質の亜致死濃度を含むが候補減感剤miRNAの阻害物質が添加されていないmiRNA阻害物質欠如培養物中で癌細胞株の細胞を培養する段階;および
一定期間後にmiRNA阻害物質含有細胞集団とmiRNA阻害物質欠如細胞集団の生存率を決定する段階であって、miRNA阻害物質含有細胞集団の生存率が、miRNA阻害物質欠如細胞集団の生存率より有意に低ければ、候補減感剤miRNAが有望な減感剤miRNAとして同定される、段階
を含む、方法。
[本発明1040]
有望な減感剤miRNAが、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915*、hsa-miR-320d、またはそれらの相同体である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
治療活性物質の亜致死濃度が、癌細胞株の細胞の80%が72時間培養後になおも生存可能である濃度である、本発明1039または1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
治療活性物質がパクリタキセルである、本発明1039〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
パクリタキセルの亜致死濃度が2〜8 nMである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
癌細胞株の細胞がTNBC細胞である、本発明1039〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
増感剤miRNAの発現が有意に低下している癌細胞を有するまたは有することが疑われる対象に、増感剤miRNAまたはその相同体を含む組成物の有効量を投与する段階を含む、癌細胞の増殖を低下させるための方法。
[本発明1046]
減感剤miRNAの発現が有意に増加している癌細胞を有するまたは有することが疑われる対象に、減感剤miRNAまたはその相同体の阻害物質を含む組成物の有効量を投与する段階を含む、癌細胞の増殖を低下させるための方法。
[本発明1047]
対象の細胞における増感剤miRNAまたはその相同体のレベルを決定する段階を含む、癌細胞の増殖を低下させるための治療から効果が得られる可能性がある対象を同定するための方法。
[本発明1048]
増感剤miRNAが、hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、hsa-miR-367-5p、またはhsa-miR-133A、またはそれらの相同体である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
対象の細胞における減感剤miRNAまたはその相同体のレベルを決定する段階を含む、癌細胞の増殖を低下させるための治療から効果が得られる可能性がある対象を同定するための方法。
[本発明1050]
有望な減感剤miRNAが、hsa-miR-129-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915*、hsa-miR-320d、またはそれらの相同体である、本発明1049の方法。
本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、この詳細な説明から当業者には、本発明の精神および範囲に含まれる様々な変更および改変が明らかとなることから、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な態様を示しているが、単なる例証のために提供されると理解すべきである。
本発明者らは、トリプルネガティブ乳癌(TNBC)細胞における薬物感受性/耐性の媒介にmiRNAが重大な役割を果たすことを証明した。ハイスループットmiRNA/miRNA阻害物質ライブラリスクリーニングを通して、本発明者らは、TNBC状態の第一選択処置として一般的に用いられる薬剤であるパクリタキセルに対する薬物耐性TNBC細胞の感受性を独自に増加させるmiRNAを同定した。これらのスクリーニングによって、耐性TNBC細胞のパクリタキセルに対する感受性を増加させるmiRNAが、健康な兄弟からの血清と比較して、再発した転移性TNBC患者の血清中に有意に低レベルで存在しうることも判明している。
各miRNAの二行目および四行目のサブ配列は、当てはまる場合は、それぞれ-5pおよび-3pのサブ配列である。
癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を有する染色体領域が特定されたことにより、腫瘍の病因がよりよく理解され、より良好な治療転帰が得られている(Bayani, et al., 2007)。いくつかの癌関連遺伝子が、染色体異常を有する領域において同定されているが(Albertson, et al., 2003)、癌の増殖および進行において重要な要因を有する無秩序なまたは再発性の染色体異常を有する追加の領域を同定する必要がある。最近の研究から、マイクロRNA(miRNA)が1つのそのような要因群であることが示されている(Varambally, et al., 2008)。miRNAは、標的mRNAの3'非翻訳(UTR)領域に結合することによって、転写後遺伝子発現を調節する低分子の内因性非コードRNAである。miRNAは、発達および分化を含む多数の生物プロセスにおいて重要な機能を有することが知られている(Bartel, et al., 2004)。miRNAの発現の脱制御は、癌を含むいくつかのヒト疾患に関係している(Bartels, et al., 2009)。miRNAが癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子として作用しうることは、証拠により示唆されている(Esquela-Kerscher, et al., 2006)。
ヒトの癌における異常な染色体領域に関連するmiRNAを同定するために、高解像度カスタムmiRNA比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)を、卵巣癌、乳癌、および小児腎腫瘍に関する高密度CGHパブリックドメインデータセットと共に用いた。この分析により、これらの腫瘍の最小の染色体欠失および増幅領域におけるいくつかのmiRNAが明らかとなった。miRNAに関連する染色体座の腫瘍発生における機能的重要性の理解から始めるために、ゲノム喪失を示すmiRNAを調べた(図1および、例えば図9A)。hsa-miR-204を含む9q21.12染色体領域は、卵巣癌の44.63%(158/354)、乳癌の28%(10/35)、および小児腎腫瘍の40%(15/38)においてしばしば失われており(小児腎腫瘍および卵巣癌に関しては、それぞれ、図1Aおよび1Bも参照されたく、乳癌に関しては図9Bを参照されたい)、このことを、定量的ゲノムリアルタイムPCR分析によってさらに確認する(図1Cおよび1D)。さらに、成熟miR-204のレベルの低下もまた、3つ全ての腫瘍タイプにおいてそのゲノムDNA含有量と強く相関した(図1E、1F、および1G)。
多数の癌組織においてhsa-miR-204の発現が劇的に低下していることは、腫瘍発生におけるhsa-miR-204の役割に取り組むきっかけとなった。最初に、足場非依存性増殖に及ぼすhsa-miR-204の効果に取り組んだ。52回を超えて継代したHEK-293細胞は、高度に腫瘍発生性であると報告されており(Shen, et al., 2008)、hsa-miR-204を過剰発現する胎児腎HEK-293細胞は、コロニー形成能の低下を示した。しかし、コロニー形成能は、hsa-miR-204の阻害物質を過剰発現させることによって回復した(図2A)。類似の結果はまた、乳癌MDA-MB-231細胞および卵巣癌SKOV3細胞におけるhsa-miR-204の過剰発現に関しても得られた(データは示していない)。さらに、hsa-miR-204の可能性ある腫瘍抑制因子様活性を確認するために、hsa-miR-204またはスクランブル配列のいずれかを安定に過剰発現する高継代HEK-293細胞を、ヌードマウスの腎被膜に注射して、腫瘍の増殖および転移を注射後24日目に評価した。対照腫瘍とは際立って対照的に、hsa-miR-204過剰発現腫瘍の大きさは劇的に低下した。次に、hsa-miR-204が腫瘍細胞の浸潤も阻害するか否かを調べた。異種移植片腫瘍切片の組織学分析により、対照と比較してmiR-204を過剰発現する腫瘍の腎組織への浸潤の劇的な低下が示されたかまたは浸潤は示されなかった(図2C)。これと一貫して、hsa-miR-204過剰発現は乳癌(MDA-MB-231)および卵巣癌(SKOV3)細胞の遊走および浸潤能をインビトロで劇的に低下させた(図2D、データは示していない)。
hsa-miR-204の転移抑制活性をさらに実証するために、乳癌の肺転移モデルにおいて治療実験を行った。最初に、ルシフェラーゼ-GFPを発現するMDA-MB-231乳癌細胞を尾静脈に注射することによって、肺転移を確立した。次に、hsa-miR-204またはhsa-miR-204変異体オリゴ(陰性対照)を、LANCErII脂質ベースのインビトロ送達媒体を用いて、これらのヌードマウスの尾静脈に30日間にわたって5日毎に注射した。興味深いことに、hsa-miR-204の全身送達によって、肺転移の有意な減少または消失が起こったが、これに対し、hsa-miR-204変異体オリゴを注射したマウスは重度の肺転移を含む転移を有した(図3A)。特に、hsa-miR-204を注射したマウスは、肝毒性または体重の変化がなかったことから明白であるように、少なくとも明白な副作用を示さなかった(図3B、データは示していない)。これらの結果は、hsa-miR-204およびその相同体が、腫瘍の増殖および転移を処置するための安全かつ実行可能な治療計画の基礎となりうることを示している。
hsa-miR-204が腫瘍発生において果たしうる役割を補強するメカニズムを理解するために、miR-204によって調節される遺伝子を同定した。ほとんどのmiRNAは、標的mRNAレベルを低下させるように作用することから(Guo, et al., 2010)、hsa-miR-204を過剰発現する細胞について遺伝子発現分析を行って、hsa-miR-204の有望な標的を決定した。hsa-miR-204過剰発現細胞において変化した遺伝子の中で、ダウンレギュレートされた遺伝子は、hsa-miR-204の直接の標的である可能性がある。興味深いことに、ダウンレギュレートされた遺伝子のいくつかは、癌関連プロセスに関連しており、経路に基づく分析によって明らかとなるように、物理的または機能的に互いに相互作用する(図10Aおよび10B)。これらの遺伝子の中で、1つのそのような遺伝子、すなわちBDNFについて詳細な分析を行ったところ、BDNFは、マイクロアレイ分析において高レベルの変化を示し、予想される全ての生物学的経路において最も機能が濃縮された重要性を有することを特徴とした。BDNFは、その受容体TrkBと共に、腫瘍の血管新生および転移において重大な役割を果たすことが知られている(Edsjo, et al., 2003; Nakagawara, et al., 1994)。その上、SvMicrO(Liu, et al.,2010)、ベイズ決定融合アプローチ(Yue, et al.,2010)、および本発明者らが作成したmiRmate(Du, et al.,2009)、ならびにTargetScan(Lewis, et al.,2005)、および Pictar(Krek, et al, 2005)を含む多数の標的予測アルゴリズムもまた、BDNFがhsa-miR-204の標的であることを予測した。さらに、hsa-miR-204結合部位は、脊椎動物全体で進化的に保存されていることが見出され、これは多様な種を超えて重要な調節機能を有することを示唆している。重要なことに、hsa-miR-204およびBDNF/TrkB発現は、いくつかの腫瘍において強い逆相関を示した(図4A、4B、および4C)。
hsa-miR-204がその腫瘍の増殖および転移の抑制活性を示しうるメカニズムを決定するために、AKT/mTORシグナル伝達経路に及ぼすhsa-miR-204の効果を、これまでにAKT経路を活性化することが示されているBDNFの観点から調べた(Troca-Martin, et al., 2010)。加えてmTORによるAKTの選択的活性化は、癌細胞の遊走および浸潤を調節することが示されている。興味深いことに、hsa-miR-204過剰発現によって、AKTならびにmTORの下流の標的である4E-BP1およびS6の活性の低下が起こった(図5A)。4E-BP1は、リン酸化されるとeIF4Eから解離してタンパク質の翻訳を可能にする翻訳阻害物質であり、S6は、そのリン酸化によりリボソームのアセンブリを促進して、次いでmRNAの翻訳を促進するリボソームタンパク質である。AKTは、アクチン構築、細胞間接着、および細胞移動に関係する多数のプロセスを調節することによって、細胞の浸潤を制御する(Kim, et al., 2011; Grille, et al., 2003; Enomoto, et al., 2005)。
hsa-miR-204は、腫瘍抑制因子であるのみならず、化学療法剤パクリタキセルに対する薬物耐性乳癌の感受性を増加させるmiRNAであることが認められている。
本発明者らはまた、エズリンRNAに対するhsa-miR-204の結合、およびエズリン3'-UTR領域における対応する5'-AAAGGGAA-3'配列に対する、hsa-miR-204のシード領域における配列3'-UUUCCCUU-5'の特異的結合も同定した。エズリンは、エズリン/ラジキシン/モエシン(ERM)ファミリーのメンバーであり、細胞の形質膜およびアクチン細胞骨格の機能を連結することにより細胞骨格の再構築を促進する。エズリンは、いくつかの成人および小児腫瘍の腫瘍増殖および転移に関係しており、エズリンの強い多巣性発現は、いくつかの腫瘍の予後不良に関連している。P-糖タンパク質は、fermドメインの149から242番目のアミノ酸残基でエズリンに結合して、ヒト骨肉腫の多剤耐性において重要な役割を果たす。
癌に関連する多くのmiRNAが、ゲノムの脆弱部位に位置することが知られている(Calin, et al., 2004)。しかし、意外にも、miRNAを含む染色体異常を有する領域の機能的重要性に関してはほとんどわかっていない。染色体異常の発見を目的とした最初の遺伝子スクリーニング(典型的に解像度がより低い比較ゲノムハイブリダイゼーション)は、miRNAを含むゲノム領域の変化を見落とす可能性がある。miRNAは、細胞の増殖およびアポトーシスを調節する1つまたは複数の経路のいくつかの遺伝子に影響を及ぼし、脱制御されると腫瘍の形成に寄与することから、miRNAをコードするより小さいゲノム領域を厳密に調べることにより、腫瘍発生メカニズムに関する重要な洞察がもたらされうる。ほとんどのmiRNAは、癌においてダウンレギュレートされると提唱されており、特異的miRNAを含む遺伝子領域の微小欠失は、ヒト癌の発症および進行において重要な役割を果たす事象でありうる。
(正常および腫瘍組織試料および細胞株)
実験に用いた小児腎腫瘍(HEK293;胎児腎細胞株)、卵巣癌(SKOV3)、および乳癌(MDA-MB-231)を代表する細胞株を、ATCCプロトコールに従って培養した。76例の小児腎腫瘍および対応する正常な腎臓を、Children's Oncology Group(Arcadia, CA)から得た。11例の進行期卵巣腫瘍および5例の正常な卵巣組織をUT MD Anderson Cancer Center(Houston, TX)から得た。15例の乳癌組織および対応する正常組織をUT Health Science Center(San Antonio, TX)から得た。
(RNAおよびタンパク質分析)
総RNAを腫瘍および正常組織、ならびに全ての細胞株から抽出して、以前に記述されたように(Imam, et al., 2010)qRT-PCR分析に供した。ウェスタンブロット分析は、以前に記述されたように(Imam, et al., 2010)行った。β-アクチンに対する抗体(AC-74-A5316)およびα-チューブリンに対する抗体(T6199)は、Sigma Aldrichから購入した。BDNFに対する抗体は、Santa Cruzから購入し、カスパーゼ-8に対して特異的な抗体(IC12-9746)、カスパーゼ-3に対して特異的な抗体(8G10-9665)、カスパーゼ-9に対して特異的な抗体(9502)、PARPに対して特異的な抗体(9542S)、AKTに対して特異的な抗体(9272)、ホスホ-AKTに対して特異的な抗体(9271)、S6リボソームタンパク質に対して特異的な抗体(2217)、およびホスホS6リボソームタンパク質に対して特異的な抗体(5G10-2211S)を含む他の抗体は、Cell Signalingから購入した。
(ゲノムPCRアッセイ)
小児腎腫瘍(n=38)および進行期(IIIおよびIV期)卵巣癌ならびに対応する正常腎組織(n=38)および対応する正常卵巣組織(n=4)からのゲノムDNAを、DNeasyゲノムDNA抽出キット(Qiagen)によって単離した。hsa-miR-204のゲノム分析に関して、記述されるように(Varambally, et al.,2008)SYBRグリーンに基づく定量的PCR(qRT-PCR)を用いて2△△Ct法を適応させた。簡単に説明すると、ゲノムDNA 25 ngを鋳型として用いて、hsa-miR-204座を増幅した。代表的な対照組織試料を、あらゆる試料をそれに対して比較するキャリブレータとしてあらゆるアッセイにおいて用いて、相対的定量(RQ)値を得た。正常な男性試料(1×)および正常な女性試料(2×)(Promega)からのゲノムDNAを用いて、ホスホグリセレートキナーゼ1(PGK1)レベル、ならびに5つのX-染色体特異的miRNA、すなわちhsa-miR-424、hsa-miR-503、hsa-miR-766、hsa-miR-222、およびhsa-miR-221のレベルを比較し、様々なmiRNA座における喪失の程度を較正した。男性のゲノムDNAにおけるこれらの領域のRQ値を、非X-染色体TATA結合タンパク質(TBP)遺伝子を基準として用いて評価した。2つの異なるデータ集団を分離できることに基づいて、0.5以下のRQ値は、ゲノム座の少なくとも1コピーの喪失として見なされた。
(高解像度miRNA比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)アッセイ)
Agilentカスタムデザインマイクロアレイを製造元のプロトコールに従って用いて、小児腎腫瘍試料から単離したゲノムDNAについて、miRNA CGH分析を行った。カスタムアレイは、Agilent 2×105K Human Whole Genome Genomic Microarrayに基づいてAgilent's eArrayプログラム(earray.chem.agilent.com/earrayで入手可能)を用いて、全てのmiRNA領域をカバーする追加のプローブ(信頼性を高めるために、miRBase v13からの各miRNAの200 bp前、miRNA内、および200 bp後の3種類のプローブ)を用いて設計した。DNAの変化を定量するために、アレイCGHデータ分析をNexus Copy Number(BioDiscovery)によって行った。特異的miRNA部位でのコピー数変化を有するまたは有しない試料を決定した後、複合グラフ表示を得るために、全てのアレイCGHデータをMALTABにロードした。プローブの位置および正規化コピー数を示すアレイCGHは、GEO/NCBIデータベース(GSE28397)に提出されている。
(メタ分析)
354例の卵巣癌(The Cancer Genome Atlas(TCGA)プロジェクトから得た、オンラインでは<cancergenome.nih.gov>にある)、および35例の乳癌(GSE15130)に関するパブリックドメインの高密度CGHデータセットについてメタ分析を行った。全ての腫瘍からのアレイCGHデータをNexus Copy Numberにインポートした。コピー数喪失閾値を、log 2-0.5に設定した(log2-0.2のデフォルト設定よりストリンジェントである)。遺伝子発現分析のメタ分析を、GEO/NCBIからのパブリックドメイン遺伝子発現データセット(GSE22820)について行った。乳癌試料におけるTRPM3(miR-204を含む座)の差次的発現を、最初にRMA/変位値正規化(quantile normalization)を行い、次に同じデータセット内の正常な隣接組織と比較することによって決定した。
(遺伝子発現分析)
ヒト遺伝子発現マイクロアレイデータをAgilent Human Whole Genome 4x44K array(Agilent Technologies)を用いて作製した。miR-204をトランスフェクトしたHEK-293細胞から単離した総RNAを、製造元のプロトコールに従って、ダイスワップ反復実験を行って、スクランブルオリゴ(対照)をトランスフェクトしたHEK-293細胞からのRNAと同時ハイブリダイズさせた。相対的遺伝子発現比をAgilent's Feature Extractionソフトウェア(バージョン9.5.3.1、Agilent Technologies)によって抽出した。MATLAB Bioinformatics Toolbox(R2009a, Mathworks)によって、変位値正規化を行った。遺伝子の差次的発現を決定するために、正規化した発現データにStudent's t-検定を適用した。FDR調整後にP<0.05(ベンジャミン-ホックバーグ)および変化倍率>2に基づいて、シグネチャー遺伝子セットを選択した。差次的遺伝子発現データセットは、GEO/NCBIデータベースに寄託されている(GSE28400)。
(プラスミドの構築)
pMIR-BDNF 3'-UTR構築物に関して、BDNF遺伝子の3'-UTRセグメントを増幅して、pMIR-REPORTベクター(Ambion)のHindIIIおよびSpeI部位でルシフェラーゼ遺伝子の下流にサブクローニングした。pSilencer-miR-204構築物に関して、およそ500 bpのpri-miR-204ゲノム配列を増幅して、pSilencer 4.1 Puroベクター(Ambion)のBamHIおよびHindIII部位にクローニングした。
(細胞の増殖および軟寒天アッセイ)
pSilencer-miR-204およびpSilencerスクランブル(対照)安定細胞株を用いた細胞の増殖および軟寒天コロニー形成アッセイを、以前に記述されたように(Imam, et al., 2010)行った。
(SCIDマウスにおける腫瘍形成アッセイ)
pSilencer-miR-204またはpSilencerスクランブルのいずれかを安定に過剰発現するHEK-293細胞200万個をRAG2-/-、γc-/-SCID雄性マウス(Taconic)9匹および対照マウス9匹の腎被膜に注射した。腫瘍の体積を、式π/6×(L×D×W)を用いて移植後24日目に評価し、式中Lは腫瘍の長さ、Dは腫瘍の深さ、およびWは幅である。6マイクロメートルのパラフィン包埋腫瘍切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。動物を必要とする実験技法は全て、施設内倫理ガイドラインに従って行った。
(トランスウェル細胞遊走および基底膜マトリクス浸潤アッセイ)
トランスウェル細胞遊走アッセイを既に記述されたように(Imam, et al., 2010)行った。75 nMのmiR-204模倣体または陰性対照模倣体をトランスフェクトして、さらに75 nMのmiR-204特異的阻害物質または25 ngのpBluescript KS+対照を48時間トランスフェクトしたMDA-MB-231細胞について浸潤アッセイを行った。トランスフェクションの48時間後、Matrigel(1 mg/mL)(BD Biosciences)を予めコーティングした24ウェルトランスウェルプレートのインサートに、細胞を播種した。血清含有培地およびフィブロネクチン(5μg/mL)を、化学誘引物質として下のチャンバーに添加した。24時間インキュベートした後、トランスウェルインサート上の細胞を洗浄して固定し、非浸潤細胞およびECマトリクスを綿棒で軽く除去した。下のチャンバーに位置する浸潤細胞を、記述されたように(Imam, et al., 2010)クリスタルバイオレット(0.1%)によって染色して、空気乾燥させて写真を撮影した。
(治療実験)
MDA-MB-231-GFP-luc細胞100,000個を尾静脈に注射した。腫瘍細胞注射後7日目から、RNALancerIIインビボ送達製剤(Bioo Scientific)と複合体を形成したhsa-miR-204オリゴ(n=6)またはhsa-miR-204変異体オリゴ(n=6)を、1 mgオリゴ/kg体重の割合で5日毎に30日間注射した。6回目の注射後に動物を全て屠殺した。肺を固定して、転移病変に関して分析した。蛍光顕微鏡を用いて(GFP+veおよびluc+ve病巣に関して)肺の画像を得た。hsa-miR-204注射マウスでは、転移および肝毒性を評価するために、肝臓も採取した。
(アポトーシスアッセイ)
75 nM hsa-miR-204模倣体または陰性対照模倣体をトランスフェクトしたHEK293またはHeLa細胞におけるアネキシンV/PI染色を、以前に記述されたように(32)FITCアネキシンVアポトーシス検出キット(BD Pharmingen)を用いて、三つ組ウェルで行った。
(免疫蛍光)
細胞を4%パラホルムアルデヒドによって固定して0.2%Triton X-100によって室温(RT)で15分間透過処理した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)によって洗浄し、PBS中で10%ヤギ血清によってRTで45分間ブロックした。細胞を、PBS中で希釈したRac1マウスモノクローナル抗体(ab33186、Abcam)と共にRTで2時間インキュベートした。細胞を3回洗浄した後、1:200 Alexa Fluor 647およびAlexa Fluor 488ファロイジンコンジュゲート二次抗体(A12379、Invitrogen, Molecular Probes)と共にRTで1時間インキュベートした。3回洗浄後、細胞を、DAPI(Polysciences)を含むAqua-Poly/Mount培地中でスライドガラスに載せた。光学顕微鏡写真をNikon Eclipse TE2000-U顕微鏡において倍率200倍で撮影した。
(統計分析)
グラフ中の全ての値およびエラーバーは、平均値±SEMである。それぞれのn値を図の説明文に示す。P値は両側Student t-検定により決定した。
(miR-296-5p阻害は、トリプルネガティブ乳癌におけるパクリタキセル応答の感受性を増加させる)
トリプルネガティブ乳癌細胞に、スクランブル対照またはmiR-296-5p阻害物質を3日間トランスフェクトした後、担体または8 nMパクリタキセルのいずれかによる処理をさらに2日間行った。細胞の生存率を、CellTiter-Glo(Promega Inc.)を用いて担体処理miR-296-5pトランスフェクト細胞と薬物処理miR-296-5pトランスフェクト細胞とのあいだで比較した。miR-296-5pの阻害により、パクリタキセルの存在下での細胞の生存率が有意に低下した。棒グラフは、溶媒対照(DMSO)またはパクリタキセル(8 nM)によって処理した対照およびmiR-296-5pトランスフェクト細胞におけるTNBC細胞生存率のパーセンテージを示す。図13。
(miR-296-5pは、トリプルネガティブ乳癌細胞の遊走および浸潤を阻害する)
トリプルネガティブ乳癌細胞に、スクランブル対照またはmiR-296-5p阻害物質を48時間トランスフェクトした。トランスフェクション後48時間目に、細胞をトリプシン処理して、無血清培地に再懸濁して、孔サイズ3μmのトランスウェルチャンバー(Corning, Corning, NY, USA)の上部にロードした。血清含有培地を、化学誘引物質として下のチャンバーに入れて、細胞を37℃でインキュベートし、走化性チャンバーの中に24時間遊走させた。チャンバー底部の遊走細胞を、10%ホルマリンで固定して、0.4%クリスタルバイオレットによって3時間染色した。実験を三つ組で繰り返して、遊走細胞を顕微鏡下で計数した。miR-296-5p阻害物質トランスフェクト細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較すると、有意により低い遊走能を示した。代表的な画像は、浸潤細胞を示す。Nikon顕微鏡を用いて写真を撮影した。図14。
(処置の効能)
TNBCの処置におけるこれらのmiRNAの効能をさらに確証するために、本発明者らは、エクスビボ腫瘍外植片モデルを用いた。新しく切除した乳癌組織を1 mm3標本に切断して、37℃およびCO2インキュベーター内で、ヒドロコルチゾンおよびインスリンを添加した外植片培地中で水和させたゼラチンスポンジ上に載せた。TNBC患者からの腫瘍外植片をパクリタキセルによって処理して、組織を優しく取り出し、10%中性緩衝ホルマリン溶液中で固定して、パラフィンブロックのために加工処理した。Ki67レベルを決定するためにIHC分析を行った。外科標本および外植片のIHCから、外植片が当初の外科標本の組織構築および増殖特性を保持していることが明らかとなる。意外にも外植片のパクリタキセル処理により、非再発TNBCにおけるKi67染色の阻害が明らかとなったが、進行期TNBCは、パクリタキセルに応答しなかった。図15。
(リポソーム製剤)
ゼラチンスポンジ上で増殖した腫瘍外植片を、増感剤miRNA(75 nM)単独、またはパクリタキセル(1μM)単独、またはmiRNA(75 nM)とパクリタキセル(1μM)の併用によって処理した。(外植片培地中に添加することによる)パクリタキセル単独の48時間処理によって、応答性TNBC(初期段階の癌)におけるKi67レベル(腫瘍細胞の増殖を示す)の有意な阻害が起こった。しかし、パクリタキセル処理によって、パクリタキセルに応答性ではない再発したTNBC外植片のKi67レベルに有意な変化は起こらなかった。リポソーム製剤を用いて増感剤miRNA(75 nM)のみを48時間添加すると、進行期TNBCの腫瘍外植片のKi67レベル(腫瘍細胞の増殖を示す)が中等度に阻害された。しかし、効果は、増感剤miRNA(75 nM)をパクリタキセル(1μM)と併用して用いた場合、はるかに強力であった。図16。
Claims (29)
- hsa-miR-204を含む、化学療法耐性のトリプルネガティブ乳癌(TNBC)細胞の増殖を低下させるための組成物であって、タキサンと併用され、hsa-miR-204の発現が低下している癌細胞を有するまたは有することが疑われる対象に投与されることを特徴とする、組成物。
- 癌細胞が、脳由来神経栄養因子(BDNF)またはエズリンを過剰発現する、請求項1記載の組成物。
- 癌細胞の増殖が転移性である、請求項1〜2のいずれか一項記載の組成物。
- 癌細胞におけるhsa-miR-204のレベルが決定される、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
- hsa-miR-204のレベルが、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)またはアレイハイブリダイゼーションを用いて決定される、請求項4記載の組成物。
- 対象から得た血液試料中のhsa-miR-204のレベルが決定される、請求項4または5のいずれか一項記載の組成物。
- 血液試料中のhsa-miR-204のレベルが、対照と比較して低下している、請求項6記載の組成物。
- 全身投与のために製剤化される、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
- 静脈内注射により投与される、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
- 脂質ベースの送達媒体またはナノ粒子ベースの送達媒体をさらに含む、請求項9記載の組成物。
- タキサンと同時に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
- タキサンが投与される前または後に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
- タキサンとの投与の時間間隔が1から30日である、請求項12記載の組成物。
- タキサンが投与された後に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項12または13のいずれか一項記載の組成物。
- 癌細胞がタキサンに対して耐性となっている、請求項1〜14のいずれか一項記載の組成物。
- タキサンがパクリタキセルである、請求項15記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
- 無菌性、発熱物質、および微粒子、または他の混入物に関する薬局方の要件を満たしている調製物である、請求項17記載の組成物。
- 調製物が全身投与のために製剤化されている、請求項17または18のいずれか一項記載の組成物。
- 対象が哺乳動物である、請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物。
- 対象がヒトである、請求項1〜20のいずれか一項記載の組成物。
- 対象の細胞におけるhsa-miR-204のレベルを決定する段階を含む、請求項1記載の組成物によるタキサンに対する化学療法耐性のTNBC細胞の増殖を低下させるための治療から効果が得られる可能性がある対象を同定するための方法。
- 対象の細胞におけるhsa-miR-204のレベルが、qRT-PCRまたはアレイハイブリダイゼーションを用いて決定される、請求項22記載の方法。
- 対象から得た血液試料中のhsa-miR-204のレベルが決定される、請求項23記載の方法。
- 血液試料中のhsa-miR-204のレベルが、対照と比較して低下している、請求項24記載の方法。
- 阻害されると、治療活性物質の亜致死濃度で培養したTNBC細胞の生存率を増加させる有望な増感剤miRNAをスクリーニングするための方法であって、
候補増感剤miRNAの阻害物質と共に治療活性物質の亜致死濃度を含むmiRNA阻害物質含有培養物中でTNBC細胞を培養する段階;
治療活性物質の亜致死濃度を含むが候補増感剤miRNAの阻害物質が添加されていないmiRNA阻害物質欠如培養物中でTNBC細胞を培養する段階;ならびに
一定期間後に、miRNA阻害物質含有細胞集団と、miRNA阻害物質欠如細胞集団の生存率を決定する段階であって、miRNA阻害物質含有細胞集団の生存率が、miRNA阻害物質欠如細胞集団の生存率より有意に高ければ、候補増感剤miRNAが有望な増感剤miRNAとして同定される、段階
を含み、
該有望な増感剤miRNAがhsa-miR-204であり、該治療活性物質がタキサンである、方法。 - 治療活性物質の亜致死濃度が、癌細胞株の細胞の80%が72時間培養後になおも生存可能である濃度である、請求項26のいずれか一項記載の方法。
- 治療活性物質がパクリタキセルである、請求項26または27のいずれか一項記載の方法。
- パクリタキセルの亜致死濃度が2〜8 nMである、請求項28記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261727481P | 2012-11-16 | 2012-11-16 | |
US61/727,481 | 2012-11-16 | ||
PCT/US2013/070350 WO2014078686A1 (en) | 2012-11-16 | 2013-11-15 | Mirnas as novel therapeutic adjuvants and biomarkers for the prognosis and treatment of drug resistant breast cancers |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016502527A JP2016502527A (ja) | 2016-01-28 |
JP2016502527A5 JP2016502527A5 (ja) | 2016-12-28 |
JP6478916B2 true JP6478916B2 (ja) | 2019-03-06 |
Family
ID=50731724
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015542832A Expired - Fee Related JP6478916B2 (ja) | 2012-11-16 | 2013-11-15 | 薬物耐性乳癌の予後判定および処置のための治療アジュバントおよびバイオマーカーとしてのmiRNA |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9730954B2 (ja) |
EP (1) | EP2919817A4 (ja) |
JP (1) | JP6478916B2 (ja) |
CN (1) | CN104884097B (ja) |
CA (1) | CA2930795A1 (ja) |
WO (1) | WO2014078686A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2686313C2 (ru) * | 2015-02-25 | 2019-04-25 | Байонир Корпорейшн | Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая микроРНК в качестве активного ингредиента |
CN106148538B (zh) * | 2016-08-09 | 2019-10-22 | 山东大学 | microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用 |
CN107970254A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-05-01 | 新乡医学院第附属医院 | miR-204及其靶基因在诊断和治疗骨肉瘤中的应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103866018B (zh) * | 2005-08-01 | 2016-05-25 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
AU2009219203B2 (en) * | 2008-02-28 | 2014-04-03 | The Ohio State University Research Foundation | MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia (AML) and uses thereof |
CN102076853A (zh) * | 2008-05-07 | 2011-05-25 | 阿布拉西斯生物科学有限责任公司 | 通过miRNA增强药物疗法 |
EP2354246A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-10 | febit holding GmbH | miRNA in the diagnosis of ovarian cancer |
-
2013
- 2013-11-15 CA CA2930795A patent/CA2930795A1/en not_active Abandoned
- 2013-11-15 US US14/442,896 patent/US9730954B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-11-15 WO PCT/US2013/070350 patent/WO2014078686A1/en active Application Filing
- 2013-11-15 CN CN201380065778.4A patent/CN104884097B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-11-15 JP JP2015542832A patent/JP6478916B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-11-15 EP EP13854326.9A patent/EP2919817A4/en not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-08-14 US US15/675,877 patent/US10617709B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2919817A4 (en) | 2016-10-19 |
US9730954B2 (en) | 2017-08-15 |
US20180177815A1 (en) | 2018-06-28 |
CN104884097A (zh) | 2015-09-02 |
US10617709B2 (en) | 2020-04-14 |
CA2930795A1 (en) | 2014-05-22 |
WO2014078686A1 (en) | 2014-05-22 |
US20150306127A1 (en) | 2015-10-29 |
EP2919817A1 (en) | 2015-09-23 |
CN104884097B (zh) | 2018-11-06 |
JP2016502527A (ja) | 2016-01-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kamerkar et al. | Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer | |
US10406128B2 (en) | Treatment and diagnosis of colon cancer | |
Hou et al. | Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles alleviated silica induced lung inflammation and fibrosis in mice via circPWWP2A/miR-223–3p/NLRP3 axis | |
Sun et al. | RETRACTED: MicroRNA-146-5p promotes proliferation, migration and invasion in lung cancer cells by targeting claudin-12 | |
US10617709B2 (en) | miRNAs as novel therapeutic adjuvants and biomarkers for the prognosis and treatment of drug resistant breast cancers | |
Blumental-Perry et al. | Retrograde signaling by a mtDNA-encoded non-coding RNA preserves mitochondrial bioenergetics | |
WO2015133522A1 (ja) | 大腸癌の治療剤、及び大腸癌患者の予後の予測方法 | |
Wang et al. | Novel lncRNA AL033381. 2 promotes hepatocellular carcinoma progression by upregulating PRKRA expression | |
Yan et al. | Delivery of anti-microRNA-21 by lung-targeted liposomes for pulmonary fibrosis treatment | |
WO2017207623A1 (en) | Mirna as biomarkers and regulators of cancer stem cells | |
US20220280590A1 (en) | Use of inhibitors of yap and sox2 for the treatment of cancer | |
JP2023512449A (ja) | Tap63制御された発がん性長鎖非コードrna | |
Dong et al. | Propofol inhibits the proliferation, invasion, migration, and angiogenesis of oral squamous cell carcinoma through circ_0008898‐mediated pathway | |
TW201932123A (zh) | 包含微小rna及其衍生物作為活性成分之藥物組成物 | |
EP3120853A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating stk11-mutation cancer using cardiac glycosides | |
WO2022044788A1 (ja) | 二本鎖核酸分子、dna、ベクター、女性がん細胞増殖抑制剤、女性がんの腫瘍形成抑制剤、医薬、及び長鎖非コードrnaの利用 | |
Tian et al. | LncRNA LLNLR-299G3. 1 promotes ESCC progression by regulating cancer related genes through RNA-chromatin interactions | |
CN114786683A (zh) | 一种siRNA、药物组合物以及使用其治疗糖尿病的方法 | |
US20200121710A1 (en) | Double-stranded nucleic acid molecule, dna, vector, cancer cell growth inhibitor, cancer cell migration inhibitor, and drug | |
Geng et al. | Lnc-FSD2-31: 1 in Pancreatic ductal adenocarcinoma promotes ATG7-mediated proliferation and fibrosis of cancer associated fibroblasts via exosome miR-4736 | |
WO2023181086A1 (en) | Micrornas for inhibiting the expression of trf2 in tumors | |
JP2016518812A (ja) | 線維症治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター | |
CA2680058C (en) | Induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation through modulation of carnitine palmitoyltransferase 1c activity | |
TW201233390A (en) | Small interfering RNAs and methods for prevention, inhibition and/or treatment of malignant progression of breast cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161111 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161111 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171004 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171227 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180718 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181016 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181120 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181206 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190108 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190205 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6478916 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |