JP2016518812A - 線維症治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター - Google Patents

線維症治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター Download PDF

Info

Publication number
JP2016518812A
JP2016518812A JP2015562042A JP2015562042A JP2016518812A JP 2016518812 A JP2016518812 A JP 2016518812A JP 2015562042 A JP2015562042 A JP 2015562042A JP 2015562042 A JP2015562042 A JP 2015562042A JP 2016518812 A JP2016518812 A JP 2016518812A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
fibrosis
differentiation
cell
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2015562042A
Other languages
English (en)
Inventor
アントニウス ジョゼフ ジャンセン リチャード
アントニウス ジョゼフ ジャンセン リチャード
ニコレテ レケルケルケル アンマリ
ニコレテ レケルケルケル アンマリ
アルビオウ ジャミル
アルビオウ ジャミル
オウウエハンド クリスタ
オウウエハンド クリスタ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galapagos NV
Original Assignee
Galapagos NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Galapagos NV filed Critical Galapagos NV
Publication of JP2016518812A publication Critical patent/JP2016518812A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/14—Antitussive agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/01—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.7.1)
    • C12Y107/01007—GMP reductase (1.7.1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01077—Protein-L-isoaspartate(D-aspartate) O-methyltransferase (2.1.1.77)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01014—Sedoheptulokinase (2.7.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01033—Pantothenate kinase (2.7.1.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04006—Nucleoside-diphosphate kinase (2.7.4.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/08—Transferases for other substituted phosphate groups (2.7.8)
    • C12Y207/08002—Diacylglycerol cholinephosphotransferase (2.7.8.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/10—Animals modified by protein administration, for non-therapeutic purpose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/30—Animals modified by surgical methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/12—Applications; Uses in screening processes in functional genomics, i.e. for the determination of gene function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/088—Assessment or manipulation of a chemical or biochemical reaction, e.g. verification whether a chemical reaction occurred or whether a ligand binds to a receptor in drug screening or assessing reaction kinetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Abstract

本発明は、線維化状態、特に線維芽細胞遊走及び分化に関連した疾患の治療において有用な物質を同定する方法及びアッセイに関する。本発明は、ポリペプチド及び核酸標的物、これらの標的物を基にしたsiRNA配列及び標的物に対する抗体を提供する。本発明は更に、線維化状態の治療における使用のための、標的物を基にしたsiRNA配列及び標的物に対する抗体を含有する医薬組成物に関する。本発明は更に、線維芽細胞遊走及び分化を阻害するインビトロ方法を提供する。【選択図】図1

Description

(発明の技術分野)
本発明は、分子生物学及び生化学の分野である。本発明は、線維化疾患の治療に有用な物質、特に線維芽細胞遊走及び分化を阻害する物質を同定する方法に関する。線維芽細胞遊走及び分化の阻害は、線維芽細胞遊走及び分化のプロセスが役割を果たす線維化状態及び他の疾患の予防及び／又は治療において有用である。特に本発明は、線維化疾患の予防及び／又は治療において使用するための物質を同定する方法を提供する。
（発明の背景）
線維症は、瘢痕組織の過剰な沈着により特徴づけられる。線維症は、それに対し治療法のない最大の疾患群の一つである。線維症は、肺、心臓、腎臓、肝臓及び皮膚が冒される様々な慢性疾患における、臓器不全に関連した罹患及び死亡の原因である。先進国での全死亡例のほぼ45％は、心臓血管疾患、肺線維症、糖尿病性腎症及び肝硬変を含む、線維化状態により引き起こされると推定される(Wynnらの文献、2004)。
線維症、特に特発性肺線維症は、注目が増しつつある疾患である。残念なことに、線維症の病因は、ほとんどわかっておらず、最近になってやっとこの疾患に寄与する様々な細胞プロセス及び分子プロセスが、明らかになってきている。全般的見解は、線維症は、感染症及び／又は組織損傷後の免疫及び修復反応の不均衡の結果であるということである(Lekkerkerkerらによる総説、2012)。これらの反応は、上皮細胞、線維芽細胞、マクロファージ、線維細胞、平滑筋細胞及び内皮細胞などの様々な細胞型の間の複雑な相互作用の結果である。これらの細胞型の1種以上の活性における不均衡は、線維症に寄与すると予想される。
線維性疾患の共通のテーマは、筋線維芽細胞と称される、線維芽細胞の特別な特定された型の異常な持続である(Gabbianiの文献、2003；Wynnの文献、2008)。TGFβ及び細胞外マトリクス(ECM)成分(例えば、I型コラーゲン及びフィブロネクチン)などの前線維化刺激の存在下において、線維芽細胞の筋線維芽細胞表現型への分化は、α-平滑筋アクチン(αSMA)の発現、I及びIII型コラーゲンの分泌並びに増大した遊走及び収縮性により特徴づけられる(Wynnの文献、2007)。これらの細胞は、過剰な創傷治癒及び細胞外マトリクスタンパク質(フィブロネクチン、コラーゲン、及び／又はラミニン)の過剰な沈着の原因となる。常在線維芽細胞の増殖、上皮間葉移行(EMT)を介した上皮細胞からの線維芽細胞の生成、循環線維細胞又は間葉系前駆細胞の分化を含む、線維芽細胞のいくつかの供給源が、提言されている。
線維芽細胞は、線維形成性病巣内の筋線維芽細胞のプールに主に寄与すると、一般に考えられている(Lekkerkerkerらの文献、2012)。この寄与に関する必須条件は、線維芽細胞の病巣への遊走と、それに続く増殖及び分化である。線維芽細胞を活性化し、これによりそれらの遊走及び／又は増殖の能力を増強する多くの因子が、長年かかって同定されている。これらは、増殖因子PDGF、CTGF及びTGFβのみではなく、ケモカイン、例えばCCL11(Puxedduらの文献、2006)、CCL21(Pierceらの文献、2007)、CCL24及びCCL26(Kohanらの文献、2010)も含む。
TGFβは、既述のEMTの増強を含むが、これに限定されるものではない、肺における線維形成プロセスに対し多くの多面的作用を有する多面発現性サイトカインである。TGFβアイソフォームは、ECM成分の多くの成分の沈着を調節し(Eickelbergらの文献、1999)、且つ線維芽細胞遊走及び筋線維芽細胞への分化の潜在能力に影響を及ぼす(Scottonらの文献、2007)ことが、既に示されている。
別の因子であるPDGFは、間葉系細胞の増殖因子として働き、PDGF-Aノックアウトマウスは、肺胞筋線維芽細胞前駆体を欠いているので、PDGFは筋線維芽細胞発達に必須であることが示されている(Bostromらの文献、1996)。
過去数十年にわたり、肺における線維化プロセスを調節する分子機序を解明するインビトロ及びインビボモデルの開発に、多くの努力が払われてきた(Lekkerkerkerらの文献、2012；Toddらの文献、2012)。しかし、生理的条件下及び疾患-関連状況において、これらの細胞を使用することは重要である。従って、機能ゲノムと組み合わせた、線維症に関連した機能アッセイにおいて初代細胞を利用する生物学的スクリーニングアッセイは、線維症に寄与する可能性のある分子機序への極めて貴重な洞察をもたらし、且つ線維症の治療のための新規遺伝子標的を同定することができる。
線維芽細胞遊走及び筋線維芽細胞への分化のプロセスは、依然余りわかっておらず、これは新たな理にかなった抗-線維化戦略の開発に必須である。従って、線維症の基礎となる分子及び細胞プロセス、特に線維芽細胞の生物学を理解し、且つ線維症及び線維症-関連状態の治療に有用な標的及び化合物を同定する新規方法を提供する必要性が明らかに存在する。
（発明の概要）
本発明は、本明細書に開示された標的物(TARGET)の発現及び／又は活性を阻害する物質は、線維芽細胞遊走の阻害並びに線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化のマーカーの発現及び／又は放出の阻害、特にα-平滑筋アクチンの放出又は発現の抑制により示されるように、線維芽細胞の分化及び遊走を阻害することが可能であるという発見を基にしている。従って、本発明は、線維芽細胞遊走及び分化において役割を果たす標的物、標的物の発現及び／又は活性をダウンレギュレートすることが可能な物質のスクリーニング方法、並びに線維性疾患、特に維芽細胞遊走及び分化に関連した疾患の予防及び／又は治療におけるこれらの物質の使用を提供する。本発明は、特に線維化疾患による、線維芽細胞の分化及び生物学に関与している標的物を提供する。特定の態様において、本発明は、線維化疾患の発症に関与しているかそうでなければ関連している標的物を提供する。
本発明は、線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって：被験化合物を、標的物ポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程；被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性又は該ポリペプチドの活性を決定する工程；被験化合物を、線維芽細胞集団と接触させる工程；線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに、線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能であり、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示すか、又は該ポリペプチドの活性を阻害することができるかのいずれかの化合物を同定する工程：を含む、方法に関連している。
本発明は更に、線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって：被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させ、且つ標的物ポリペプチドを発現させる工程；該細胞中の該ポリペプチドの発現及び／又は量を測定する工程；線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに、該ポリペプチドの発現及び／又は量を減少し、且つ線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、方法に関連している。
本発明は更に、線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程、並びに標的物ポリペプチドを発現する工程、該細胞における該ポリペプチドの発現及び／又は量を測定する工程、線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程、並びに該ポリペプチドの発現及び／又は量を減少させ、且つ線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む方法に関連している。
本発明は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：被験化合物を、標的物ポリペプチド、それらの断片及び構造的機能性誘導体と接触させる工程；被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性又は該ポリペプチドの発現若しくは活性を決定する工程；並びに、該ポリペプチドへの結合親和性を示し、及び／又は該ポリペプチドの発現若しくは活性を阻害することができる化合物として、線維芽細胞遊走及び分化の化合物を同定する工程：を含む、方法を提供する。
本発明はまた：
a)線維化状態の治療において使用するための、標的物ポリペプチドへ特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含む、医薬組成物、
b)線維化状態の治療において使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含む、医薬組成物であって、ここで該物質が、線維化状態の治療において使用するための、標的物ポリペプチドをコードしている選択された核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な核酸配列、又はこれから操作された核酸配列を含む、医薬組成物：に関する。
別の本発明の態様は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害するインビトロ方法であって、線維芽細胞の集団を、標的物ポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと接触させる工程を含む方法に関連している。
（図面の簡単な説明）
図1は、核のファロイジン染色及びDAPI染色を基にした画像セグメンテーションの原理を示す。
図2は、線維芽細胞スクラッチアッセイのアッセイ設定を概略している。
図3は、再スクリーンデータのドットプロットを示す。対照及び試料データは、ロバストZ-スコアを使用し、データを正規化した後に示している。
図4は、核のDAPI染色、及びTGFβにより誘発されないか又は誘発されるかのいずれかの細胞のαSMA染色を基にした画像セグメンテーション原理を示す。
図5は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への移行(FMT)アッセイのアッセイ設定を概略している。
図6は、FMTアッセイにおける対照及び試料を基にしたロバストZ-スコア正規化のドットプロットを示している。
図7は、「オン標的」アッセイにおける陰性対照を基にしたロバストZ-スコア正規化後の対照及び試料のドットプロットを示している。
図8は、CellTiter Blue(CTB)毒性アッセイの概略図を示している。
（詳細な説明）
（定義）
下記の用語は、以下に提示された意味を有することが意図され、且つ本発明の説明及び意図された範囲を理解する上で有用である。
用語「物質(agent)」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、天然の生成物及び小型分子を含む、任意の分子を意味する。特に用語物質は、被験化合物又は薬物候補化合物などの化合物を含む。
用語「活性阻害性物質」又は「活性阻害する物質」は、細胞内で又は細胞により通常発現される特定のポリペプチド又はタンパク質の活性と選択的に干渉するか又は干渉することが可能であるように設計された物質、例えばポリペプチド、小型分子、化合物などを意味する。
用語「アゴニスト」とは、最も広い意味で、受容体を刺激する物質及び受容体に結合する物質をいう。
本明細書において使用される用語「アンタゴニスト」は、受容体への結合時に生物学的反応それ自体は誘起しないが、アゴニスト-媒介性反応をブロックするか又は鈍らせる物質、或いはアゴニスト結合を防止するか又は減少させ、これによりアゴニスト-媒介性反応を防止するか又は減少させる物質を説明するように使用される。
用語「アッセイ」は、化合物を含む物質の特異的特性を測定するために使用される任意のプロセスを意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物の集合から化合物の活性を基に化合物を特徴づけるか又は選択するために使用されるプロセスを意味する。
用語「結合親和性」は、2種以上の化合物が非共有的関係でどの程度強力に互いに会合するかを説明する特性である。結合親和性は、定性的(「強」、「弱」、「高」若しくは「低」など)又は定量的(KDの測定など)に特徴づけることができる。
用語「担体」は、医薬組成物に媒体、バルク及び／又は使用に適した形状を提供するために、医薬組成物の製剤に使用される無毒の物質を意味する。担体は、賦形剤、安定剤、又は水性pH緩衝液などの1以上の然る物質を含むことができる。生理的に許容し得る担体の例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸を含む水溶性又は固形の緩衝成分；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(約10残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の糖類；EDTAなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又は、TWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(登録商標)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
用語「複合体」は、2種以上の化合物が互いに結合、接触又は会合した場合に作製された実体を意味する。
用語「化合物」は、本発明のアッセイに結びつけて説明される「被験化合物」又は「薬物候補化合物」の文脈で、本明細書において使用される。従って、これらの化合物は、合成により又は天然の給源から誘導された、有機化合物又は無機化合物を含む。本化合物は、無機化合物、又はポリヌクレオチド(例えば、siRNA若しくはcDNA)、脂質、又はホルモン類縁体などの有機化合物を含む。他の被験バイオポリマー性有機化合物は、ポリペプチドリガンド、酵素、受容体、チャネル、抗体又は抗体複合体を含む、約2〜約40個のアミノ酸からなるペプチド、及び約40〜約500個のアミノ酸からなるより大きいポリペプチドが挙げられる。
用語「状態」又は「疾患」は、症状(すなわち、病気)の顕性の提示又は異常な臨床指標(例えば、生化学指標)の出現を意味する。あるいは、用語「疾患」は、そのような症状若しくは異常な臨床指標の遺伝リスク若しくは環境リスク又はそれらを発症する素因をいう。
用語「接触」又は「接触する」は、インビトロシステム又はインビボシステムのいずれかにおいて、少なくとも2つの部分を一緒にすることを意味する。
用語「ポリペプチドの誘導体」は、例えば該ポリペプチドの天然に存在する形のアミノ酸配列と比べアミノ酸変異を有するポリペプチドなどの、該ポリペプチドの近接アミノ酸残基の部分配列を含み、且つタンパク質の生物活性を維持する、それらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素に関する。誘導体は更に、該ポリペプチドの天然に存在する形のアミノ酸配列と比べ、追加の天然の、改変された、グリコシル化された、アシル化された又は天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。これはまた、例えば該アミノ酸配列に共有的又は非共有的に結合されたリポーター分子又は他のリガンドなどの、該ポリペプチドの天然に存在する形のアミノ酸配列と比べ、1以上の非-アミノ酸置換基、又は異種アミノ酸置換基を含むこともできる。
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」は、例えば該ポリヌクレオチドの天然に存在する形の核酸配列に比べ核酸変異を有し得るポリヌクレオチドなど、該ポリヌクレオチドの核酸残基の部分配列を含む、DNA-分子、RNA-分子、及びオリゴヌクレオチドに関する。誘導体は更に、PNA、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチル-ホスホロチオエートなど修飾された骨格、天然に存在しない核酸残基、又はメチル-、チオ-、スルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1以上の核酸置換基、又はその検出を促進するためのリポーター分子を伴う核酸を含むことができる。
用語「内在性」とは、哺乳類が天然に生成する物質を意味するものとする。用語「酵素」、「プロテアーゼ」、「キナーゼ」又は「G-タンパク質共役受容体(‘GPCR’)」に関して内在性は、それが哺乳類(例えば、ヒトであるが、これに限定されるものではない)により天然に生成されることを意味するものとする。対照的に、この文脈において用語非-内在性は、それが哺乳類(例えば、ヒトであるが、これに限定されるものではない)により天然に生成されないことを意味するものとする。両方の用語は、インビボ及びインビトロの両システムを説明するために使用することができる。例えば、非限定的に、スクリーニングアプローチにおいて、内在性又は非-内在性標的物は、インビトロスクリーニングシステムに関してであってよい。非限定的な更なる例として、哺乳類のゲノムが非-内在性標的物を含むように操作される場合、インビボシステムによる候補化合物のスクリーニングが実行可能である。
用語「発現可能な核酸」は、タンパク質性分子、ペプチド又はポリペプチドをコードしている又はコードすることが可能である核酸を意味し、且つRNA分子、又はDNA分子を含むことができる。
用語「発現」は、形質導入による過剰発現を含む、内在性発現及び非-内在性発現の両方を含む。
用語「発現阻害性物質」又は「発現阻害する物質」は、例えば、細胞内で又は細胞により通常発現される特定のポリペプチド又はタンパク質の転写、翻訳及び／又は発現と選択的に干渉するか又は干渉することが可能であるように設計されたポリヌクレオチドなどの、物質を意味する。より特定の及び例として、「発現阻害性物質」は、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードしているポリリボヌクレオチド配列内の少なくとも約15〜30個、特に少なくとも17個の連続ヌクレオチドと同一又は相補的なヌクレオチド配列を含むDNA又はRNA分子を含む。そのような発現阻害性分子の例としては、リボザイム、マイクロRNA、二本鎖siRNA分子、自己相補的一本鎖siRNA分子、遺伝子アンチセンス構築体、及び、修飾され安定化された骨格を伴う合成RNAアンチセンス分子が挙げられる。
用語「RNAiインヒビター」とは、細胞又は生物において、RNA干渉機能又は活性をダウンレギュレート、減少又は阻害することができる任意の分子をいう。RNAiインヒビターは、RISCなどのタンパク質成分、又はmiRNA若しくはsiRNAなどの核酸成分を含む、RNAi経路の任意の成分の機能と相互作用又は干渉することにより、RNAiをダウンレギュレート、減少又は阻害する(例えば、RNAiが媒介した標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング)ことができる。RNAiインヒビターは、細胞又は生物において、RISC、miRNA、若しくはsiRNA又はRNAi経路の他の成分の機能と相互作用するか又は干渉する、siNA分子、アンチセンス分子、アプタマー、又は小型分子であることができる。RNAiの阻害(例えば、RNAiが媒介した標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング)により、本発明のRNAiインヒビターは、標的遺伝子の発現を調節する(例えば、ダウンレギュレートする)ために使用することができる。
本明細書で使用される用語「マイクロRNA」又は「miRNA」又は「miR」は、当該技術分野において一般に受け容れられたその意味をいう。より詳細には、この用語は、mRNA切断、翻訳抑制／阻害、又はヘテロクロマチンのサイレンシングのいずれかによる、標的メッセンジャーRNAの発現を調節する小型の二本鎖RNA分子をいう(例えば、Ambrosの文献、2004, Nature, 431, 350-355；Barrelの文献、2004, Cell, 116, 281-297；Cullenの文献、2004, Virus Research., 102, 3-9；Heらの文献、2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531；Yingらの文献、2004, Gene, 342, 25-28；及び、Sethupathyらの文献、2006, RNA, 12:192-197参照)。本明細書において使用されるこの用語は、天然に存在することができる成熟一本鎖miRNA、前駆体miRNA(pre-miR)、及びそれらの変種を含む。場合によっては、用語「miRNA」はまた、miRNA一次転写物及び二重鎖miRNAを含む。
用語「ポリヌクレオチドの断片」は、完全配列と実質的に類似しているが、必ずしも同一ではない活性を示す、近接核酸残基の部分配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。特定の態様において、「断片」は、該完全配列の核酸配列の少なくとも5個の核酸残基(好ましくは、少なくとも10個の核酸残基、少なくとも15個の核酸残基、少なくとも20個の核酸残基、少なくとも25個の核酸残基、少なくとも40個の核酸残基、少なくとも50個の核酸残基、少なくとも60個の核酸残基、少なくとも70個の核酸残基、少なくとも80個の核酸残基、少なくとも90個の核酸残基、少なくとも100個の核酸残基、少なくとも125個の核酸残基、少なくとも150個の核酸残基、少なくとも175個の核酸残基、少なくとも200個の核酸残基、又は少なくとも250個の核酸残基)の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドをいうことができる。
用語「ポリペプチドの断片」は、近接アミノ酸残基の部分配列を含み、且つ完全配列と実質的に類似しているが、必ずしも同一ではない機能又は発現活性を示す、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノマー、サブユニット及び酵素に関する。特定の態様において、「断片」は、該完全配列のアミノ酸配列の少なくとも5個のアミノ酸残基(好ましくは、少なくとも10個のアミノ酸残基、少なくとも15個のアミノ酸残基、少なくとも20個のアミノ酸残基、少なくとも25個のアミノ酸残基、少なくとも40個のアミノ酸残基、少なくとも50個のアミノ酸残基、少なくとも60個のアミノ残基、少なくとも70個のアミノ酸残基、少なくとも80個のアミノ酸残基、少なくとも90個のアミノ酸残基、少なくとも100個のアミノ酸残基、少なくとも125個のアミノ酸残基、少なくとも150個のアミノ酸残基、少なくとも175個のアミノ酸残基、少なくとも200個のアミノ酸残基、又は少なくとも250個のアミノ酸残基)のアミノ酸配列を含む、ペプチド又はポリペプチドをいうことができる。
用語「ハイブリダイゼーション」は、それにより核酸鎖が、塩基対合を介して相補鎖と結合する任意のプロセスを意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補塩基間の水素結合の形成により、2つの核酸配列の間で形成された複合体をいう。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中に形成される(例えば、C0t又はR0t分析)か、又は溶液中に存在する1つの核酸配列と固相(例えば、紙、メンブレン、フィルター、チップ、ピン若しくはガラススライド、又は細胞若しくはそれらの核酸が固定されている任意の他の好適な基板)上に固定された別の核酸配列の間に形成されることができる。用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチドとこの請求されたポリヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度、温度、及び当該技術分野において周知の他の条件により規定することができる。特に、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇は、ストリンジェンシーを増大することができる。用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方について、5×SSC及び65℃と実質的に同等の塩及び温度の条件をいう。しかし当業者は、そのような「標準ハイブリダイゼーション条件」は、緩衝液中のナトリウム及びマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列長さ及び濃度、ミスマッチの割合、ホルムアミドの割合などを含む特定の条件によって決まることを理解するであろう。また「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定において重要なものは、ハイブリダイズする2つの配列が、RNA-RNA、DNA-DNA又はRNA-DNAのいずれであるかである。そのような標準ハイブリダイゼーション条件は、周知の方式に従い当業者により容易に決定され、ここでハイブリダイゼーションは、典型的には予測又は決定されたTm以下の10-20NCで、望ましいならば、比較的高ストリンジェンシーの洗浄を伴う。
用語「反応」と関連する用語「阻害する」又は「阻害している」とは、反応が、化合物の非存在下とは対照的に、化合物の存在下で減少又は妨害されることを意味する。
用語「阻害」とは、タンパク質又はポリペプチドの発現又は活性の非存在又は最小化を生じるような、プロセスの減少、ダウンレギュレーション、又はプロセスの刺激の排除をいう。
用語「誘導」とは、タンパク質又はポリペプチドの発現、増強された発現、活性、又は増大された活性を生じる、プロセスの誘導、アップレギュレーション、又は刺激をいう。
用語「リガンド」は、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在する分子を意味する。
用語「医薬として許容し得る塩」とは、本明細書に開示された標的物の発現又は活性を阻害する化合物の無毒の無機及び有機の酸付加塩、及び塩基付加塩をいう。これらの塩は、本発明において有用な化合物の最終の単離及び精製期間に、現場で調製され得る。
用語「ポリペプチド」は、タンパク質(標的物など)、タンパク質性分子、タンパク質の断片、高分子タンパク質のモノマー又は一部、ペプチド、オリゴペプチド及び酵素(キナーゼ、プロテアーゼ、GPCRなど)に関する。
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖の形状の、及びセンス方向又はアンチセンス方向のポリ核酸、ストリンジェント条件下で特定のポリ核酸とハイブリダイズする相補性ポリ核酸、並びにその塩基対の少なくとも約60％が相同である、及びより特定するとその塩基対の70％が、特に80％、最も特定すると90％、及び特定の実施態様においてその塩基対の100％が共通である、ポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸、及びそれらの合成類縁体を含む。これはまた、ペプチド核酸(PNA)、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチルホスホロチオエートなどの、修飾された骨格を持つ核酸も含む。ポリヌクレオチドは、約10から約5000塩基、特に約100から約4000塩基、より特定すると約250から約2500塩基の範囲で、長さが変動する配列により説明される。一つのポリヌクレオチド実施態様は、長さ約10から約30の塩基から構成される。ポリヌクレオチドの特別な実施態様は、より一般的には低分子干渉RNA(siRNA−二本鎖siRNA分子又は自己相補性一本鎖siRNA分子(shRNA))として説明される、約17から約22ヌクレオチドのポリリボヌクレオチドである。別の特別な実施態様は、ペプチド核酸(PNA)、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチル-ホスホロチオエートなど修飾された骨格を伴う核酸、又は天然に存在しない核酸残基、又はメチル-、チオ-、スルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1以上の核酸置換基、若しくはその検出を促進するためのリポーター分子を含む核酸である。本明細書のポリヌクレオチドは、特定の標的DNA配列の異なる鎖に対し「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、これらのポリヌクレオチドは、それらの各鎖とハイブリダイズするのに十分に相補性でなければならないことを意味する。従って、必要なポリヌクレオチド配列は、標的配列の正確な配列を反映しない。例えば、非-相補的ヌクレオチド断片は、該ポリヌクレオチドの5'末端に結合され、該ポリヌクレオチド配列の残りは、この鎖と相補的である。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下でそれらとハイブリダイズするか、又は伸長生成物の合成のための鋳型を形成するために、鎖の配列と十分な相補性を有することを条件として、非-相補的塩基又はより長い配列が、このポリヌクレオチドへ散在されることができる。
用語「予防する」又は「予防」とは、疾患-原因物質に曝露され得る対象、又は疾患発症の前に疾患の素因のある対象において、疾患又は障害を獲得又は発症するリスクの低下(すなわち、疾患の臨床症状の少なくとも一つが発症しないことを引き起こす)をいう。
用語「発症予防」は、用語「予防」に関連し、且つこれを包含しており、その目的が、疾患の治療若しくは治癒よりもむしろ予防である方策又は手順をいう。発症予防的方策の非限定的例は、ワクチン投与；例えば不動状態(immobilization)に起因した血栓症のリスクのある入院患者への低分子量ヘパリンの投与；並びに、マラリアが風土病であるか又はマラリアとの接触リスクの高い地理的領域を訪問する前の、クロロキンなどの抗-マラリア薬の投与を含み得る。
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳類を含む。
用語「標的物」又は「標的物（複数）」は、本明細書記載のアッセイにより同定され、且つ線維芽細胞遊走及び分化に関与することが決定されたタンパク質(複数可)を意味する。用語標的物又は標的物（複数）は、代替の種の形状、アイソフォーム、並びにスプライシング変種、対立遺伝子変種、選択的インフレームエクソン、及び代替部位若しくは中途終止部位若しくは開始部位などの変種を含むか又は企図し、これは、表1に記されたような、それらの既知の若しくは認められたアイソフォーム若しくは変種を含む。NCBI寄託番号は、当業者が転写物及びポリペプチドを同定するのを補助するために提供されている。しかし用語標的物又は標的物（複数）は、これらの配列の特定の型に限定されず、且つこれらの配列に対応する核酸及びポリペプチドの機能的変種を包含している。
「治療的有効量」又は「有効量」は、医師又は他の臨床従事者により考えられるか又は容認される、対象の生物学的反応又は医学的反応を引き起こす化合物又は物質の量を意味する。
用語任意の疾患又は障害を「治療する」又は「治療」とは、一実施態様において、疾患又は障害を改善する(すなわち、疾患を阻止するか、又はそれらの臨床症状の少なくとも一種の出現、程度若しくは重症度を軽減する)ことをいう。従って「治療する」とは、治療的処置及び発症予防的若しくは予防的方策の両方をいう。治療を必要とするものは、既に障害を伴うものに加え、障害が予防されるべきものを含む。本明細書で使用される関連用語「治療」とは、障害、症状、疾患又は状態を治療する行為をいう。別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、対象により認識されるものではない、少なくとも一つの理学的パラメータの改善をいう。更に別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、理学的(例えば、認識できない症状の安定化)、生理学的(例えば、理学的パラメータ又は生理学的に測定可能なパラメータの安定化)、又は両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することをいう。更なる実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、疾患の進行を遅らせることに関係する。
用語「ベクター」はまた、プラスミドに加え、組換えウイルスなどのウイルスベクター又は組換えウイルスをコードしている核酸に関係する。
用語「脊椎動物細胞」は、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、有袋類及び哺乳類の種を含む、脊椎構造を有する動物由来の細胞を意味する。好ましい細胞は、哺乳類種に由来し、最も好ましい細胞は、ヒト細胞である。哺乳類の細胞は、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス及びラットなどのマウス類、並びにウサギを含む。
本明細書において使用される用語「線維化疾患」とは、特に細胞外マトリクスの過剰な若しくは異常な生成、沈着に起因した、過剰な又は持続性の瘢痕化により特徴づけられる疾患をいい、且つ細胞及び／若しくはフィブロネクチン及び／若しくはコラーゲンの異常な蓄積、並びに／又は増大した線維芽細胞動員に関連しているものであり、且つ例えば心臓、腎臓、肝臓、関節、肺、胸膜組織、腹膜組織、皮膚、角膜、網膜、骨格筋及び消化管などの、個々の臓器又は組織の線維症を含むが、これらに限定されるものではない。特定の態様において、用語線維化疾患とは、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症及びペイロニー病をいう。より特定すると、用語「線維化疾患」は、特発性肺線維症(IPF)をいう。
用語「線維芽細胞」又は「繊維芽細胞（複数）」とは、間葉系前駆細胞由来の細胞であって、平坦化された不規則な形状の結合組織中に存在する細胞をいい、且つI型コラーゲン及びヒアルロン酸を含む、細胞外マトリクス因子の成分を生成及び／又は分泌することにより、線維性結合組織中に遍在する、細胞(複数可)の構造フレームワークを提供する。
用語「筋線維芽細胞」とは、高レベルのアルファ平滑筋アクチン(αSMA)を発現し且つαSMAについて陽性である、線維芽細胞から平滑筋細胞-様表現型へ分化される線維芽細胞へ移行した線維芽細胞をいう。
用語「線維芽細胞遊走及び分化」又は「線維芽細胞遊走及び移行」とは、各々、線維芽細胞遊走及び筋線維芽細胞への分化(又は代わりに移行)のプロセスをいう。そのようなプロセスは、線維化状態の発症及び進展において役割を果たすことがわかっている。特定の態様において、線維芽細胞分化及び遊走は、同時に生じてはならない。これらのプロセスは各々独立して、線維化状態の進展に係わる。線維芽細胞遊走は、直接又は間接に線維症に寄与する線維芽細胞の過度の蓄積に繋がり得る。線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化(又は移行)は、線維症の発症及び進展に寄与する過度の細胞外マトリクス因子を生成する細胞型の形成に繋がる。
（標的物）
本出願人の発明は、線維性疾患の治療、予防及び緩和に関連している。
本発明は、線維芽細胞遊走及び分化の天然に存在するインビボプロセスの科学的に実証された代替物を提供するのに適したインビトロ(無細胞又は細胞ベース)アッセイシステムを開発するための、本発明者らの集中的な研究を基にしている。線維芽細胞遊走及び分化のプロセスは、線維症に関与することがわかっているが、これは複雑なプロセスである。本発明は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害することができる化合物の同定、従って線維症の治療及び／又は予防に有用である化合物の同定に適した、天然のシステムの人工モデルを提供する。
本発明は、本化合物を標的物を発現している細胞と接触させること、並びに本化合物の存在及び／又は非存在下で、線維芽細胞遊走及び分化の阻害の相対量又は程度を決定することを含む、線維化状態を治療するのに有用な薬物候補化合物をアッセイする方法を提供する。本発明は、本化合物を標的物を発現している細胞と接触させること、並びに標的物の発現又は活性の阻害の相対量又は程度を決定することを含み、これにより標的物の発現又は活性の阻害は、本化合物の存在及び／又は非存在下で、線維芽細胞遊走及び／又は分化の阻害又は減少に関連しているか又はこれを生じる線維化状態を治療するのに有用な、特に線維芽細胞遊走及び／又は分化を減少するのに有用な、薬物候補化合物をアッセイする方法を提供する。そのような方法は、該分化を阻害するように作用する標的タンパク質を同定するために使用することができ；或いは、これらは、標的物タンパク質の発現又は活性をダウンレギュレート若しくは阻害する化合物を同定するために使用することができる。本発明は、標的物の発現又は活性が測定され得る条件下で、本化合物を標的物と接触させること、並びに標的物の発現又は活性が、本化合物の存在下で変更されたかどうかを決定すること、線維芽細胞の集団を、該被験化合物と接触させること、並びに線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定することを含む、線維症を治療するのに有用な薬物候補化合物をアッセイする方法を提供する。そのような方法の例は、当業者により設計され且つ決定され得る。特定のそのような例証的方法が、本明細書に提供されている。
本発明は、「実施例」において以下に説明されるスクリーンの結果として同定される、標的物ポリペプチド及びそれらをコードしている核酸は、線維症、特に線維芽細胞遊走及び分化に関連した因子であるという、本発明者らの発見を基にしている。標的物ポリペプチド及び／又はそれらをコードしているポリヌクレオチドの低下した活性又は発現は、低下又は阻害された線維芽細胞遊走及び分化の原因となるか、これと相関又は関連している。或いは、標的物ポリペプチド及び／又はそれらをコードしているポリヌクレオチドの低下した活性又は発現は、線維芽細胞分化のマーカーの減少の原因となるか、これと相関又は関連している。
本発明の特定の実施態様において、標的物ポリペプチドは、表1に列記された配列番号:57-112からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
Figure 2016518812
Figure 2016518812
Figure 2016518812
本発明の特定の実施態様は、配列番号:57、58及び84として同定されるGPCR標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:60、61、62、63及び83として同定されるキナーゼ標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:59及び65として同定されるプロテアーゼ標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:64及び76として同定される分泌型/細胞外標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:66、77-82として同定される転移酵素標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:67-70として同定される酸化還元酵素標的物を含む。本発明の特定の実施態様は、配列番号:71-75、85-112として同定されるイオンチャネル標的物を含む。
（発明の方法）
一態様において、本発明は、線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程；
c)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程；
d)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能で、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
更なる態様において、本発明は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそれらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程；
c)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程；
d)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能で、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
一態様において、本発明は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はその機能性誘導体と接触させる工程；
b)被験化合物の該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を同定及び／又は測定する工程；
c)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程；
d)線維芽細胞遊走又は分化に関連した又は指標とする特性を測定する工程；並びに
e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害又は減少することが可能な化合物を同定し、且つ該ポリペプチド又は核酸への結合親和性を示す工程：を含む、方法に関する。
前記方法の更なる態様において、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はその機能性誘導体は、配列番号:1-56からなる群から選択され得る。
これらの測定を行う順番は、本発明の実践に重要であるとは考えられず、これは、任意の順番で実践することができる。本方法の特定の態様において、工程(c)及び(d)は、工程(a)及び(b)を実践する前に行うことができる。例えば、最初に、ポリペプチドに対する化合物の結合親和性に関する情報が分かっていないような化合物のセットのスクリーニングアッセイを行うことができる。或いは、ポリペプチドドメインについて結合親和性を有すると同定された化合物のセット、又はポリペプチドのインヒビターであると同定された化合物のクラスを、スクリーニングすることができる。
別の態様において、工程(a)-(d)の方法はまた、被験化合物を線維芽細胞の集団と接触させ、被験化合物の標的物ポリペプチドへの結合親和性及び線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定し、並びに線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能であり且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定することにより、細胞-ベースのアッセイにおいて同時に行うこともできる。
化合物のポリペプチド標的物との結合親和性は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore(登録商標))の使用、標識された化合物による飽和結合分析により(例えば、Scatchard及びLindmo分析)、示差UV分光計、蛍光偏光アッセイ、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR(登録商標))システム、蛍光共鳴エネルギー移動、及び生物発光共鳴エネルギー移動によるなどの、当該技術分野において公知の方法により測定することができる。化合物の結合親和性はまた、解離定数(Kd)で又はIC50若しくはEC50として表すこともできる。IC50は、別のリガンドの該ポリペプチドへの結合の50％阻害に必要とされる化合物の濃度を表す。EC50は、標的物機能を測定する任意のアッセイにおいて最大効果の50％を得るのに必要とされる濃度を表す。解離定数Kdは、リガンドがどの程度良好にポリペプチドへ結合するかの測定値であり、これは、該ポリペプチドの結合部位の正確に半分を飽和するのに必要とされるリガンド濃度と等しい。高親和性結合を持つ化合物は、例えば100nM〜1pMの範囲である、低いKd、IC50及びEC50値を有し；中等度-から低-結合親和性は、例えばマイクロモル範囲の、高いKd、IC50及びEC50値に関連している。
一態様において、アッセイ方法は、標的物ポリペプチドを、マイクロモル範囲の結合親和性を示す化合物と接触させることを含む。ある態様において、示された結合親和性は、少なくとも10マイクロモルである。ある態様において、結合親和性は、少なくとも1マイクロモルである。ある態様において、結合親和性は、少なくとも500ナノモルである。
特定の態様において、被験化合物は、標的物クラスに結合するその能力を基に、又は標的物クラスに結合する能力を有する化合物の公知のライブラリーから、選択される。
更なる態様において、本発明は、線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
c)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程；
d)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害すること、及び該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
追加の態様において、本発明は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、接触させる工程；
b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
c)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程；
d)線維芽細胞遊走又は分化に関連している特性を測定する工程；並びに
e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、方法に関する。
更なる態様において、本発明は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と、又は配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と、接触させる工程；
b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程；
c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、線維芽細胞遊走又は分化の阻害を生じるか又はこれに関連している工程：を含む、方法に関する。
前記方法の追加の態様において、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸又はそれらの機能性誘導体は、配列番号:1-56からなる群から選択され得る。
前述の方法及び更に本明細書に提供される方法は、瘢痕化及び／又は創傷治癒において、並びに特に瘢痕化の阻害若しくは最小化に有用な、及び／又は創傷、損傷、移植などの過度の又は望ましくない瘢痕化を最小化することによる効果的な、創傷治癒の媒介に有用な化合物の同定において適用され得ることが意図されている。
これらの測定を行う順番は、本発明の実践に重要であるとは考えられず、これは、任意の順番で実践することができる。本方法の特定の態様において、工程(c)及び(d)は、工程(a)及び(b)を実践する前に行うことができる。例えば、最初に、ポリペプチドに対する化合物の結合親和性に関する情報が分かっていないような化合物のセットのスクリーニングアッセイを行うことができる。或いは、ポリペプチドドメインについて結合親和性を有すると同定された化合物のセット、又はポリペプチドのインヒビターであると同定された化合物のクラスを、スクリーニングすることができる。
表1は、同定されたポリペプチドのクラスを含む、本明細書に例示された線維芽細胞遊走及び分化アッセイにおける出願者のノックダウンライブラリーを用い同定された標的物を列挙している。標的物は、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、酵素、イオンチャネル、GPCR、及び細胞外タンパク質を含む、ポリペプチドクラスにおいて同定されている。当業者は、無細胞調製に加え、細胞-ベースのアッセイの両方においてそれらのクラスの活性を測定する様々な方法を知っているであろう。様々な方法が存在し、且つ特定の標的に適合されている。それらの適合は、慣習的実験に関する問題であり、現存する技術及び方法に頼っている。いくつかの例証的方法を、本明細書に記載している。
イオンチャネルは、膜タンパク質複合体であり、且つそれらの機能は、生体膜を超えたイオンの拡散を促進することである。膜、又はリン脂質二重層は、親水性で帯電した分子に対し、疎水性低誘電性障壁を構築する。イオンチャネルは、膜の疎水性内部を超える高伝導性の親水性経路を提供する。イオンチャネルの活性は、古典的パッチクランプ法を用い、測定することができる。ハイスループット蛍光-ベースの又はトレーサー-ベースのアッセイも、イオンチャネル活性を測定するために、広範に利用可能である。これらの蛍光-ベースのアッセイは、イオンチャネルを開閉するいずれかのそれらの能力を基に、膜を超える特異的蛍光色素の濃度の変化により、化合物をスクリーニングする。トレーサー-ベースのアッセイの場合、細胞内又は細胞外のトレーサーの濃度の変化は、放射能測定又はガス吸収分析により測定される。
プロテアーゼであるポリペプチドによる基質の切断を測定することにより、化合物による阻害を決定する具体的方法は、当該技術分野において周知である。伝統的に、標的プロテアーゼにより切断され得る基質であるペプチド配列を介して、蛍光基が消光物質に連結されている基質が使用される。リンカーの切断は、蛍光基と消光物質を分離し、蛍光の増加を生じる。
G-タンパク質共役受容体(GPCR)は、エフェクタータンパク質を活性化することが可能であり、結果的に細胞内のセカンドメッセンジャーレベルの変化を生じる。配列番号:57、58及び84により表される標的物は、GPCRである。GPCRの活性は、そのようなセカンドメッセンジャーの活性レベルを測定することにより、測定することができる。細胞内の2種の重要で有用なセカンドメッセンジャーは、サイクリックAMP(cAMP)及びCa2+である。それらの活性レベルは、ELISA若しくは放射能技術によるか、又はCa2+と接触した場合に蛍光若しくは化学発光シグナルを生じる基質を使用することにより直接的に、或いはレポーター遺伝子分析により間接的にのいずれかで、当業者に公知の方法により、測定することができる。1種以上のセカンドメッセンジャーの活性レベルは通常、プロモーターにより制御されるレポーター遺伝子により決定され、ここでプロモーターは、該セカンドメッセンジャーに反応する。そのような目的で当該技術分野において公知で使用されるプロモーターは、細胞内のサイクリック-AMPレベルに反応するサイクリック-AMP反応性プロモーター、及び細胞内の細胞質Ca2+-レベルに感受性があるNF-AT反応性プロモーターである。レポーター遺伝子は通常、容易に検出可能な遺伝子産物を有する。レポーター遺伝子は、宿主細胞において安定して感染されるか又は一過性にトランスフェクションされるかのいずれかであることができる。有用なレポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、増強された緑色蛍光タンパク質、不安定化された緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼがある。
別の態様において、本関連(the present relation)は、線維症治療に有用な化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させ、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる工程；
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現及び／又は量を測定する工程；
c)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
d)該ポリペプチドの発現及び／又は量の減少を生じ、且つ線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、方法に関係する。
別の態様において、本関連は、線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：
a)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させ、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる工程；
b)該細胞中の該ポリペプチドの発現及び／又は量を測定する工程；
c)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
d)該ポリペプチドの発現及び／又は量の減少を生じ、且つ線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、方法に関係する。
特定の態様において、標的物への結合又は活性の測定に関連した本発明の方法工程は、該標的物ポリペプチドを発現するように操作された哺乳類細胞、特にヒト細胞の集団で行われる。代替の態様において、本発明の方法は、該標的物ポリペプチドを発現するように操作された線維芽細胞の集団を用いて行われる。これは、当業者に公知の好適な技術を使用し、細胞内の標的物ポリペプチドの発現により達成され得る。具体的実施態様において、これは、当業者に公知の好適な技術を使用し、細胞における標的物ポリペプチドの過剰発現により達成され得る。或いは、本発明の方法は、該標的物ポリペプチドを天然に発現することが知られている線維芽細胞の集団により行われてもよい。
特定の態様において、標的物ポリペプチドの発現及び／又は量の測定と、線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性の測定は、マクロファージ細胞の異なる集団を用い、個別の工程において行うことができる。これらの測定を行う順番は、本発明の実践に重要であるとは考えられず、これは、任意の順番で実践することができる。例えば、工程(b)及び(c)における測定はまた、逆順で行うことができる。線維芽細胞遊走又は分化に関連した少なくとも1つの特性の測定で十分であるが、当業者は、該特性の一連の測定及びいくつかの測定を行うことができる。
ポリペプチドの活性又は発現を測定する一つの特定の手段は、抗体などのポリペプチド結合物質を使用し、該ポリペプチドの量を決定すること、又は生物学的測定若しくは生化学的測定において該ポリペプチドの活性を、例えばキナーゼポリペプチドの標的のリン酸化の量を決定することである。
標的物遺伝子発現(mRNAレベル)は、当業者に周知の技術を用い、測定することができる。そのような技術の特定例は、ノーザン分析又はリアルタイムPCRを含む。それらの方法は、試料中の標的物をコードしている核酸の存在の指標であり、これによりポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関させる。
細胞集団は、例えば培地内の直接インキュベーションによるか、又は細胞への核酸導入によるなど、異なる手段により、化合物へ又は化合物の混合物へ曝露することができる。そのような導入は、例えば、裸の単離されたDNA又はRNAの直接トランスフェクションによるか、又は組換えベクターなどの送達システムの手段によるなど、多種多様な手段により達成されてよい。リポソーム、又は他の脂質-ベースのベクターなどの他の送達手段も、使用されてよい。特に、核酸化合物は、組換えウイルスなどの、(組換え)ベクターにより、送達される。
インビボにおける標的物調節の更なる評価を含む、本発明において同定された物質又は化合物の更なる又は追加のスクリーニング、評価及び／又は検証のために、線維化疾患のインビボ動物モデルを、当業者は利用することができる。そのような動物モデルは、肺線維症に関するブレオマイシンモデル、照射モデル、シリカモデル、(誘導性)トランスジェニックマウスモデル、FITCモデル、養子移入モデル(Bethanyらの文献、2008)、腎線維症に関するコラーゲン4a3(COL4A3)-欠損モデル、腎毒性血清腎炎モデル及び一側性尿管閉塞モデル(Zeisbergらの文献、2005)、並びに肝線維症に関してCCL4中毒モデル(Starkelらの文献、2011)を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法における線維芽細胞の集団は、純粋でなければならないことはなく、特定程度の純度が要求される。該細胞の一部が線維芽細胞である哺乳類細胞の集団は、本発明の方法の実践に十分である。線維芽細胞の集団は、臓器から直接入手するか、或いは好適な培地を用い成長させることができることは理解されるべきである。線維芽細胞は、Epithelix社又はLONZA社などの商業的供給業者から入手することができる。
具体的実施態様において、本方法は、試験される化合物を対照と比較する工程を追加的に含むことができる。好適な対照は、偽陽性の読み値を防ぐことを確実にするために適所に常に配置される。本発明の特定の実施態様において、スクリーニング法は、化合物を好適な対照と比較する追加工程を含む。一実施態様において、対照は、被験化合物と接触されない細胞又は試料であってよい。代替の実施態様において、対照は、標的物を発現しない細胞であってよく；例えば、そのような実施態様の一態様において、被験細胞は、標的物を天然に発現し、且つ対照細胞は、例えば標的物の発現を阻害又は妨害するsiRNAなどの物質と接触されてよい。或いは、そのような実施態様の別の態様において、細胞は、その未変性状態では、標的物を発現せず、且つ被験細胞は、標的物を発現するように操作され、その結果この実施態様において、対照は、形質転換されない未変性細胞であることができる。対照はまた、代わりに線維芽細胞遊走又は分化の公知のインヒビター又は線維芽細胞遊走又は分化に対しいかなる有意な作用も有さないことがわかっている化合物を利用することもできる。対照の例は本明細書に記載されているが、これは限定としてとらえられるべきではなく；当業者の範囲内で、使用される実験条件に関して適した対照が選択される。
陰性対照の例は、任意の化合物により処理されていない細胞、線維芽細胞遊走又は分化のインヒビターではないことが分かっている化合物、線維芽細胞遊走又は分化に関連した経路と干渉しないことがわかっている化合物により処理された細胞を含むが、これらに限定されるものではない。陽性対照の例は、CXCR4、COLIA1、PIK3C3、PGK及びMAPK14の活性又は発現を阻害することがわかっている化合物と接触された細胞、線維芽細胞遊走又は分化を阻害することがわかっている化合物と接触された細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
特定の実施態様において、結合及び活性の試験方法は、インビトロ無細胞調製物中で行われる。
代替の実施態様において、本発明の方法における結合及び活性の試験は、細胞中で行われる。
本発明の方法の特定の態様において、活性及び結合の試験は、哺乳類細胞において行われる。より詳細には、これらの工程は、線維芽細胞において行われる。特定の実施態様において、これらの工程は、ヒト肺線維芽細胞において行われる。本発明の具体的態様において、これらの方法は、単層に存在する哺乳類細胞の集団で行われ、好ましくは該哺乳類細胞は線維芽細胞であり、より好ましくは、該哺乳類細胞はヒト肺線維芽細胞である。
ポリペプチドを発現している細胞は、該ポリペプチドを天然に発現する細胞であってよいか、又は細胞は、該ポリペプチドを発現するようにトランスフェクトされてよいことは理解されなければならない。また、細胞は、該ポリペプチドを過剰発現するように形質導入されてよいか、又は異なる様にアッセイ又は評価され得る該ポリペプチドの非-内在型を発現するようにトランスフェクトされてよい。
細胞において標的物ポリペプチドを発現しているポリヌクレオチドは、ベクター内に含まれてよい。ポリ核酸は、核酸配列の発現を可能にするシグナルに機能的に連結され、且つ特に組換えベクター構築体を利用し、細胞へ導入され、一旦ベクターが細胞へ導入されると、該核酸を発現するであろう。アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターシステムを含む、様々なウイルス-ベースのシステムが利用可能である。全ては、標的細胞において標的物ポリペプチドを導入し発現するために使用することができる。
更なる態様において、本発明の方法は、線維芽細胞遊走に関連している特性の測定に関与している。線維芽細胞遊走を測定する様々な方法が存在する。特定の態様において、そのような特性は、線維芽細胞の単層のスクラッチの測定である。更に、トランスウェルシステム／Boyden Chamberアッセイ及び低速度撮影(time-lapse)実験を用い、線維芽細胞遊走を測定することもできる。
具体的実施態様において、本発明の方法は、線維芽細胞遊走を誘導する因子(遊走-誘導因子)により誘発されている細胞を利用する。多くの然る因子が、文献に記載されており、これらは当業者に周知である。特定の実施態様において、本発明の方法は、CCL(CCL3、CCL7、CCL13、CCL27、CCL22、CCL21、CCL15、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20)、CXCL(CXCL1、CXCL8、CXCL12)、IL13、CTGF、PDGF-BBからなる群から選択される1以上の遊走-誘導因子により誘発された細胞を利用する。より具体的実施態様において、本発明の方法は、PDGF-BBにより誘発された細胞を利用する。具体的態様において、これらの細胞は、遊走-誘導因子及び血清により誘発されている。
別の実施態様において、本発明のアッセイ方法は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化に関連した特性の測定に関与している。
特定の実施態様において、本発明のアッセイ方法は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化のマーカーの生成及び／又は発現の減少の測定に関与している。
多くの線維芽細胞分化マーカーが、当業者に公知である。そのようなマーカーの選択は、具体的アッセイデザインに関連した、試薬の利用可能性、実践されるアッセイ方法の規模及び他の因子によって決まる。具体的実施態様において、線維芽細胞分化マーカーは、α-平滑筋アクチン、コラーゲン、及び結合組織増殖因子からなる群から選択される。具体的実施態様において、該マーカーは、α-平滑筋アクチンである。
特定の実施態様において、本発明の方法は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化因子により誘発された細胞を利用する。具体的実施態様において、該線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化因子は、TGFβである。
アッセイ設定及びスループットに応じて左右される、分化マーカーを測定する手段は、当業者に公知である。ヒトELISAは市販されているが、それらの感度は、低レベルのこれらのマーカーを常には検出しない。従って、アッセイは、シグナル伝達分子が、抗体により特異的に捕獲され且つ検出されるサンドイッチイムノアッセイとして、メソスケールディスカバリープラットフォーム(MSD)(Meso Scale Discovery社、メリーランド州、米国)上で最適化され得る。MSD技術は、プレートの底に一体化された炭素電極を備えたマイクロ-プレートを利用し；生物学的試薬は、単純に受動吸着によりその炭素へ固定され、高い生物活性を維持する。MSDアッセイは、超高感度検出のために、電気-化学発光標識を使用する。この検出プロセスは、マイクロ-プレートの底に配置された電極で始まる。電極の近傍の標識のみが励起され、低下したバックグラウンドシグナルが検出される。そのようなアッセイのための抗体は、様々な製造業者から購入することができ、当業者は、アッセイを行うための正確な抗体を選択する立場にある。
或いは、線維芽細胞分化マーカーの発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR/qPCR/qrt-PCR)を含む公知の方法を用いて、測定することができる。qPCRは、PCRを基にした実験技術であり、これは標的化されたDNA分子を増幅し且つ同時に定量するために使用される。DNA試料中の1以上の特異的配列に関して、リアルタイムPCRは、検出及び定量の両方を可能にする。この量は、コピーの絶対数又はDNAインプット又は追加の規準化遺伝子に対し規準化された場合の相対量のいずれかであることができる。
（候補化合物）
（発現阻害性物質）
本発明の方法の特定の実施態様において、被験化合物は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される。
これらの方法の特別な実施態様は、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、配列番号:57-112をコードしているポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号:1-56に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同である低分子干渉RNA(siRNA)又はマイクロRNA(miRNA)からなる群から選択される発現-阻害性物質を含み、その結果siRNAは、標的物ポリリボヌクレオチドの標的物ポリペプチドへの翻訳を妨害する。
アンチセンス核酸を使用する遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳又は転写レベルで達成され得る。本発明のアンチセンス核酸は、特に、標的物ポリペプチドをコードしている核酸又は対応するメッセンジャーRNAの全て又は一部と特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸断片である。加えて、その一次転写物のスプライシングを阻害することにより、標的物ポリペプチドをコードすることが可能な核酸配列の発現を減少するアンチセンス核酸が、設計され得る。任意の長さのアンチセンス配列が、標的物をコードしている核酸の発現をダウンレギュレート又はブロックすることが可能である限りは、これが本発明の実践に適している。特に、このアンチセンス配列は、長さが少なくとも約15〜30、特に少なくとも17ヌクレオチドである。アンチセンス核酸の調製及び使用、アンチセンスRNAをコードしているDNA、並びにオリゴ及び遺伝子アンチセンスの使用は、当該技術分野において公知である。
より具体的実施態様において、被験化合物は、標的物ポリヌクレオチドの約17〜約30近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はこれから操作された核酸配列を含む。
当業者は、標的物の阻害及びマクロファージの代替活性化マクロファージへの分化において効果的なアンチセンス核酸及びオリゴヌクレオチドの選択プロセスを促進し且つ簡略化するために、いくつかの戦略のいずれかを容易に利用することができる。オリゴヌクレオチドとmRNA分子の相補的配列の間の結合エネルギーの予測又は熱力学指数の計算を、利用することができる(Chiangらの文献、(1991) J. Biol. Chem. 266:18162-18171；Stullらの文献、(1992) Nucl. Acids Res. 20:3501-3508)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二次構造を基に選択することができる(Wickstromらの文献、(1991) 「癌及びAIDSのアンチセンス核酸療法の展望(Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS)」、Wickstrom編集、Wiley-Liss社、ニューヨーク、7-24頁；Limaらの文献、(1992) Biochem. 31:12055-12061)。Schmidt及びThompson(米国特許第6,416,951号)は、RNAをオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること、及びインターカレーション色素の存在下でハイブリダイズすることによりハイブリダイゼーションのキネティックスをリアルタイムに測定すること、又は標識を組込み且つ非標識オリゴヌクレオチドの存在下での色素又は標識のシグナルの分光学的特性を測定することを含む、機能的アンチセンス物質を同定する方法を説明している。加えて、例えば、自己相補性の非存在、ヘアピンループの非存在、安定したホモ二量体及び二重鎖形成の非存在(kcal/molで予測されたエネルギーにより評価される安定性)を含む、当業者により認められた様々な基準を利用し、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンス標的を予測する、様々なコンピュータプログラムのいずれかを利用することができる。そのようなコンピュータプログラムの例は、容易に利用可能であり、当業者に公知であり、且つOLIGO 4又はOLIGO 6プログラム(Molecular Biology Insights社、Cascade, CO)及びOligo Techプログラム(Oligo Therapeutics社、Wilsonville, OR)を含む。加えて、本発明に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下でのオリゴヌクレオチドライブラリー、又は核酸分子のライブラリーのスクリーニング、並びに標的RNA又は核酸にハイブリダイズするものの選択により同定されることができる(例えば、米国特許第6,500,615号参照)。Mishra及びToulmeもまた、標的に結合するオリゴヌクレオチドの選択的増幅を基に選択手順を開発した(Mishraらの文献、(1994) Life Sciences 317:977-982)。オリゴヌクレオチドはまた、RNAse Hによる標的RNAの切断を媒介するそれらの能力による、切断断片の選択及び特徴づけによっても、選択することができる(Hoらの文献、(1996) Nucl Acids Res 24:1901-1907；Hoらの文献、(1998) Nature Biotechnology 16:59-630)。オリゴヌクレオチドの作製及びRNA分子のGGGAモチーフへの標的化も、説明されている(米国特許第6,277,981号)。
アンチセンス核酸は、特にオリゴヌクレオチドであり、専らデオキシリボ-ヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、又はそれら両方の組合せからなり得る。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、望ましいならば、安定性及び／又は選択性を向上するために、化学修飾されることができる。本発明のために想定されたいくつか特定のオリゴヌクレオチドの具体例は、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間連結、又は短鎖ヘテロ原子式若しくは複素環式糖間連結を含むものを含む。オリゴヌクレオチドは、細胞内ヌクレアーゼにより分解されやすいので、これらの修飾は、例えば、ホスホジエステル結合の遊離酸素の代わりのイオウ基の使用を含むことができる。この修飾は、ホスホロチオエート連結と称される。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶性で、ポリアニオン性であり、且つ内在性ヌクレアーゼに対し抵抗性である。加えて、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがその標的物部位にハイブリダイズする場合、RNA-DNA二重鎖は、内在性酵素リボヌクレアーゼ(RNase)Hを活性化し、これはハイブリッド分子のmRNA成分を切断する。オリゴヌクレオチドはまた、1以上の置換された糖部分を含むことができる。特定のオリゴヌクレオチドは、2'位に下記の1つを含む：OH、SH、SCH3、F、OCN、ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；RNA切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基；又は、オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基及び同様の特性を有する他の置換基。同様の修飾を、オリゴヌクレオチドの他の位置に、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位及び5'末端ヌクレオチドの5'位に行うことができる。
加えて、ホスホロアミダイト及びポリアミド(ペプチド)連結を伴うアンチセンスオリゴヌクレオチドを、合成することができる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に対し非常に抵抗性である。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的物部位への結合の安定性を増強し且つこれを促進するために、化学基を糖部分の2'炭素及びピリミジンの5炭素(C-5)に付加することができる。修飾は、2'-デオキシ、O-ペントキシ、O-プロポキシ、O-メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオエート、修飾された塩基に加え、当業者に公知の他の修飾を含むことができる。
標的物のレベルを低下する発現-阻害性物質の別の型は、リボザイムである。リボザイムは、触媒ドメインと基質結合ドメインとを個別に有する触媒的RNA分子(RNA酵素)である。基質結合配列は、ヌクレオチド相補性により、及び恐らくその標的物配列との非水素結合相互作用により一緒にされる。触媒部分は、標的物RNAを特異的部位で切断する。リボザイムの基質ドメインは、特定されたmRNA配列へこれを向けるように操作することができる。リボザイムは、標的物mRNAを認識し、その後これに相補的塩基対合により結合する。一旦これが正確な標的物部位へ結合されたならば、リボザイムは、酵素のように働き、標的物mRNAを切断する。リボザイムによるmRNAの切断は、対応するポリペプチドの合成を指示するその能力を破壊する。一旦リボザイムがその標的物配列を切断したならば、これは放出され、且つ他のmRNAで結合及び切断を繰り返すことができる。
リボザイム型の例は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ型肝炎ウイルス、グループIイントロン又はRNaseP RNA(RNAガイド配列に会合されている)モチーフ又はニューロスポラVS RNAモチーフを含む。ハンマーヘッド構造又はヘアピン構造を有するリボザイムは、これらの触媒RNA分子は、真核プロモーターから細胞内で発現され得るので、容易に調製される(Chenらの文献、(1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9)。本発明のリボザイムは、好適なDNAベクターから、真核細胞において発現され得る。望ましいならば、リボザイムの活性は、第二のリボザイムによる、一次転写物からのその放出により増強される(Venturaらの文献、(1993) Nucleic Acids Res. 21:3249-55)。
リボザイムは、転写後に標的物mRNAへハイブリダイズする配列が側方に位置したリボザイム触媒ドメイン(20ヌクレオチド)と、オリゴデオキシリボヌクレオチドを組合せることにより、化学合成することができる。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、基質結合配列をプライマーとして使用することにより、増幅される。この増幅産物は、真核発現ベクターへクローニングされる。
リボザイムは、DNA、RNA、又はウイルスベクターへ挿入された転写単位から発現される。リボザイム配列の転写は、真核RNAポリメラーゼI(pol I)、RNAポリメラーゼII(pol II)、又はRNAポリメラーゼIII(pol III)のプロモーターから駆動される。pol II又はpol IIIプロモーター由来の転写物は、全ての細胞において高レベルで発現され；所与の細胞型における所与のpol IIプロモーターのレベルは、近くの遺伝子調節配列により左右されるであろう。原核RNAポリメラーゼ酵素が、好適な細胞において発現される場合には、原核RNAポリメラーゼプロモーターも使用される(Gao及びHuangの文献、(1993) Nucleic Acids Res. 21:2867-72)。これらのプロモーターから発現されたリボザイムは、哺乳類細胞において機能し得ることが示されている(Kashani-Sabetらの文献、(1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15)。
特定の実施態様において、本発明の方法は、センス鎖と相補的な17-25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むアンチセンスポリヌクレオチド、siRNA又はshRNAを用いて実践され、ここで該センス鎖は、標的物ポリヌクレオチドの17-25連続ヌクレオチドから選択される。
特定の阻害物質は、低分子干渉RNA(siRNA、特に低分子ヘアピンRNA、“shRNA”)である。siRNA、特にshRNAは、サイレンシングされるRNAと配列が相同である二本鎖RNA(dsRNA)により、遺伝子サイレンシングの転写後プロセスを媒介する。本発明のsiRNAは、配列番号:1-56に記載された配列の群から選択された、より特定すると配列番号:129-171に記載された配列の群から選択された、近接17-25ヌクレオチド配列に相補的又は相同である、センス鎖15-30、特に17-30、最も特定すると17-25ヌクレオチド、並びに該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖15-30、特に17-30、最も特定すると17-25、より具体的には19-21ヌクレオチドを含む。より特定すると、本発明のsiRNAは、配列番号:129-171を含む配列の群から選択されるセンス鎖を含む。最も特定のsiRNAは、互いに100％相補的であるセンス鎖及びアンチセンス鎖並びに標的物ポリヌクレオチド配列を含む。特にsiRNAは更に、センス鎖及びアンチセンス鎖を連結するループ領域を含む。
本発明の自己相補性一本鎖shRNA分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカーにより接続されたセンス部分とアンチセンス部分を含む。特にループ領域配列は、長さ4-30ヌクレオチド、より特定すると長さ5-15ヌクレオチド、及び最も特定すると長さ8又は12ヌクレオチドである。最も特定の実施態様において、リンカー配列は、
Figure 2016518812
 である。自己相補性一本鎖siRNAは、ヘアピンループを形成し、通常のdsRNAよりもより安定している。加えて、これらはベクターからより容易に作製される。
アンチセンスRNAと類似したsiRNAは、核酸分解に対する抵抗性を確実にするか、又は活性を増強するか、又は細胞分布を増強するか、又は細胞取り込みを増強するように修飾されることができ、そのような修飾は、修飾されたヌクレオシド間の連鎖、修飾された核酸塩基、修飾された糖及び／又はsiRNAの1以上の部分若しくは複合体への化学連鎖からなることができる。ヌクレオチド配列は、siRNA設計則に従わないヌクレオチド配列と比べ標的物配列の改善された減少をもたらすという、siRNA設計則に従い選択される(これらの規則の考察及びsiRNAの調製例について、WO 2004/094636及びUS 2003/0198627が引用により本明細書中に組み込まれている)。
特定の阻害物質は、マイクロRNA("miRNA"と称す)を含む。miRNAは、低分子の非コードRNAであり、標的メッセンジャーRNA(mRNA)転写物上の相補部位への結合により遺伝子発現を制御する多くの真核種において認められる調節分子のクラスに属する。
インビボにおいて、miRNAは、およそ70ヌクレオチドのpre-miRNAへ核内でプロセッシングされるより大型のRNA前駆体(pri-miRNAと称される)から作製され、pre-miRNAは、不完全なステムループ構造へフォールドされる。これらのpre-miRNAは、細胞質内で追加のプロセッシング工程を受け、ここで長さ18-25ヌクレオチドの成熟miRNAが、RNaseIII酵素によりpre-miRNAヘアピンの片側から切断される。
miRNAは、2つの様式で遺伝子発現を調節することが示されている。第一に、miRNAと正確に相補性であるタンパク質-コードしているmRNA配列に結合するmiRNAは、RNA-媒介型干渉(RNAi)経路を誘導する。メッセンジャーRNA標的は、RISC複合体中のリボヌクレアーゼにより切断される。第二の機序においては、mRNA転写物上の不完全な相補性部位に結合するmiRNAは、転写後レベルで遺伝子調節を指示するが、それらのmRNA標的は切断しない。植物及び動物の両方において同定されたmiRNAは、それらの遺伝子標的に対し翻訳制御を発揮するためにこの機序を使用する。
（低分子量化合物）
特定の薬物候補化合物は、低分子量化合物である。例えば分子量500ダルトン以下の低分子量化合物は恐らく、生物学的システムにおいて良好な吸収及び浸透を有し、且つ結果的に分子量500ダルトンを上回る化合物よりも成功する薬物候補である可能性がより大きい(Lipinskiらの文献、2001)。ペプチドは、別の特定の薬物候補化合物クラスを構成する。ペプチドは、優れた薬物候補であることができ、妊娠促進ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの、商業的に価値のあるペプチドの複数の例が存在する。天然の化合物は、薬物候補化合物の別の特定のクラスである。そのような化合物は、天然の供給源中に発見され、且つそこから抽出され、これはその後合成されることができる。脂質は、別の特定の薬物候補化合物のクラスである。
（抗体）
別の薬物候補化合物の好ましいクラスは、抗体である。本発明はまた、標的物に対して向けられた抗体も提供する。これらの抗体は、細胞内の標的物へ結合するように内在性に産生されるか、又は細胞の外側に存在する標的物ポリペプチドに結合するように組織に添加されてよい。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、キメラ抗体、単鎖抗体及びヒト化抗体、更にはFAb断片及びFAb発現ライブラリーの産物、並びにFv断片及びFv発現ライブラリーの産物も含む。
いくつかの実施態様において、ポリクローナル抗体が、本発明の実践において使用され得る。当業者は、ポリクローナル抗体の調製方法を知っている。ポリクローナル抗体は、例えば免疫化物質及び望ましいならばアジュバントの1回以上の注射により、哺乳類において産生され得る。通常、免疫化物質及び／又はアジュバントは、哺乳類に、皮下若しくは腹腔内の反復注射により注射されるであろう。抗体はまた、無傷の標的物タンパク質若しくはポリペプチドに対して、又は標的物タンパク質若しくはポリペプチドの断片、複合体を含む誘導体、若しくは細胞膜に包埋された標的物など他のエピトープに対して、又は抗体可変領域のライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーなどに対しても産生され得る。
免疫化物質を、免疫化される哺乳類において免疫原性であることが公知であるタンパク質に複合することも有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。使用することができるアジュバントの例は、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコラート)を含む。当業者は過度の実験を行うことなく、免疫化プロトコールを選択することができる。
一部の実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体であることができる。モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の方法を用い、調製することができる。本発明のモノクローナル抗体は、該抗体に対する免疫応答の開始(mounting)から宿主を保護するために「ヒト化」されてよい。「ヒト化抗体」は、その相補性決定領域(CDR)並びに／又は軽鎖及び／若しくは重鎖可変ドメインフレームワークの他の部分が、非-ヒト免疫グロブリンに由来するが、その分子の残余部分は、1以上のヒト免疫グロブリンに由来するものである。ヒト化抗体はまた、ドナー若しくはアクセプターの非修飾軽鎖又はキメラ軽鎖に会合されたヒト化重鎖、又はその逆を特徴とする抗体も含む。抗体のヒト化は、当該技術分野において公知の方法により達成することができる(例えば、Mark及びPadlanの文献、(1994)「実験薬理学ハンドブック(The Handbook of Experimental Pharmacology)」、113号の「第4章 モノクローナル抗体のヒト化」、Springer-Verlag社、New York参照)。トランスジェニック動物を使用し、ヒト化抗体を発現することができる。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野において公知の様々な技術を使用し、作製することができる(Hoogenboom及びWinterの文献、(1991) J. Mol. Biol. 227:381-8；Marksらの文献、(1991) J. Mol. Biol. 222:581-97)。Coleらの技術及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である(Coleらの文献、(1985) 「モノクローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、Alan R. Liss、77頁；Boernerらの文献、(1991). J. Immunol., 147(1):86-95)。
単鎖抗体の作製のための当該技術分野において公知の技術は、標的物に対する単鎖抗体を作製するために適応させることができる。これらの抗体は、一価抗体であることができる。一価抗体の調製方法は、当該技術分野において周知である。例えば、一つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現に関与している。重鎖は、重鎖の架橋を防止するために、一般にFc領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連のあるシステイン残基は、架橋を防止するために、別のアミノ酸残基により置換されるか、又は欠失される。
二重特異性抗体は、少なくとも2種の異なる抗原に、好ましくは細胞-表面タンパク質又は受容体又は受容体サブユニットに結合特異性を持つ、モノクローナル性であり、好ましくはヒト又はヒト化された抗体である。存在する場合、この結合特異性の一つは、標的物の一つのドメインについてであり；他方は、標的物の別のドメインについてである。
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。従来、二重特異性抗体の組換え作製は、2つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を基にしており、ここで2つの重鎖は、異なる特異性を有する(Milstein及びCuelloの文献、(1983) Nature 305:537-9)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダム類別のために、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、10種の異なる抗体分子の可能性のある混合物を作製し、そのただ一種のみが、正確な二重特異性構造を有する。アフィニティクロマトグラフィー工程は、通常この正確な分子の精製を実現する。同様の手順が、Trauneekerらの文献、(1991) EMBO J. 10:3655-9において明らかにされている。
本発明の方法の特別な態様は、標的物ポリペプチドと選択的に相互作用することが可能である細胞内結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの誘導された発現により、標的物ポリペプチドの発現をダウンレギュレーション又はブロックすることに関連している。細胞内結合タンパク質は、そこで発現され且つポリペプチドの機能を中和する細胞内のポリペプチドと選択的相互作用又は結合することが可能である活性阻害性物質及び任意のタンパク質を含む。特に細胞内結合タンパク質は、配列番号:57-112の標的物ポリペプチドのエピトープへの結合親和性を有する抗体、特に中和抗体、又は抗体若しくは中和抗体の断片である。より特定すると、細胞内結合タンパク質は、単鎖抗体である。
（医薬組成物、関連した使用及び方法）
標的物ポリペプチドへ特異的に結合する抗体又は断片、並びにアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される発現阻害性物質は、線維芽細胞遊走及び分化に因果関係があるか又はこれに起因する哺乳類における状態の治療のために治療薬として使用することができる。
本発明は、線維化状態の治療において使用するための、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片を含有する医薬組成物に関する。特定の実施態様において、線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
特定の態様において、本発明は、線維化疾患を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法を提供し、該方法は、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片を含有する1種以上の医薬組成物の状態を治療するか又は状態を予防する有効量を投与することを含む。特定の態様において、本発明は、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症、ペイロニー病、及び／又は維芽細胞遊走及び分化に関連した疾患を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法を提供する。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
別の態様において、本発明は、線維化状態の治療及び／又は予防において使用するための標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片を提供する。具体的実施態様において、該線維化状態は、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症、ペイロニー病、及び／又は線維芽細胞遊走及び分化に関連した疾患から選択される。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
更に別の態様において、本発明は、線維化状態の治療、又は発症予防のための医薬品の製造において使用するための、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体若しくはそれらの断片、又は標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体若しくはそれらの断片を含有する医薬組成物を提供する。具体的実施態様において、該線維化状態は、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症、ペイロニー病、及び／又は維芽細胞遊走及び分化に関連した疾患から選択される。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
本方法の特定の投与計画は、対象における異常な線維症のレベルを低下するのに十分な期間、及び好ましくは該線維化状態の原因となるプロセスを終結するのに十分な期間、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片の有効量を、線維芽細胞遊走及び分化に関与している線維化疾患に罹患している対象へ投与することを含む。本方法の特別な実施態様は、線維化疾患に罹患しているか又はこれを発症し易い対象患者へ、該患者における線維化状態を各々軽減又は防止するのに十分な期間、及び好ましくは該線維化状態の原因となるプロセスを終結するのに十分な期間、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片の有効量を投与することを含む。具体的実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。代替の実施態様において、該抗体は、単鎖抗体である。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
本発明は、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される、該物質を含有する組成物に更に関し、ここで該物質は、配列番号:1-56からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む。これらの物質は、そうでなければ本明細書において発現阻害性物質と称される。
特定の態様において、本発明は、線維症を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法を提供し、該方法は、該発現阻害性物質を含有する1種以上の医薬組成物の状態を治療するか又は状態を予防する有効量を投与することを含む。特定の態様において、本発明は、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症、ペイロニー病、及び／又は線維芽細胞遊走及び分化に関連した疾患を有するか又は有するリスクのある哺乳類を治療する方法を提供する。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
別の態様において、本発明は、線維化状態の治療及び／又は発症予防において使用するための発現阻害性物質を提供する。具体的実施態様において、該線維化状態は、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症、ペイロニー病、及び／又は線維芽細胞遊走及び分化に関連した疾患から選択される。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
更に別の態様において、本発明は、線維化状態の治療、又は発症予防のための医薬品の製造において使用するための、発現阻害性物質、又は該発現阻害性物質を含有する医薬組成物を提供する。具体的実施態様において、該線維化状態は、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症、ペイロニー病、及び／又は線維芽細胞遊走及び分化から選択される。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
本発明の更なる態様として、特に前述の状態及び疾患の治療及び／又は発症予防において医薬として使用するための、本発明の化合物が提供される。前述の状態及び疾患の治療及び／又は発症予防のための医薬品の製造における本化合物の使用も、本明細書に提供される。
本方法の特定の投与計画は、対象における異常な線維症のレベルを低下するのに十分な期間、及び好ましくは該線維化状態の原因となるプロセスを終結するのに十分な期間、発現阻害性物質の有効量を、線維芽細胞遊走及び分化に関与している線維化疾患に罹患している対象へ投与することを含む。本方法の特別な実施態様は、線維化疾患に罹患しているか又は発症し易い対象患者への、該患者における線維化状態を各々軽減又は防止するのに十分な期間、及び好ましくは該線維化状態の原因となるプロセスを終結するのに十分な期間、標的物ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はそれらの断片の有効量を投与することを含む。特定の実施態様において、該線維化状態は、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である。
本発明の別の態様は、標的物ポリペプチドの発現の阻害が可能であり且つ発現阻害性物質として説明されたポリヌクレオチドを発現することが可能なDNA発現ベクターを含有する組成物に関する。
本発明は、標的物遺伝子の発現、具体的には線維化疾患に関連したそれらの標的物遺伝子の発現を調節するのに有用な、及び小型核酸分子を使用するRNA干渉(RNAi)によりそのような状態を治療するのに有用な、化合物、組成物、及び方法を提供する。特に本発明は、標的物遺伝子並びに／又は標的物遺伝子発現及び／若しくは活性の経路に関与した他の遺伝子の発現を調節するために使用される、小型核酸分子、すなわち、低分子干渉核酸(siNA)分子であり、非限定的に低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロ-RNA(miRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)及び環状RNA分子を含む方法を特徴としている。
これらの組成物及び方法の特定の態様は、標的物と選択的に相互作用することが可能である細胞内結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの誘導された発現により、標的物の発現をダウンレギュレーション又はブロックすることに関する。細胞内結合タンパク質は、そこでポリペプチドが発現され且つその機能が中和される細胞内のポリペプチドと選択的に相互作用するか又は結合することが可能な任意のタンパク質を含む。好ましくは、細胞内結合タンパク質は、配列番号:57-112からなる群から選択される標的物のエピトープに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体の断片である。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は、単鎖抗体である。
本発明の抗体は、単にボーラスとして、時間をかけた注入、又はボーラスとして及び時間をかけた注入の両方で投与されるよう、送達されてよい。当業者は、タンパク質についてよりもポリヌクレオチドについての様々な製剤を利用することができる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
この組成物の特定の実施態様は、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、配列番号:1-56からなる群から選択される標的物をコードしているポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号:1-56からなる群から選択される標的物をコードしているポリリボヌクレオチドの部分に十分に相同であり、その結果siRNA又はマイクロRNAは、標的物ポリリボヌクレオチドの標的物ポリペプチドへの翻訳と相互作用する、低分子干渉RNA(siRNA)及びマイクロRNAからなる群から選択される発現-阻害する物質を含む。
細胞において、発現阻害性物質を発現するポリヌクレオチド、又は標的物ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドは、特にベクター内に含まれる。このポリ核酸は、核酸配列の発現が可能なシグナルへ、機能的に連結され、且つ好ましくは一旦ベクターが細胞へ導入されるとアンチセンス核酸を発現する組換えベクター構築体を利用し細胞へ導入される。様々なウイルス-ベースのシステムが、利用可能であり、これはアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスベクター系を含み、且つ全て、標的細胞において発現-阻害する物質のポリヌクレオチド配列又は標的物ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを導入及び発現するために使用され得る。
特に、本発明の方法において使用されるウイルスベクターは、複製欠損である。そのような複製欠損のベクターは、感染細胞内でのウイルスの複製に必要である少なくとも1つの領域を通常パッケージしているであろう。これらの領域は、当業者に公知の任意の技術により、除外するか(全体又は一部)、又は非機能性とするかのいずれかであることができる。これらの技術は、全体の除去、置換、部分欠失又は必須(複製に)領域への1以上の塩基の付加を含む。そのような技術は、遺伝子操作技術を使用するか又は変異誘発剤による処理により、インビトロにおいて(単離されたDNAにおいて)又はインサイチュにおいて行うことができる。好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子を封入するのに必要である、そのゲノムの配列を保持する。
好ましい実施態様において、ウイルスエレメントは、アデノウイルスに由来している。好ましくは、ビヒクルは、アデノウイルスキャプシドにパッケージされたアデノウイルスベクター、又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体を含む。アデノウイルスの生物学はまた、分子レベルで比較的よくわかっている。アデノウイルスベクターに関する多くのツールが存在し、且つ開発され続けており、結果的に、アデノウイルスキャプシドを、本発明のライブラリーの組込みのための好ましいビヒクルとしている。アデノウイルスは、多種多様な細胞に感染することが可能である。しかし、異なるアデノウイルス血清型は、細胞に関する異なる選好を有する。本発明のアデノウイルスキャプシドを好ましい実施態様に入れることができる標的細胞集団と一緒にし且つ拡大するために、ビヒクルは、少なくとも2種のアデノウイルス由来のアデノウイルス線維タンパク質を含む。好ましいアデノウイルス線維タンパク質配列は、血清型17、45及び51である。これらのキメラベクターの技術又は構築及び発現は、US 2003/0180258及びUS 2004/0071660に開示されており、これらは引用により本明細書中に組み込まれている。
好ましい実施態様において、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルス後期タンパク質又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体をコードしている核酸を含む。アデノウイルス後期タンパク質、例えばアデノウイルス線維タンパク質は、ある種の細胞にビヒクルを標的化するため、又は細胞へのビヒクルの増強された送達を誘導するために使用されることが好ましい。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスキャプシド全体又はそれらの機能性部分、それらの類縁体、及び／若しくは誘導体を形成することができる、全てのアデノウイルス後期タンパク質を本質的にコードしている。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルスE2A又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体をコードしている核酸を含む。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、細胞においてアデノウイルス由来の核酸の少なくとも一部の複製を促進する、少なくとも1種のE4-領域タンパク質又はそれらの機能性部分、誘導体、及び／若しくは類縁体をコードしている核酸を含む。本出願の実施例において使用されるアデノウイルスベクターは、本発明の治療法において有用なベクターの例である。
本発明のいくつかの実施態様は、レトロウイルスベクターシステムを使用する。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルスであり、それらの構築は当該技術分野において公知である。レトロウイルスベクターは、MoMuLV(“モロニーマウス白血病ウイルス”)、MSV(“モロニーマウス肉腫ウイルス”)、HaSV(“ハーベイ肉腫ウイルス”)；SNV(“脾臓壊死ウイルス”)； RSV(“ラウス肉腫ウイルス”)及びフレンドウイルスなどの、様々な型のレトロウイルスから構築され得る。レンチウイルスベクターシステムも、本発明の実践において使用され得る。
本発明の他の実施態様において、アデノ随伴ウイルス(“AAV”)が利用される。AAVウイルスは、感染細胞のゲノムへ安定した位置指定様式で組込まれる、比較的サイズが小さいDNAウイルスである。これらは、細胞の成長、形態又は分化にいかなる作用も誘導することなく、細胞の幅広いスペクトルに感染することができ、且つヒト病理に関与するようには見えない。
先に考察したように、組換えウイルスを使用し、本発明において有用なポリヌクレオチド物質をコードしているDNAを導入することができる。本発明の組換えウイルスは、概して、投与量約104〜約1014pfuの形状に製剤化され且つ投与される。AAV及びアデノウイルスの場合、約106〜約1011pfuの投与量が特に使用される。用語pfu(“プラーク形成単位”)は、ビリオン浮遊液の感染力に対応しており、且つこれは好適な細胞培養物を感染させ、形成されたプラーク数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のpfu力価を決定する技術は、先行技術において良く説明されている。
ベクター構築において、本発明のポリヌクレオチド物質は、1以上の調節領域に連結されてよい。好適な1又は複数の調節領域の選択は、慣習的な様式であり、当業者のレベル内である。調節領域は、プロモーターを含み、且つエンハンサー、サプレッサーなどを含むことができる。
本発明の発現ベクターにおいて使用することができるプロモーターは、構成的プロモーター及び調節された(誘導性)プロモーターの両方を含む。プロモーターは、宿主に応じて原核又は真核であることができる。本発明の実践に有用な原核生物(バクテリオファージを含む)プロモーターを挙げると、lac、lacZ、T3、T7、ラムダPr、P1、及びtrpプロモーターがある。本発明の実践に有用な真核(ウイルスを含む)プロモーターを挙げると、偏在性プロモーター(例えば、HPRT、ビメンチン、アクチン、チューブリン)、治療的遺伝子プロモーター(例えば、MDR型、CFTR、VIII因子)、組織特異性を発揮し且つトランスジェニック動物において利用される動物転写制御領域を含む組織-特異性プロモーター、例えば、マスト細胞において活性のあるキマーゼ遺伝子制御領域(Liaoらの文献、(1997), Journal of Biological Chemistry, 272,: 2969-2976)、リンパ球様細胞において活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlらの文献、(1984) Cell 38:647-58；Adamesらの文献、(1985) Nature 318:533-8；Alexanderらの文献、(1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44)、精巣、乳房、リンパ球及びマスト細胞において活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域(Lederらの文献、(1986) Cell 45:485-95)、骨髄細胞において活性のあるβグロビン遺伝子制御領域(Mogramらの文献、(1985) Nature 315:338-40；Kolliasらの文献、(1986) Cell 46:89-94)、CMVプロモーター及びビスナLTR(Sidiropoulosらの文献、(2001), Gene Therapy, 8:223-231)がある。
本発明の実践において使用することができる他のプロモーターは、分裂細胞において優先的に活性化されるプロモーター、刺激に反応するプロモーター(例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体)、テトラサイクリン-調節される転写モジュレーター、サイトメガロウイルス最初期、レトロウイルスLTR、メタロチオネイン、SV-40、E1a、及びMLPプロモーターを含む。本発明の実践において使用することができる更なるプロモーターは、樹状細胞、単球、好中球、マスト細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞などの炎症に寄与するマクロファージ又は他の細胞型において、活性があり及び／又は発現されるプロモーターを含む。
追加のベクターシステムは、ポリヌクレオチド物質の患者への導入を促進する非-ウイルスシステムを含む。例えば、所望の配列をコードしているDNAベクターは、リポフェクションによりインビボにおいて導入され得る。リポソーム-媒介性トランスフェクションで遭遇された困難を制限するように設計された合成カチオン脂質を使用し、マーカーをコードしている遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる(Felgnerらの文献、(1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7)；Mackeyらの文献、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31；Ulmerらの文献、(1993) Science 259:1745-8を参照)。カチオン脂質の使用は、負帯電された核酸の封入を促進し、また負帯電された細胞膜との融合を促進することができる(Felgner及びRingoldの文献、(1989) Nature 337:387-8)。核酸の導入に特に有用な脂質化合物及び組成物は、国際特許公報WO 95/18863及びWO 96/17823、並びに米国特許第5,459,127号に開示されている。インビボにおいて特定の臓器へ外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、ある種の実践的利点を有し、トランスフェクションを特定の細胞型に指示することは、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳などの、細胞が不均一な組織において特に利点である。脂質は、標的化を目的として、他の分子と化学的に結合されてよい。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体、又は非-ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合され得る。例えば、陽イオン性オリゴペプチド(例えば国際特許公報WO 95/21931)、DNA結合タンパク質由来のペプチド(例えば国際特許公報WO 96/25508)、又は陽イオン性ポリマー(例えば国際特許公報WO 95/21931)など、他の分子も、インビボにおいて核酸のトランスフェクションを促進するのに有用である。
裸のDNAプラスミドとして、インビボにおいてDNAベクターを導入することも可能である(米国特許第5,693,622号、第5,589,466号及び第5,580,859号参照)。治療目的の裸のDNAベクターは、当該技術分野において公知の方法、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、微量注入、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、又はDNAベクター輸送体の使用などにより、所望の宿主細胞へ導入することができる(例えば、Wilsonらの文献、(1992) J. Biol. Chem. 267:963-7；Wu及びWuの文献、(1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4；Hartmutらの1990年3月15日に出願されたカナダ特許出願第2,012,311号；Williamsらの文献、(1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30を参照)。受容体-媒介性DNA送達法も、使用することができる(Curielらの文献、(1992) Hum. Gene Ther. 3:147-54；Wu及びWuの文献、(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32)。
生物学的に適合性のある組成物は、固形、液体、ゲル、又は他の形状であることができる組成物であり、そこでは本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、及び抗体は、活性のある形状で、例えば生物活性に作用することが可能な形状で維持される。例えば、本発明の化合物は、標的物に対する逆のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有し；核酸は、標的物のメッセージを複製、翻訳するか、又はその相補的mRNAにハイブリダイズすることができ；ベクターは、標的細胞をトランスフェクトし、且つ前述のアンチセンス、抗体、リボザイム又はsiRNAを発現することができ；抗体は、標的物ポリペプチドドメインに結合する。
特定の生物学的に適合性のある組成物は、塩イオンを含有する、例えばトリス、リン酸塩、又はHEPES緩衝液などを用い緩衝されている水溶液である。通常塩イオン濃度は、生理的レベルに類似している。生物学的に適合性のある溶液は、安定化剤及び保存剤を含んでよい。より好ましい実施態様において、生体適合性のある組成物は、医薬として許容し得る組成物である。そのような組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、皮下、及び眼球内経路による投与のために製剤化され得る。非経口的投与は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射又は輸注技術を含むことを意味する。この組成物は、望ましいならば標準の周知の無毒の生理的に許容し得る担体、アジュバント及びビヒクルを含有する単位用量製剤で非経口的に投与されてよい。
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適した用量で当該技術分野において周知の医薬として許容し得る担体を使用し、製剤化することができる。そのような担体は、患者により摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化された医薬組成物であることができる。経口使用のための医薬組成物は、錠剤又は糖衣錠コアを得るために、活性化合物を固形賦形剤と一緒にし、任意に得られた混合物を粉砕し、且つ望ましいならば好適な賦形剤の添加後に、顆粒の混合物を処理することにより調製することができる。好適な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填剤、例えば乳糖、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールを含む糖質；トウモロコシ、小麦、コメ、ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、又はカルボキシメチル-セルロースナトリウムなどの、セルロース；アラビアゴム及びトラガカントを含むガム；並びに、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質である。望ましいならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの、崩壊剤又は可溶化剤を添加してもよい。糖衣錠コアは、濃縮された糖溶液などの好適なコーティングと複合して使用することができ、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニル-ピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー液、及び好適な有機溶媒若しくは溶媒混合物も含むことができる。製品識別のため、又は活性化合物の量、すなわち用量を特徴づけるために、染料又は顔料を、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加することができる。
経口的に使用することができる医薬調製品は、ゼラチンで製造されたプッシュ-フィットカプセル、並びにゼラチンとグリセロール又はソルビトールなどのコーティングで製造された軟密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、乳糖又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び任意に安定剤と混合された活性成分を含むことができる。軟カプセルにおいて、活性化合物は、安定剤を含む又は含まずに、脂肪油、液体、又は液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解又は懸濁することができる。
特定の無菌注射用調製品は、無毒の非経口的に許容し得る溶媒又は希釈剤中の溶液又は懸濁液であることができる。医薬として許容し得る担体の例は、食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水(例えば、リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム、又はそのような塩の混合物)、リンゲル液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、並びにそれらの組合せである。1,3-ブタンジオール及び無菌の不揮発性油は、好都合なことに溶媒又は懸濁媒体として利用される。合成モノ-又はジ-グリセリドを含む、任意の無刺激の不揮発性油を利用することができる。オレイン酸などの脂肪酸も、注射用調製品における使用が認められる。
本発明の化合物又は組成物は、高分子担体(類)、生分解性若しくは生体模倣マトリクスとの又はスカフォールドとの投与と組み合わせるか又はそれらの中に包埋することができる。担体、マトリクス又はスカフォールドは、組成物が組込み及び発現されることを可能にし、且つ細胞の添加又は細胞の存在と適合性がある任意の物質であることができる。特に、担体マトリクス又はスカフォールドは、主として非免疫原性であり、且つ生分解性である。生分解性物質の例としては、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、ヒアルロン酸、腸線縫合糸材料、ゼラチン、セルロース、ニトロセルロース、コラーゲン、アルブミン、フィブリン、アルギン酸塩、綿又は他の天然に存在する生分解性物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。マトリクス又はスカフォールド材料を、投与又は移植前に、例えばエチレンオキシドによる処理又はγ線照射又は電子線照射により、滅菌することは好ましい。加えて、以下を含むが、これらに限定されるものではない多くの他の材料を、スカフォールド又はフレームワーク構造を形成するために使用することができる：ナイロン(ポリアミド)、ダクロン(ポリエステル)、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物(例えばポリ塩化ビニル)、ポリカーボネート(PVC)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE、テフロン)、サーマノックス(TPX)、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、及びポリ乳酸-グリコール酸(PLGA)などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、及び様々なポリヒドロキシアルカン酸エステル、並びにそれらの組合せ。適したマトリクスは、高分子メッシュ又はスポンジ及び高分子ヒドロゲルを含む。特定の実施態様において、マトリクスは、1年未満の期間かけて、より特定すると6ヶ月未満かけて、最も特定すると2〜10週間かけて、生分解性である。このポリマー組成物並びに製造方法は、分解速度を決定するために使用することができる。例えば、漸増量のポリ乳酸とポリグリコール酸の混合は、分解時間を短縮する。使用することができるポリグリコール酸のメッシュは、例えば、手術用備品会社(例えば、Ethicon社、N.J)から、商業的に入手することができる。概して、これらのポリマーは、水、緩衝された塩溶液などの水溶液、又は帯電された側基を有する水性アルコール溶液、又はそれらの一価のイオン性塩中に、少なくとも部分的に可溶性である。
組成物媒体はまた、薬物吸収スポンジとして働くことができる親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの、任意の生体適合性又は非-細胞毒性のホモ-又はヘテロ-ポリマーから調製されるヒドロゲルであることができる。特にエチレン及び／又はプロピレンオキシドから得られるものなど、それらのいくつかは、商業的に入手可能である。ヒドロゲルは、例えば外科的介入時に、治療される組織の表面上に直接沈着され得る。
本発明の医薬組成物の実施態様は、本発明の物質をコードしている複製欠損組換えウイルスベクター及びポロキサマーなどのトランスフェクションエンハンサーを含む。ポロキサマーの例は、市販されている、無毒の生体適合性のあるポリオールであるポロキサマー407(BASF社、Parsippany, N.J.)である。組換えウイルスにより含浸されたポロキサマーは、例えば外科的介入時に、治療される組織の表面上に直接沈着されてよい。ポロキサマーは、ヒドロゲルと本質的に同じ利点を有するが、より低い粘度を有する。
本活性物質は、例えば各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルなど、例えば界面重合により調製されたマイクロカプセル中、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルション中に閉じ込められることもできる。そのような技術は、「レミントン薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(1980)、第16版、Osol, A.編集において明らかにされている。
持続放出調製品を調製することができる。持続放出調製品の適例は、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、成形された製品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成された注射用ミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日間以上にわたり分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。封入された抗体が長時間体内に留まる場合、これらは37℃での湿潤への曝露の結果として変性するか又は凝集し、結果的に生物活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性をもたらす。論理的戦略を、関与した機序に応じた安定化のために考案することができる。例えば凝集機序が、チオ-ジスルフィド交換を介した分子間S-S結合形成であることがわかった場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、好適な添加剤の使用、及び具体的ポリマーマトリクス組成物の開発により達成され得る。
本明細書において使用される治療的有効量は、症状又は状態を改善する、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はその抗体、アゴニスト若しくはアンタゴニストの量を意味する。そのような化合物の治療的有効性及び毒性は、細胞培養物又は実験動物における、例えば、ED50(集団の50％における治療効果用量)及びLD50(集団の50％の致死量)など、標準調剤手順により決定することができる。致死量対治療効果用量の比は、治療指数であり、且つこれは比LD50／ED50として表すことができる。大きい治療指数を示す医薬組成物は、特別である。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒト使用のための用量範囲の処方において使用される。そのような化合物の用量は、特に毒性がほとんど又は全くないED50を含む、循環濃度の範囲内に存在する。用量は、利用される剤形、患者の感受性、及び投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
任意の化合物に関して、治療的有効量は、細胞培養アッセイ、又は通常マウス、ウサギ、イヌ又はブタの動物モデルのいずれかで、最初に推定され得る。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲及び投与経路を実現するために使用される。その後そのような情報を使用し、ヒトにおける有用な投与量及び投与経路を決定することができる。正確な用量は、治療される患者の観点から個々の医師により選択される。用量及び投与は、活性部分の十分なレベルを提供するか又は所望の作用を維持するように、調節される。考慮され得る追加の因子は、患者の病態の重症度、年齢、体重及び性別；食餌、治療の望ましい期間、投与方法、投与の時間と頻度、併用薬(複数可)、反応感受性、及び治療に対する耐性／反応を含む。長期間作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度を基に、3〜4日毎、毎週、又は2週間に1回投与されてよい。
本発明の医薬組成物は、様々な方法で対象へ投与することができる。これらは、当該技術分野において公知の他の方法により、標的化された組織へ直接添加されるか、カチオン脂質と複合されるか、リポソーム内にパッケージされるか、又は標的化された細胞へ送達されてよい。所望の組織への局所投与は、直接注射、経皮吸収、カテーテル、注入ポンプ又はステントにより行うことができる。DNA、DNA／ビヒクル複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に局所的に投与される。代替の送達経路は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口(錠剤又は丸剤の形状)、局所的、全身的、眼球、腹腔内及び／又は髄腔内送達を含むが、これらに限定されるものではない。リボザイム送達及び投与の例は、SullivanらのWO 94/02595に提供されている。
本発明の発現-阻害する物質又は抗体の対象患者への投与は、自己投与及び他者による投与の両方を含む。患者は、マクロファージの代替活性化マクロファージへの分化により影響される、存在する疾患若しくは医学的状態について治療の必要性があるか、又は疾患及び医学的状態を予防若しくはリスクを低減するために、発症予防的処置が望まれ得る。本発明の発現阻害性物質は、対象患者へ、経口、経皮、吸入により、注射、経鼻、経直腸又は持続放出製剤により、送達され得る。
（インビトロ方法）
本発明はまた、線維芽細胞遊走及び分化を阻害するインビトロ方法も提供し、該方法は、線維芽細胞の集団を、標的物ポリペプチドの活性又は発現のインヒビターと接触させることを含む。特定の実施態様において、該インヒビターは抗体である。代替の実施態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。
本発明は更に、線維芽細胞遊走及び分化を阻害するインビトロ方法に関し、該方法は、線維芽細胞の集団を、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択されるインヒビターと接触させることを含み、ここで該インヒビターは、標的物ポリペプチドをコードしている核酸の約17〜約30近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列と相補的であるか又はこれから操作された核酸配列を含む。
アンチセンス核酸を使用する遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳又は転写レベルで実現され得る。本発明のアンチセンス核酸は、特に標的物ポリペプチドをコードしている核酸又は対応するmRNAの全て又は一部と、特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸断片である。加えて、その一次転写物のスプライシングを阻害することにより、標的物ポリペプチドをコードすることが可能な核酸配列の発現を減少するアンチセンス核酸が設計され得る。標的物をコードしている核酸の発現をダウンレギュレーション又はブロックすることが可能である限りは、任意の長さのアンチセンス配列が、本発明の実践に適している。特に、アンチセンス配列は、長さが、少なくとも約15〜30、特に少なくとも17ヌクレオチドである。アンチセンス核酸の調製及び使用、アンチセンスRNAをコードしているDNA、並びにオリゴ及び遺伝子アンチセンスの使用は、当該技術分野において公知である。
（略語）
Figure 2016518812
実施例1は、線維芽細胞スクラッチスクリーニングアッセイ及びカスタムアデノウイルスライブラリーを使用する一次スクリーンを説明する。
実施例2は、線維芽細胞スクラッチアッセイを使用し実施例1において同定されたヒットの再-スクリーンを説明する。
実施例3は、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行(FMT)のバリデーションアッセイを説明する。
実施例4は、「オン-標的」分析を説明する。
実施例5は、生存能力アッセイを説明する。
実施例6は、全トランスクリプトーム配列決定を説明する。
（実施例1. 線維芽細胞スクラッチアッセイ）
（1.1 バックグラウンド）
遊走する線維芽細胞は、特発性肺線維症の病理において主要な役割を果たすと考えられる。線維芽細胞スクラッチアッセイは、細胞運動性及び遊走の測定である創傷治癒アッセイである。細胞単層内の開放創を閉鎖する肺線維芽細胞の性向は、それらの特発性肺線維症への寄与を予測すると考えられる。
（1.2 肺線維芽細胞）
線維芽細胞スクラッチアッセイ及びFMTアッセイの設定のために、3名の健常ドナー由来のヒト肺線維芽細胞(正常ヒト肺線維芽細胞、NHLF)を、使用した。
表2：アッセイにおいて使用される肺線維芽細胞ドナーのまとめ
Figure 2016518812
これらの細胞を、慣習的に培養し、且つ10％熱失活されたウシ胎仔血清(HI-FBS)及びペニシリン-ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において、37℃、湿潤大気中5％CO2内で、増殖させた。
（1.3 プレートコーティング）
線維芽細胞遊走は、細胞外マトリクスにより影響を受ける。従って、細胞播種に関する最適コーティング条件を使用しなければならない。PureCol(98％I型コラーゲン及び2％III型コラーゲン)を、対照として使用し、スクラッチ領域を、スクラッチの直後(t＝0h)又は20時間後(t＝20h)に測定した。PureColのスクラッチ領域を比較し、ウェル毎の変動(little well-to-well variation)をほとんど伴わない、ロバスト性能を明らかにした。加えて、t＝20h(トリガー：2％FBS)により、PureColコートされたプレート上で、創傷は完全に閉鎖した。
（1.4 創傷領域分析のためのアルゴリズム）
線維芽細胞単層のスクラッチから生じた創傷領域を、ローダミン-ファロイジン及びDAPIによる免疫染色後の、InCell200装置(GE Healthcare社)上でのハイコンテンツイメージングにより測定し、それに続けてInCell開発者ソフトウェアによる研究室で開発したアルゴリズムを使用し解析した。図1は、開放及び閉鎖した線維芽細胞スクラッチ傷のアルゴリズム-ベースのセグメンテーションの例を示している。セグメンテーション図に示されたセグメンテーションは、ローダミン-ファロイジン染色細胞の画像中のスクラッチの最大開放領域、及び核のDAPI染色を基にした核を基にした。最大開放領域は、線維芽細胞単層中の機械的スクラッチ傷内の最も大きい開放領域と定義される。ローダミン-ファロイジン-ベースのセグメンテーションを使用し、線維芽細胞スクラッチアッセイにおける最大開放領域を定量した。
このアルゴリズムは、以下の2つのパラメータの測定を可能にした：i)全てのセグメンテーション化された領域の合計である総開放領域、及びii)最も大きい開放領域のみを含む最大開放領域(更にマックス開放領域と称される)。
このマックス開放領域パラメータは、細胞遊走時に形成される細胞間隙が排除される利点を有するが、遊走する細胞による開放領域の分離に起因した、総開放領域の一部を失うリスクもある。従って、マックス開放領域の測定は、創傷閉鎖の測定として使用した。
（1.5 トリガー）
測定の最適ウインドウを得るために、様々なトリガーを、異なる時点で使用することができる(プレ-又はポスト-スクラッチ)。当業者は、多くのそのような可能性のあるトリガーを知っているであろう。これらのトリガーは、ウシ胎仔血清(FBS)の存在又は非存在下での、IL-13、CCL21、CTGF及びPDGF-BBであることができる。FBSは、複数の成長刺激因子を含む。
DMEM中の2％FBSと組合せたPDGF-BB 50ng/mLを、以下に更に説明する線維芽細胞スクラッチアッセイにおけるトリガーとして使用した。
（1.6 陰性対照及び陽性対照）
各96-ウェルプレートは、非-発現遺伝子に対する対照(ルシフェラーゼ；luc_v13)、及びマウス一酸化窒素合成酵素遺伝子に対する対照(mmNos_v3)の、2種の陰性対照shRNAを含んだ。加えて、「無ウイルス」対照も、陰性対照として使用した。加えて、5種の陽性対照(PIK3C3_v3、CXCR4_v14、PDGFRA_v12、COL1A1_v5、及びPGK1_v2)も使用し、これらの対照のまとめを、表3に提示している。
表3：一次スクリーンにおいて使用した陽性対照及び陰性対照のまとめ
Figure 2016518812
陰性対照と比較した推定陽性対照の創傷閉鎖率(％)の計算は、下記式に従い算出した：
Figure 2016518812
この式において、初回スクラッチ(t0)と推定陽性対照の固定(tx)の間の時間フレーム内の創傷閉鎖を、同じ時間フレーム内の陰性対照の平均創傷閉鎖により除算し、百分率とした。データは、マックス開放領域に加え創傷閉鎖率の両方で表し、且つこれは、陽性対照の少なくとも1つは、両方のドナーにおける3種の陰性対照の平均と比べ、創傷閉鎖の＞60％阻害を示したことを検証した。
（1.7 細胞増殖の制御）
PDGF-BBは、増殖因子であり、従って遊走を誘導するのみではなく、引き続き細胞増殖も誘導することができる。この時間フレームの細胞は、スクラッチされた創傷への遊走が20hまでに限定されることを可能にし、従ってPDGF-BB及び／又はFBSが誘導した遊走は、依然増強されない。創傷閉鎖の観察された誘導への細胞増殖の可能性のある貢献をモニタリングするために、スクラッチを取り囲む領域の細胞数をカウントした。誘発された及び誘発されない条件下でのこれらの領域中の核カウントを比較し、有意な増加は認められず、従ってスクラッチ後最初の16時間で増強された増殖は生じなかったことを確認した。スクラッチ前の細胞の形質導入は、細胞数のわずかに減少を生じた。この減少は、該ウイルスを含むshRNA構築体とは無関係の一般にアデノウイルス効果であるように見える。
（1.8 一次スクリーン）
一次スクリーンのために、3回継代した正常ヒト肺線維芽細胞のドナーFB0054を選択した。一次スクリーンは、研究室のアデノウイルスライブラリーからの＞12,000個アデノウイルスshRNA構築体を使用し、行った。完全スクリーンは、140×96-ウェルプレートからなり、且つ生物学的2つ組で行った。一次スクリーンのためのアッセイ設定は、下記条件下であった：
・トリガー：0.2％ HI-FBS＋50ng/mL PDGF-BB
・細胞：ドナーFB0054由来のNHLF(3回継代)
・リードアウト：マックス開放領域
・MOI：24。
0日目に、ドナーFB0054由来のNHLF細胞を、PureCol-コートされたプレート上に3000個細胞/ウェルで播種し、引き続き翌日アデノウイルス構築体により、1細胞当たり感染単位MOI 24で、形質導入した。次に5日目に、形質導入された細胞を、50ng/mL PDGF-BB＋0.2％FBSにより誘発し、6日目にスクラッチを行った。スクラッチ後、細胞を、同じトリガーで再度誘発し、スクラッチの8時間後固定した。1.4に記載した研究室で開発したアルゴリズムを使用し、マックス開放領域を使用し、画像を解析した。スクリーニングプロトコールは、図2に概略的に示した。
（1.9 データ解析）
液体操作に関連した周縁効果又はパターンなどの、可能性のある分割できないプレート位置のアーチファクトを評価するために、色分け図(heat map)を、各プレートについて作製した。これらの色分け図を使用し異なる給源のプレートを比較し、プレート効果は検出することができないことが明らかになった。
生物学的2つ組が、スピアマン順位相関＞0.4又はカッパ統計値＞0.2を示した場合に、一次スクリーンプレートを解析した。このスクリーンの性能は、品質良好であると考えられ、5つの陽性対照中少なくとも3つがヒットコーリングの場合、2つ組ヒットとして現れた。
ヒットコーリングのためにどの統計法法を使用すべきか決定するために、全てのデータ点の頻度分布プロットを作製した。これらの試料の頻度分布は、右に歪んだ非ガウス分布を示した。
これらの右に歪んだデータ分布についてヒットコーリングを行うために、好適な統計法を使用すべきである。従って、IQR-ベースの正規化法が、最も適しており、その理由は、この方法は非対称分布に対し感度が低いからである。IQR法は、データ分散の測定値として、中央値(Q2)及び四分位範囲(Q3-Q1)を使用する。高度に歪んだデータセットを解析する場合、インヒビター又はアクチベーターのいずれが興味深いかに応じ、各々、例えば中央値及び(Q1-Q2)又は中央値及び(Q3-Q2)など、拡散したデータの別の測定値を使用することが可能である。カットオフ値の選択は、誤差範囲(ヒットとして非ヒットを同定する確率)を決定する。従って、ヒットコーリングのために、試料分布の測定として、IQR3を使う(中央値及びQ3-Q2)IQR法を使用した。
（1.10 結果）
陽性対照と陰性対照の間の明らかな分離が認められ、P3は創傷治癒の最強の阻害を示したのに対し、P2、P4、及びP5は中等度の阻害を示した。P1は、一次スクリーンにおいて同様の性能を示さなかった。
陰性対照試料及び陽性対照試料の間の分離を基に、カットオフ値は、完全一次スクリーンのヒットコーリングについて1.5に設定した。このカットオフ値で、陰性対照の＜5％は、ヒットと同定されることがあった(偽陽性)。更に、5陽性対照中少なくとも1つは、ヒットと同定されるか、又は5陽性対照中3つは、創傷閉鎖の40％以上の阻害を誘導することが検証された。これらの必要要件を基に、140のプレート中の22は、これらの基準に合致せず(失敗率15.7％)、且つバックアップスクリーンにおいてうまく再現された。
陽性対照と陰性対照の明らかな分離が認められた。加えて全てのプレートについて、スピアマン順位相関は、＞0.4であり、且つカッパ値は、0.2よりも大きかった。
IQRカットオフ値1.5を基に、合計1074の独自のウイルス構築体を、創傷治癒を阻害する2つ組ヒットとして同定した。
（実施例2. 線維芽細胞スクラッチアッセイにおいて同定されたshRNAヒットの再スクリーン）
（2.1 再-スクリーニングプロトコール）
一次スクリーンにおいてヒットとして同定された1074種の独自のウイルスを、再スクリーン相のために再増殖した。再スクリーンは、一次スクリーンと同様の試験条件(実施例1)を用いたが、ウイルスのドナー特異的作用を排除するために、異なるドナーにおいて行った。ここではNHLFドナー99218(継代4回)を使用し、濃度3000個細胞/ウェルで播種した。再スクリーンにおけるヒットコーリングは、陰性対照を基にしたので、形質導入のためには、異なるレイアウトを使用した。従って各プレートの96ウェルの少なくとも30％は、陰性対照からなった。加えて、5種の陽性対照は、カラム7に含まれた。対照セットのアイデンティティを、表4に列記した。
表4：再-スクリーンにおいて使用した対照セット
Figure 2016518812
細胞を、0.2％HI-FBS＋50ng/mL PDGF-BBにより誘発し、創傷の最大開放領域を測定した。MOI 12を使用し、創傷閉鎖の時点を、13時間に設定した。引き続き完全再スクリーンを、これらの最適条件を使用し、1バッチにおいて行った。
（2.2 データ解析）
再スクリーンにおいて、陽性対照及び陰性対照の性能は、各プレートの巧くいった基準として機能を果たした。2つ組の生値のデータ分布は、2つ組間でスピアマン順位相関0.73を示した。加えて、陽性対照と陰性対照のシグナル間で、明らかな分離が認められた。
再スクリーンデータにおけるヒット同定は、陰性を基にしたロバストZスコアを用いて行った。「ロバストZ-スコア法」は、それらの望ましくない影響を最小化するために、異常値を考慮し、これらは不活性であり且つ対照として機能するという仮定の下で、陰性対照測定をまとめて一緒にしている(Maloらの文献、2006)。陽性対照と陰性対照の間の分離が認められ、P3は創傷治癒の最も強力なインヒビターであり、且つP2、P4、及びP5は、中等度のインヒビターであった。
（2.3 結果）
対照及び試料について得られた結果のまとめを、図3に示した。カットオフ値1.2のロバストZ-スコア法を、再スクリーンに使用した。このカットオフ値で、陰性対照の5％未満が偽陽性ヒットとして同定されるのに対し、陽性対照の71％以上はヒットとして同定された(表5)。配列確認後、229種の遺伝子を標的化する216種のshRNA構築体を、同定した。
表5：再スクリーンにおける確認されたヒット及び対照性能のまとめ
Figure 2016518812
 * 百分率は、2つ組ヒットとして同定されたP3及びP4対照の数を基にした
** 百分率は、2つ組ヒットとして同定されたP3対照の数を基にした
（実施例3. 線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行(FMT)アッセイ）
（3.1 バックグラウンド）
筋線維芽細胞は、特発性肺線維症の病理において主要な役割を果たすと考えられる。線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行(FMT)アッセイは、リードアウトとしてα-平滑筋アクチン(αSMA)を使用し、肺-由来線維芽細胞の筋線維芽細胞分化に関与した遺伝子のハイスループット同定を可能にする。
（3.2 トリガー）
トリガーを、0.2％HI-FBSを補充したDMEMに添加した。細胞を、0.5 ng/mL TGFβにより72時間誘発した。誘発された細胞と誘発されない細胞の間の最も適したウインドウは、この濃度のトリガーを用いて認められた。
（3.3 画像解析アルゴリズム）
TGFβに対し反応するFMTを受けている線維芽細胞におけるαSMAの発現を、マウス-抗-ヒトαSMA、それに続くロバ-抗-マウスAlexa546、及びDAPIによる免疫染色後の、InCell200装置(GE Healthcare社)上でのハイコンテンツイメージングにより測定し、それに続けてInCell開発者ソフトウェア(GE Healthcare社)による研究室で開発したアルゴリズムを使用し解析した。図4のセグメンテーション図に示されたセグメンテーションは、αSMA染色を基にし、及びDAPI染色を基にした核を基にした。αSMA-ベースのセグメンテーションを使用し、画像中の筋線維芽細胞を同定した。濃度時間、染色領域を使用し、画像中のαSMA発現を定量し、これはFMTの測定である。αSMA陽性細胞の明らかな増加は、非誘発条件と比べ、TGFβで誘発した線維芽細胞について認められたのに対し、誘発されない条件と誘発された条件の間で核数については、差異は認められなかった。
図4は、アルゴリズム-ベースのセグメンテーションの原理を示している。赤線は、核のDAPI染色を基にしたセグメンテーションを示しているのに対し、緑線は、αSMA染色の画像を基にしたセグメンテーションを示している。これらの画像は明確に、緑線は、αSMA陽性細胞の近くに並んでいることを示し、従ってこのαSMA-ベースのセグメンテーションを、このデータ解析において使用した。
（3.4 推定陰性対照及び陽性対照）
発現されない遺伝子に対する3種の陰性対照shRNA(オワンクラゲ(Aequorea victoria)緑色蛍光タンパク質；aveGFP、及びホタルルシフェラーゼ；ffLuc_v21、及びffLuc_v24)を選択した。推定陽性対照は、TGFβ経路におけるそれらの役割を基に選択した。5種の推定陽性対照のパネルにおいて、少なくとも3種(P1、P2、及びP5)は、αSMA発現を基本レベルまで阻害することができることを示した。陰性対照及び陽性対照のまとめを、表6に示している。
表6：対照セットの内容
Figure 2016518812
（3.5 FMTアッセイプロトコール）
FMTスクリーニングプロトコールの設定を、図5に示している。完全バリデーションアッセイを、正常ヒト肺線維芽細胞のドナーFB0202(3回継代)において行った。細胞を、PureCol-コートされた96-ウェルプレート上に、濃度3000個細胞/ウェルで播種した。1日目に、細胞を、線維芽細胞創傷アッセイ再スクリーン(実施例2)からのウイルスを保有する216種のshRNAにより形質導入した。αSMA発現に対する全般的ウイルス効果をモニタリングするために、3種のプレートにおいて、形質導入されない細胞の入ったウェルを並べた。5日目に、細胞を、0.5ng/mL TGFβにより誘発し、細胞を、3日間FMTを受けさせた。8日目に、αSMA発現を、ハイコンテンツイメージを用いて決定し、引き続き前述のアルゴリズムを用い定量した(3.3参照)。
216種の確認されたヒットのバリデーションのために、様々なプレートレイアウトを使用し、そこで外側ウェルは、可能性のあるプレート効果を避けるために、除外した。更に陰性対照を基にしたヒット同定を可能にするために、各プレートのウェルの少なくとも30％は、陰性対照からなった。加えて、5つの陽性対照を含んだ。
（3.6 結果）
陽性対照と陰性対照の間の明確な分離が認められた(図6)。生物学的2つ組の間の相関は、スピアマン順位相関を使用し、比較した。全ての2つ組プレートに関して、スピアマン相関係数は、0.92以上であった。
実施例2の再スクリーン同様、陰性を基にしたロバストZ-スコアを、FMTバリデーションスクリーンにおけるヒットコーリングに使用した。図6は、ロバストZ-スコアによる正規化後の、対照及び試料の結果を示している。アデノウイルス構築体による細胞の形質導入は、線維芽細胞におけるαSMA発現の増加を生じた。しかしこれは、コードされたshRNAには関わりない全般的ウイルス効果であるように見える。5種の選択された陽性アデノウイルス対照中の4種は、TGFβのみにより誘発された線維芽細胞により発現された基本レベル以下ではFMTを阻害しなかった。
ヒット同定に使用されるロバストZ-スコアカットオフ値を決定するために、5種の陽性対照中少なくとも4種は、ヒットとして同定され、陰性対照はいずれも疑陽性として、及び6種の「無ウイルス」試料中ただ1種が疑陰性として同定された。全てのプレートは、カットオフ値≦-1.8でのこれらの追加の許容基準を満たし、従ってこのカットオフ値は、ヒットコーリングのために選択した。加えて、対応する反復がZ-スコア≦-1を有する、Z-スコア≦-1.8カットオフ値による単独のヒットも、考察した。
指定されたカットオフ値を用い、116種の候補遺伝子を標的化する112種のウイルスを同定した。
（実施例4. 「オン-標的」解析）
（4.1 バリデーションスクリーンプロトコールのバックグラウンド及び設定）
オン標的解析を、一次スクリーン(実施例1)と類似した使用した試験条件を用い、同じ正常ヒト線維芽細胞のドナーFB0054(3回継代)において行った。実施例3からの116種の候補標的物の各々について、少なくとも5種の追加の構築体を設計し、作製し、且つ再増殖させた。
（4.2 陽性対照及び陰性対照及びプレートレイアウト）
「オン標的」アッセイにおけるヒットコーリングは陰性対照を基にしているので、各プレートのウェルの少なくとも30％は、陰性対照(N1：非形質導入細胞、N2：ffluc_v22、N3：mmNos3_v3)からなるのに対し、公的供給源を基に線維芽細胞遊走に阻害作用を有すると予想された5種の陽性対照もまた、各プレートに含まれる(P1：PIK3C3_v3、P2：CXCR4_v4、P3：PDGFRA_v12、P4：MAPK14_v20、P5：SMAD4_v7)。プレート上の外側ウェルは、可能性のある周縁効果を避けるために、空で残される。
（4.3 オン標的スクリーンプロトコール）
ドナーFB0054由来のNHLF細胞を、密度3000個細胞/ウェルで播種し、引き続き形質導入した。その後細胞を、0.2％HI-FBS＋50ng/mL PDGF-BBにより誘発し、最大開放領域を測定した。ウイルス形質導入には、MOI 18を使用し、創傷閉鎖の測定のための最適時間は、12時間に設定した。
（4.4 データ解析及び結果）
陰性を基にしたロバストZ-スコアを、「オン標的」スクリーンのヒットコーリングに使用した。図7は、ロバストZ-スコアによる正規化後の対照及び試料の結果を示している。ヒットコーリングのためのロバストZ-スコアカットオフ値を決定するためには、4種の陽性対照中の少なくとも3種が、ヒットとして同定され、且つ陰性対照の3％未満は、偽陽性結果をもたらすことができない。全てのプレートは、カットオフ値≧1.5でのこれらの追加の品質管理基準を満たした。このカットオフ値を基に、オリジナルがヒットした33種の確認された候補標的物を同定し、及び少なくとも1種の追加の構築体を、ヒットとして同定した。加えて、12種の候補標的物に関して、2種以上のshRNAを、ヒットとして同定したが、オリジナルの構築体はしなかった。従って、合計45種の標的物が、「オン標的」解析において同定された。
（実施例5. 生存度アッセイ）
（5.1 バックグラウンド）
細胞毒性のために偽陽性として同定され得るヒットを排除するために、CellTiter Blue(CTB)アッセイ及び核カウント測定の両方を行うことができる。
CTBアッセイは、レサズリン(レドックス色素)をレソルフィン(蛍光最終生成物)に変換する生存細胞の能力を基にしている。非生存細胞は、代謝能を容易に喪失し、結果的に蛍光シグナルを発生しない。細胞毒性の参照として、スタウロスポリンの連続希釈を、各プレートにおいて行った。細胞の喪失は、毒性の指標であり、従って核カウントを、細胞毒性を評価するために使用した。
（5.2 CTBアッセイのためのプロトコール）
このアッセイ設定は、「オン標的」スクリーンに関するものと同じであり(実施例4参照)、且つ概略を、図8に描いている。レサズリン含有溶液の添加後24時間で、CTBの蛍光測定を行った。ウイルス誘導性毒性を同定するために、個々のウイルスのCTB蛍光レベルを、陰性対照の平均と比較した。従って陰性対照平均の70％以下であるCTB値を示しているウイルスは、毒性であると考え、従って除外した。
（5.3 核カウントアッセイのためのプロトコール）
5.2に記載のものと類似のアッセイ設定において、同じウイルスによる形質導入時の核カウントを使用し、細胞数をカウントした。核カウントについて、陰性対照を同じく平均化し、カットオフ値を70％に設定した。
（5.4 結果）
CTBによるように、核カウントアッセイにおいて、いずれのウイルスも、細胞毒性としては同定されず、従って実施例4からの候補標的物遺伝子はいずれも、毒性結果を基に除外されなかった。
（実施例6. 全トランスクリプトーム配列決定）
（6.1 バックグラウンド）
線維芽細胞において標的物のmRNA発現を確認するために、mRNAをこれらの細胞から単離し、全トランスクリプトーム配列決定を行った。全トランスクリプトーム配列決定又はmRNA-配列決定は、mRNA集団全体をプロファイリングするために使用することができ、且つ全ての転写物のマッピング及び定量化を可能にするcDNA配列決定適用である。プローブ又はプライマーデザインが不要であるmRNA-配列決定は、読みの深さ(read depth)に応じ、単独の実験において遺伝子発現、新規転写物、新規アイソフォーム、選択的スプライシング部位、及び稀な転写物の分析に関して、ポリA-テールRNAから比較的不偏の配列情報を提供する能力がある。
（6.2 試料調製）
2回継代したドナーFB0202の正常ヒト肺線維芽細胞(Epithelix社)を、10％HI-FCS、100IU/mlペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを補充したDMEMにおいて培養した。細胞を、湿潤大気中、37℃、5％CO2で培養した。5日間の維持培養後、細胞を、Purecolコートされた96-ウェル平底プレート上に、密度3000個細胞/ウェルで、2％HI-FCS、100IU/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを補充したDMEM中に播種した。誘発されない試料(FIB-202-U)に関して、2個の96-ウェルプレートの細胞を、RNA単離のために播種した後24時間で収集した。別の2個の96-ウェルプレートは、播種の5日後に、0.2％Hi-FCS及び0.5ng/mL TGFβにより誘発した(FIB-202-T)。細胞は、72時間誘発させ、引き続きRNA単離のために収集した。
（6.3 RNA単離及び品質分析）
全RNAを、市販のRNA単離キット(RNeasy Mini Kit、Qiagen社)を用い、培養細胞から単離した。RNA-配列決定のためにmRNAを送付する前に、濃度及び純度を、NanoDrop 2000(Thermo Scientific社)を用い、チェックした。
RNA試料(複数可)の品質及び完全性を、Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies社)を使用するRNA 6000 Lab-on-a-Chipにおいて分析した。試料品質は、試料調製の必要要件に合致した。Illumina(登録商標)mRNA-Seq試料調製キットを、試料の処理に使用した。試料調製は、Illuminaプロトコール「mRNA配列決定のための試料調製」(1004898 Rev. D)に従い行った。簡単に述べると、mRNAを、全RNAから、ポリ-T-オリゴ-付着した磁気ビーズを用いて単離した。mRNAの断片化後、cDNA合成を行った。これを、配列決定アダプターとのライゲーション及び生じた生成物のPCR増幅のために使用した。試料調製後の品質及び収量は、DNA 1000 Lab-on-a-Chip(Agilent Technologies社)により測定し、全ての試料は、品質管理を通過した。得られた生成物のサイズは、広範なサイズ分布300〜600bpを持つ予想された生成物と一致した。
（6.4 クラスター化及びDNA配列決定）
Illumina HiSeq 2000(Solexa社)を使用するクラスター化及びDNA配列決定を、製造業者のプロトコールに従い行った。合計6.5pmolのDNAを使用した。各々Read 1及びRead 2配列決定プライマーを使用する100サイクルの2つの配列決定の読みを、フローセルにより行った。
（6.5 生データ処理）
画像解析、塩基-コーリング、及び品質チェックを、Illuminaデータ解析ピペリン(pipeline)RTA v1.13.48及び／又はOLB v1.9及びCASAVA v1.8.2により行った。Illumina配列決定試行の品質を評価するために行ったQA解析は、Solexa技術を使用する良好な品質の標準試行のための品質測定法を基にした。フローセルの全てのレーンは、QA解析を通過した。加えて、Illumina社が供給したPhi Xコントロールを基にした詳細な誤差率情報を、報告した。Phi Xコントロールは、少量で試料へ添加される(読み値の最大5％)。Illumina対照DNAからの読み値を、データの処理時に、Illuminaピペリンにより取り除いた。誤差率は、Illuminaピペリン中のELANDアライナー(aligner)を使用し、Phi X参照ゲノムに対する品質フィルターを通過する読み値のアラインメント後に、算出した。全ての誤差率は、許容された基準内であった。
（6.6 データ解析）
Illumina HiSeq 2000シークエンサーから得られた読み値は、最小閾値Q25及び最短長さ50塩基の品質スコアによりフィルタリングした。次に読み値は、各試料についてBowtie v0.12.7アライナーにより、ヒト参照ゲノム(hg19)とアラインメントした。新規アイソフォームを、デフォルトの設定及びマスクとしての既知のトランスクリプトームアノテーション(Homo_sapiens.GRCh37.65.gff)を使用し、Cufflinks v2.02パッケージにより同定した。各試料について新規アイソフォームの同定後、新たに検出されたアイソフォームを、全ての試料についてマージさせ、標準トランスクリプトームアノテーションに加えた。最後に、FPKM(断片数／転写物キロベース／マップされた100万の断片)値を、各試料について、Cufflinksにより計算し、デフォルトのCufflinksアウトプットで報告した。FPKM値は、試料中の、従ってmRNA-配列決定解析及びスクリーニングアッセイに使用された細胞中のmRNAの定量的代表値である。高度に豊富なmRNAは、高いFPKM値を生じるのに対し、低いFPKM値は、低コピー数のmRNAを表す。
（6.7 結果）
この解析の結果を、表13に含み、且つ標的物の選択基準として使用した。発現データは、FPKM値として列記した。これらの結果は、33遺伝子中8種は、NHLFにより発現されなかったのに対し、他の25種の遺伝子は、NHLFにより発現されることを示している。
（実施例7. FMTアッセイにおける標的物に対するsiRNA試験）
（7.1 バックグラウンド）
shRNAノックダウン構築体が、異なるmRNAの発現、その後意図されたmRNAの発現に対する作用、いわゆるオフ-標的作用を有することを排除するために、オン-標的バリデーションを、選択された標的物に対するsiRNA構築体を用い、確認された候補標的物により行った。
（7.2 陽性対照及び陰性対照）
ACTA2、SMAD3、SMAD4、TGFBR1及びTGFBR2に対するsiRNAを、陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、陰性対照として使用した。
（7.3 siRNAスクリーニングアッセイプロトコール）
実験設定は、以下のようであった：0日目に、正常ヒト肺線維芽細胞3000個細胞/ウェルを、3.2μg/mL PureColコーティングした96-ウェルプレート(Advanced BioMatrix社、カタログ番号5005-B)に播種した。3日後、siRNAトランスフェクションを行った。細胞を、Dharmafect 1(Thermo社、カタログ番号T-2001-03)0.02μL/ウェルを用いて、トランスフェクトした。OnTarget Plus siRNA(Thermo Fisher Scientific Biosciences社)を、最終濃度20nMで、1ウェルにつき4種の構築体のスマートプールとして使用した。RHBDL2に関して、各siRNA構築体を同じく個別に試験した。1日後、培地をリフレッシュした。5日目に、細胞を、0.5〜2ng/mL TGFβを用いて誘発した。7日目に、細胞を固定した。細胞を固定するために、培地を最初に取り除き、次に4％ホルムアルデヒド(Merck社カタログ番号1.04002から調製)を、細胞へ添加し、30分間インキュベーションし、最後にPBSと置き換えた。同日、RNA単離を、標準MagMax全RNA単離キット(Ambion社、カタログ番号AM1830)を使用し行った。8日目に、α-SMA染色及び測定を行った。TGFβに反応するFMTを受けた線維芽細胞中のαSMAの発現を、InCell200装置(GE Healthcare社)上でのハイコンテンツイメージングにより測定し、その後マウス-抗-ヒトαSMA、引き続きロバ-抗-マウスAlexa546、及びDAPIにより免疫染色し、それに続けてInCell開発者ソフトウェア(GE Healthcare社)による研究室で開発したアルゴリズムを使用し解析した。核カウントを、品質管理として使用した。
（7.4 データ解析）
正規化された阻害率(NPI)解析を用い、siRNA構築体のリードアウトに対する作用を定量化した。計算において、ACTA2 siRNAを陽性対照として使用し、且つ非-標的化siRNAを陰性対照として使用した。正規化された阻害率(NPI)は、試料測定値と陽性対照平均の差を、陽性対照と陰性対照の差により、除算することにより算出した。
（実施例8. 「オン-標的」線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行(FMT)アッセイ）
（8.1 バックグラウンド及びスクリーニングプロトコールの設定）
リードアウトとしてα-平滑筋アクチン(αSMA)を使用する、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行(FMT)アッセイを使用し、shRNA構築体を使用する標的の追加のバリデーションを行った。
（8.2 陽性対照及び陰性対照及びプレートレイアウト）
3種の陰性対照shRNAを使用した：標的細胞において発現されない遺伝子に対する2種(オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質；aveGFP、及びマウス一酸化窒素合成酵素遺伝子：mmNos3)、並びに形質導入されない細胞の1種の対照。陽性対照は、TGFβ経路におけるそれらの役割を基に選択し、特にACTA2(αSMAをコードしている遺伝子)を、陽性対照として選択した。陰性対照及び陽性対照のまとめを、表7に示している。
表7：対照セットの内容
Figure 2016518812
（8.3 「オン標的」スクリーンプロトコール）
ドナーFB0054由来のNHLF細胞(3回継代)を、2％FBS-DMEM中の32μg/mL PureColによりコートされた96-ウェルプレート上に、濃度3000個細胞/ウェルで播種した。1日後に、細胞を、形質導入した。このウイルス形質導入には、MOI 18を使用した。形質導入の1日後、培地をリフレッシュした。6日目に、細胞を、2％FBS-DMEM中の2ng/mL TGFβ-1により誘発した。7日目に、スタウロスポリンの希釈範囲を、対照ウェル(1プレートにつき1列)に添加した。スタウロスポリン処理は、およそ20時間行い、これによりプレートを、37℃、5％CO2でインキュベーションした。8日目に、上清を収集し、細胞を固定した。固定のために、4％ホルムアルデヒドを、細胞へ添加し、30分間室温でインキュベーションし、引き続きPBS(Gibco社、カタログ番号10010)と置き換えた。
TGFβ-1に反応してFMTを受けた線維芽細胞におけるαSMA発現を、InCell200装置(GE Healthcare社)上でのハイコンテンツイメージングにより測定し、その後マウス-抗-ヒトαSMA、引き続きロバ-抗-マウスAlexa546、及びDAPIにより免疫染色し、それに続けてInCell開発者ソフトウェア(GE Healthcare社)による研究室で開発したアルゴリズムを使用し解析した。実施例3に記載のものと同じプロトコールを、使用した。
（8.4 データ解析及び結果）
正規化された阻害率(NPI)解析を用い、shRNA構築体のリードアウトに対する作用を定量化した。計算において、ACTA2_v4値の平均測定値を、陽性対照として使用し、且つmmNos3_v3値を陰性対照として使用した。正規化された阻害率(NPI)は、試料測定値と陽性対照平均の差を、陽性対照と陰性対照の差により、除算することにより算出した。そのスケールで少なくとも40％の阻害を示す構築体は、「オン-標的」と考えた。
以下の2種の特異的標的に対するshRNA構築体を、試験した：PTGIR及びRHBDL2。PTGIR及びRHBDL2標的に対する少なくとも2種のshRNA構築体は、PTGIRによる有意な阻害レベルを示し、5種の構築体は全て、αSMA生成の40％以上の阻害を示し、且つRHBDL2に対する9種の構築体中4種は、少なくとも40％阻害を示している。
（実施例9. 線維症動物モデルにおける標的物発現）
（9.1 バックグラウンド）
インビボにおける標的物遺伝子の発現を試験するために、いくつかのマウス及びラット線維症モデルを試験し、腎臓、肺及び皮膚などの特定組織における発現を決定した。
（9.2 マウスUUO(一側尿管閉塞)腎線維症モデル）
一側尿管閉塞を、Balb/c雌マウス(Harlan社-フランスより)において、1群あたりマウス10匹で作製した。0日目に、マウスに、腹腔内注射により麻酔をかけ、皮膚の切開後、左側尿管を切り離し、その長手方向に沿って2点を4.0絹糸で結紮した。その後尿管を、2つの結紮の間で切断した。無傷のマウスを、対照として使用した。マウスを、10又は21日後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
（9.3 ラット5/6 NTX(5/6腎摘出)腎線維症モデル）
腎摘出術を、Sprague-Dawley雄ラット(CERJ社-フランスより)において、1群あたりラット10匹で作製した。0日目に、ラットに麻酔をかけ、皮膚の切開後、副腎を保護しながら、腎臓皮膜を除去した。腎門部を結紮し、右側腎臓を摘出した。左側腎臓の末端を、メスで切除し、5/6腎摘出を生じた。ラットを、4又は8週間後に屠殺した。
（9.4 マウスBLM(ブレオマイシン)肺線維症モデル）
肺線維症を、ブレオマイシン静脈内投与について、CD1雄マウス(CERJ社-フランスより)において、１群あたりマウス6〜8匹で誘導し、且つブレオマイシン脊髄内投与について、C57/Bl6 J雌マウス(Janvier社より)において、１群あたりマウス14匹で誘導した。
静脈内投与(i.v.)に関して、マウスには、ブレオマイシン(10mg/kg；100μl/マウス)又は対照として食塩水を、1日1回最初の5日間連続して静脈内注射した(Okuらの文献、2004)。マウスを、3又は6週間後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
腹腔内投与に関して、マウスに、麻酔液(18mL NaCl 0.9％＋0.5mLキシラジン(5mg/kg)＋1.5mLケタミン(75mg/kg))の腹腔内注射(容積10mL/kg以下)により麻酔をかけた。ブレオマイシン溶液2U/kg又は食塩水を、気管内経路により投与した(10mg/kg；40μL/マウス)。マウスを、3週間後に、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
（9.5 マウス強皮症モデル）
強皮症は、Balb/c雌マウス(CERJ社-フランスより)において、１群あたりマウス15匹で誘導した。0日目に、マウスに、溶液(キシラジン5mg/kg、ケタミン75mg/kg)の腹腔内注射により麻酔をかけ、剃毛した。ブレオマイシン1mg/ml溶液又は食塩水の容積100μlを、マウスの剃毛した背部へ、26g針により、皮下注射した。ブレオマイシンを、連続する3週間にわたり1週につき5日間注射した。合計の実験期間は、6週間であった。6週間後に、マウスを、麻酔下での鋏による放血により屠殺した。
（9.6 動物線維症モデルにおける遺伝子発現及び調節）
インビボ実験の最後に、動物を屠殺し、組織(UUOモデルについて1/2マウス腎臓、5/6NTXモデルについて1/3ラット腎臓、マウス強皮症モデルについて皮膚小片、及びマウス肺線維症モデルについて肺一葉)を、RNALater(登録商標)安定化溶液(Ambion社、#AM7021)の入った、2ml-マイクロチューブ(Ozyme社、#03961-1-405.2)中に収集した。組織を、Precellys(登録商標)24組織ホモジナイザー(Bertin Technologies社)内で1.4mmセラミックビーズ(Ozyme社、#03961-1-103、BER1042)により破壊した。全RNAを単離し、組換えDNase消化に供し、Qiazol(登録商標)(Qiagen社、#79306)及びNucleoSpin(登録商標)RNAキット(Macherey-Nagel社、#740955.250)を製造業者の推奨に従い用い精製した。RNAを、RNase-非含有水60μlにより溶離した。RNAの濃度及び純度を、260、280及び230nmでの吸光度により決定した。cDNAを、全RNA 500ngから、高性能cDNA RTキット(Applied Biosystems社、#4368814)を使用する逆転写により、調製した。10倍希釈したcDNA調製品5μlを、リアルタイム定量的PCRに使用した。qPCRは、SYBR Green技術を使用するQiagen社からの遺伝子特異的プライマーにより行った。反応は、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)中での、95℃で5分間の変性工程、続けて40サイクル(95℃で10秒間、60℃で30秒間)で実行した。
下記の齧歯類β-アクチンプライマー(Eurogentec社)を使用した：
Figure 2016518812
マウス及びラットのアッセイ混合物は、下記表に列記している。
表8. マウス及びラットのアッセイ混合物(Qiagen社)
Figure 2016518812
（9.7 データ解析）
各遺伝子の発現レベルは、対照動物におけるそれらの閾値サイクル(CT)値により推定した。
遺伝子発現の相対変化の定量は、2-ΔΔC T法(ここで、ΔΔCT＝(CT.標的−CTβ-アクチン)罹患動物−(CT.標的−CTβ-アクチン)対照動物)を使用し、表した。2-ΔΔC T値の統計解析は、対照群に対する対応のないスチューデントt-検定を用いて行った(***：p＜0.001；**：p＜0.01；*：p＜0.05)。
（9.8 結果）
全ての試験したmRNAは、線維性組織(腎臓、肺及び皮膚)において良好に発現された(表9参照)。
表9. 無傷の動物におけるmRNA発現レベル(Ct＞30：低度、25＜Ct＜30：中等度、Ct＜25：高度)
Figure 2016518812
多くの遺伝子が、マウスUUOモデルにおいて、アップレギュレート又はダウンレギュレートされているのに対し、ごくわずかな調節が、ラットNTXモデル(4及び8週間)、並びに肺及び皮膚線維症モデルにおいて認められた。(表10参照)。
表10. 線維症モデルのqPCR解析(倍率＞1.8：無傷の動物に対し有意な倍率の誘導；倍率＜-1.8：無傷の動物に対し有意な倍率の阻害；ns：有意な変化なし；***：p＜0.001；**：p＜0.01；*：p＜0.05)
Figure 2016518812
表11：一次スクリーン、再スクリーン、FMTバリデーションアッセイにおける線維芽細胞標的物の性能のまとめ
この表は、標的物の性能の概要を示す。第一列は、対応する標的物の遺伝子記号を示す。2つ組みIQR-スコアは、一次線維芽細胞スクラッチスクリーンについて示され、ここでIQRカットオフ値≧1.5を使用し、並びに再スクリーンにおいては、ロバストZのカットオフ値≧1.2を使用した。FMTバリデーションアッセイの結果は、ロバストZカットオフ値≦-1.8を使用した2つ組Z-スコアで示した。
Figure 2016518812
表12：オン-標的バリデーションにおける標的物に対するshRNA構築体の性能のまとめ
アデノウイルス構築体の確認された候補標的物遺伝子の名称及びノックダウン配列を示している。ヒットと考えられたshRNA、加えて当初にヒットしたshRNA(太字)の結果を示し、「O.H.」列は、このshRNAが両方のオン-標的(OT)アッセイにおいて再度ヒットしたかどうかを示した(はい/いいえ)。2つ組の結果は、線維芽細胞スクラッチオン標的スクリーンについて、ロバストZのカットオフ値≧1.5で示している。CTB結果及び核数の結果を、2つ組ロバストZとして示している。CTBアッセイにおいて無毒作用のロバストZ≦-5の場合、及び核数において無毒作用のロバストZ≦-2.4の場合を基に、ヒットに含んだ。オン-標的は、オリジナルのshRNAを含む、少なくとも2つの独立したshRNAが、同じ作用を生じることを示している。Ntは、ウイルスを試験しなかった場合に示している。
Figure 2016518812
表13：オン標的解析における標的物発現のまとめ
確認された候補標的物遺伝子記号を、標的物の対応する遺伝子クラスと共に示している。発現データは、肺における100万個当たりのESTとして示している。RNA-配列決定から得られた発現データは、TGFβによる誘発なしか又は誘発したかのいずれかの、1名の正常ヒト線維芽細胞ドナー由来のFPKM値として示している。
Figure 2016518812
 （参考文献）
Figure 2016518812
Figure 2016518812

Claims (44)

  1. 線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
    a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
    b)被験化合物の該ポリペプチドへの結合親和性を測定する工程；
    c)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程；
    d)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
    e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能であり、且つ該ポリペプチドへの結合親和性を示す化合物を同定する工程：を含む、前記方法。
  2. 線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
    a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの断片及び誘導体と接触させる工程；
    b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
    c)被験化合物を、線維芽細胞集団と接触させる工程；
    d)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
    e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、前記方法。
  3. 線維症の治療に有用な化合物を同定する方法であって：
    a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列、それらの断片及び誘導体を含むポリペプチドを発現している線維芽細胞集団と接触させる工程；
    b)該細胞中の該ポリペプチドの発現及び／又は量を測定する工程；
    c)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
    d)該ポリペプチドの発現及び／又は量の減少を生じ、且つ線維芽細胞遊走又は分化を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、前記方法。
  4. 線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：
    a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させる工程；
    b)該ポリペプチドの活性を測定する工程；
    c)被験化合物を、線維芽細胞の集団と接触させる工程；
    d)線維芽細胞遊走又は分化に関連した特性を測定する工程；並びに
    e)線維芽細胞遊走又は分化を阻害し、且つ該ポリペプチドの活性を阻害することが可能な化合物を同定する工程：を含む、前記方法。
  5. 線維芽細胞遊走及び分化を阻害する化合物を同定する方法であって：
    a)被験化合物を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、それらの機能性断片及び機能性誘導体と接触させるか、又は配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸をコードしている核酸若しくはそれらの機能性誘導体と接触させる工程；
    b)該ポリペプチドの発現又は活性を測定する工程；
    c)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害することが可能な化合物を同定し、これにより、該ポリペプチドの発現又は活性の阻害が、線維芽細胞遊走又は分化の阻害を生じるか又はこれに関連している工程：を含む、前記方法。
  6. 前記核酸が、配列番号:1-56からなる群から選択される、請求項5記載の方法。
  7. 前記試験される化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、請求項1〜5のいずれか記載の方法。
  8. 前記ポリペプチドが、検出可能な標識と結合されている、請求項1〜5のいずれか記載の方法。
  9. 前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、インビトロ無細胞調製物中に存在する、請求項1、2、4、又は5記載の方法。
  10. 前記工程(a)及び(b)の該ポリペプチド配列が、細胞内に存在する、請求項1、2、4又は5記載の方法。
  11. 前記細胞が、該ポリペプチドを天然に発現する、請求項10又は3記載の方法。
  12. 前記細胞が、該ポリペプチドを発現するように操作されている、請求項10又は3記載の方法。
  13. 前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記細胞が、線維芽細胞である、請求項13記載の方法。
  15. 前記細胞が、ヒト肺線維芽細胞である、請求項14記載の方法。
  16. 前記特性が、線維芽細胞遊走に関連している、請求項1〜4記載の方法。
  17. 前記細胞が、遊走-誘導因子により誘発されている、請求項16記載の方法。
  18. 前記遊走-誘導因子が、CCL、CXCL(CCL3、CCL7、CCL13、CCL27、CCL22、CCL21、CCL15、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CXCL1、CXCL8、CXCL12)、IL13、CCL21、CTGF、PDGF-BBからなる群から選択される、請求項17記載の方法。
  19. 前記細胞が、遊走誘導因子及び血清により誘発される、請求項18記載の方法。
  20. 前記細胞が、単層中に存在する、請求項17〜19記載の方法。
  21. 前記特性が、該単層中の機械的に誘導されたスクラッチ傷の閉鎖の測定である、請求項20記載の方法。
  22. 前記特性が、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化に関連している、請求項1〜4記載の方法。
  23. 前記細胞が、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化因子により誘発されている、請求項22記載の方法。
  24. 前記線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化因子が、TGFβである、請求項23記載の方法。
  25. 前記特性が、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化のマーカーの生成及び／又は発現の減少である、請求項22〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. 前記マーカーが、α-平滑筋アクチン、コラーゲン、及び結合組織増殖因子からなる群から選択される、請求項25記載の方法。
  27. 前記マーカーが、α-平滑筋アクチンである、請求項26記載の方法。
  28. 前記被験化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、及び低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される、請求項3記載の方法。
  29. 前記被験化合物が、配列番号:1-56からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項28記載の方法。
  30. 哺乳類細胞中のベクターが、該化合物を発現する、請求項29記載の方法。
  31. 前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、請求項30記載の方法。
  32. 前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記siRNA又は前記shRNAが、センス鎖に相補的な17-25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここで該センス鎖が、配列番号:1-56からなる群から選択される核酸配列の17-25の連続ヌクレオチドから選択される、請求項28記載の方法。
  33. 前記siRNA又はshRNAが、該センス鎖を更に含む、請求項32記載の方法。
  34. 前記化合物が、抗体又は抗体断片である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  35. 線維化状態の治療に使用するための、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、抗体又はそれらの断片を含有する医薬組成物。
  36. 前記アンタゴニストが、モノクローナル抗体である、請求項35記載の医薬組成物。
  37. 前記アンタゴニストが、単鎖抗体である、請求項35記載の医薬組成物。
  38. 線維化状態の治療に使用するための、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択される物質を含有する医薬組成物であって、ここで該物質が、配列番号:1-56からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、前記医薬組成物。
  39. 請求項35〜38のいずれか一項記載の線維化状態の治療において使用するための医薬組成物であって、ここで該線維化状態が、線維芽細胞遊走及び分化に関連した線維化状態である、前記医薬組成物。
  40. 前記線維化状態が、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症、医原性薬剤誘発性線維症を含む様々な病因の他のびまん性実質性肺疾患、職業及び／又は環境が誘導した線維症、肉芽腫性疾患(サルコイドーシス、過敏肺炎)、膠原血管病、肺胞タンパク症、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、リンパ脈管筋腫症、遺伝性疾患(ハーマンスキー・パドラック症候群、結節硬化症、神経線維腫症、代謝性蓄積症、家族性間質性肺疾患)、放射線誘導性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、強皮症、ブレオマイシン誘導性肺線維症、慢性喘息、珪肺、アスベスト誘導性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、腎線維症、尿細管間質性線維症、糸球体腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、IgA腎症、高血圧、アルポート症候群、消化管線維症、肝線維症、肝硬変、アルコール誘導性肝線維症、毒物/薬物誘導性肝線維症、ヘモクロマトーシス、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、胆管損傷、原発性胆汁性肝硬変症、感染症誘導性肝線維症、ウイルス誘導性肝線維症、自己免疫肝炎、角膜瘢痕化、肥厚性瘢痕化、デュピュイトラン病、ケロイド、皮膚線維症、皮膚強皮症、全身性硬化症、脊髄損傷/線維症、骨髄線維症、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、ヴェーゲナー肉芽腫症及びペイロニー病から選択される、請求項39記載の線維化状態の治療において使用する医薬組成物。
  41. 線維芽細胞遊走及び分化を阻害するインビトロ方法であって、線維芽細胞の集団を、配列番号:57-112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性及び／又は発現のインヒビターと、接触させる工程を含む、前記インビトロ方法。
  42. 前記インヒビターが、抗体である、請求項41記載の方法。
  43. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項41記載の方法。
  44. 前記インヒビターが、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)及び短ヘアピンRNA(shRNA)からなる群から選択され、ここで該インヒビターが、該ポリペプチドをコードしている核酸の約17〜約30の近接ヌクレオチドの天然に存在するポリヌクレオチド配列に相補的な、又はこれから操作された核酸配列を含む、請求項41記載の方法。
JP2015562042A 2013-03-14 2014-03-07 線維症治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター Pending JP2016518812A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361781473P 2013-03-14 2013-03-14
US61/781,473 2013-03-14
PCT/EP2014/054442 WO2014139884A2 (en) 2013-03-14 2014-03-07 Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2016518812A true JP2016518812A (ja) 2016-06-30

Family

ID=50239628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015562042A Pending JP2016518812A (ja) 2013-03-14 2014-03-07 線維症治療において有用な分子標的及び前記標的のインヒビター

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9952202B2 (ja)
EP (1) EP2972380A2 (ja)
JP (1) JP2016518812A (ja)
WO (1) WO2014139884A2 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110128535A (zh) * 2019-03-27 2019-08-16 浙江工业大学 一种amh单克隆抗体及其制备与应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002057311A2 (en) * 2000-12-22 2002-07-25 University Of South Florida Sphingosine 1-phosphate receptor gene, sppr
JP2004502448A (ja) * 2000-07-11 2004-01-29 セル　センテル　ケルン　ジーエムビーエイチ 筋線維芽細胞及び筋線維芽細胞様細胞における遺伝子発現、ゲノム改変、並びにレポーター発現
JP2004517880A (ja) * 2001-01-22 2004-06-17 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク Ｐ２７は細胞遊走を抑制する
JP2010508297A (ja) * 2006-10-27 2010-03-18 エルパス・インコーポレイテッド 眼疾患と症状を処置するための組成物および方法
JP2010511389A (ja) * 2006-11-30 2010-04-15 ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション 線維性疾患および線維増殖性疾患を処置および診断するための方法
WO2011139846A2 (en) * 2010-04-28 2011-11-10 Allegheny-Singer Research Institute Compositions and methods for reduced scarring and for treatment of fibrosis
WO2012031015A1 (en) * 2010-09-01 2012-03-08 The Regents Of The University Of California Cell culture screen for agents that control adipogenesis and myofibroblast differentiation
JP2012526087A (ja) * 2009-05-08 2012-10-25 ノバルティス アーゲー 線維性障害の診断バイオマーカー

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
GB9620749D0 (en) 1996-10-04 1996-11-20 Brax Genomics Ltd Identifying antisense oligonucleotides
CA2279881C (en) 1997-04-14 2009-12-22 Dominic P. Behan A method of identifying modulators of cell surface membrane receptors useful in the treatment of disease
US6277981B1 (en) 1997-07-03 2001-08-21 Thomas Jefferson University Method for design and selection of efficacious antisense oligonucleotides
GB2335035B (en) 1998-03-03 2003-05-28 Brax Genomics Ltd Screening for functional antisense agents
NZ522215A (en) 2000-04-26 2004-05-28 Aventis Pharma Gmbh EDG8 receptor, its preparation and use
US7332337B2 (en) 2000-05-16 2008-02-19 Galapagos Nv Viral vectors having tissue tropism for T-lymphocytes, B- and mast cells
US7235233B2 (en) 2000-09-26 2007-06-26 Crucell Holland B.V. Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts
US20030198627A1 (en) 2001-09-01 2003-10-23 Gert-Jan Arts siRNA knockout assay method and constructs
AU2003224132A1 (en) 2003-04-24 2004-11-19 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
US20060057559A1 (en) * 2004-06-23 2006-03-16 Rigel Pharmaceuticals, Inc. High-throughput cell migration screening assay
US20090191578A1 (en) * 2004-07-27 2009-07-30 Merck & Co., Inc Canis sphingosine 1-phosphate receptor isoform 5
FR2968556B1 (fr) 2010-12-13 2013-12-27 Centre Nat Rech Scient Inhibiteurs des infections a vih et leurs utilisations

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004502448A (ja) * 2000-07-11 2004-01-29 セル　センテル　ケルン　ジーエムビーエイチ 筋線維芽細胞及び筋線維芽細胞様細胞における遺伝子発現、ゲノム改変、並びにレポーター発現
WO2002057311A2 (en) * 2000-12-22 2002-07-25 University Of South Florida Sphingosine 1-phosphate receptor gene, sppr
JP2004517880A (ja) * 2001-01-22 2004-06-17 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク Ｐ２７は細胞遊走を抑制する
JP2010508297A (ja) * 2006-10-27 2010-03-18 エルパス・インコーポレイテッド 眼疾患と症状を処置するための組成物および方法
JP2010511389A (ja) * 2006-11-30 2010-04-15 ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション 線維性疾患および線維増殖性疾患を処置および診断するための方法
JP2012526087A (ja) * 2009-05-08 2012-10-25 ノバルティス アーゲー 線維性障害の診断バイオマーカー
WO2011139846A2 (en) * 2010-04-28 2011-11-10 Allegheny-Singer Research Institute Compositions and methods for reduced scarring and for treatment of fibrosis
WO2012031015A1 (en) * 2010-09-01 2012-03-08 The Regents Of The University Of California Cell culture screen for agents that control adipogenesis and myofibroblast differentiation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, vol. 87, JPN6017047446, 2008, pages 367 - 375, ISSN: 0003910888 *
EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, vol. 88, JPN6017047447, 2009, pages 367 - 377, ISSN: 0003910889 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9952202B2 (en) 2018-04-24
WO2014139884A2 (en) 2014-09-18
EP2972380A2 (en) 2016-01-20
WO2014139884A3 (en) 2014-12-31
US20160069868A1 (en) 2016-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10048250B2 (en) Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases
JP2011515653A (ja) 神経変性疾患の治療に有用な標的配列及びそれらの同定方法
WO2011015572A1 (en) Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
US20160003808A1 (en) Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
JP2014110799A (ja) 骨及び関節の変性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物並びにその同定方法
JP2012517822A (ja) 炎症を包含する疾患の診断及び治療に有用な同定方法及び化合物
US20110077283A1 (en) Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
US20140256790A1 (en) Methods for Identifying and Compounds Useful for Increasing the Functional Activity and Cell Surface Expression of CF-Associated Mutant Cystic Fibrosis Transmembrance Conductance Regulator
US9952202B2 (en) Methods of identifying compounds for the treatment of fibrosis by using S1PR5
WO2020249710A1 (en) Treatment and prevention of disease mediated by wwp2
WO2014082993A2 (en) Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the down-regulation of the th2 response
EP2398480A1 (en) Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
US20110306655A1 (en) Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
WO2024003205A1 (en) Long non-coding rnas as target for treating fibrosis and cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20171212

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180226

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180611

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20181106

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20190625