CN110128535A

CN110128535A - 一种amh单克隆抗体及其制备与应用

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Publication number: CN110128535A
Application number: CN201910235649.4A
Authority: CN
Inventors: 应国清; 倪梦梦; 梅建凤; 易喻; 陈建澍; 张彦璐
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2019-08-16

Abstract

本发明公开了一种AMH单克隆抗体及其制备与应用，所述单克隆抗体是用抗原免疫Balb/c小鼠，通过辛酸‑硫酸铵法及Protein G两步纯化获得；所述抗原氨基酸序列为SEQ ID No：3所示，核苷酸序列为SEQ ID No：2所示。本发明的试剂盒灵敏度可达1ng/ml，效价可达1.0×10⁶以上，在国内市场具有一定优势。同时，不需要价格昂贵的仪器设备，降低仪器维修及检测成本，存在试剂交叉污染与样品干扰可能性小，背景信号低，同时环境因素及非特异性反应对检测结果影响不大，具有快速、廉价、简便、灵敏的特点。

Description

一种AMH单克隆抗体及其制备与应用

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及AMH重组蛋白及其单克隆抗体的制备方法，并涉及结合酶联免疫法检测抗缪勒试管激素的应用。

(二)背景技术

抗缪勒氏管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)，又称缪勒氏管抑制剂(Mullerian Inhibiting Factor,MIS)，是一种140kDa的二聚糖蛋白激素，属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一员。基因定位于人类19号染色体的短臂上，编码560个氨基酸的蛋白前体。每个单体含有N端结构域(也称为“pro”区)和C端结构域(也称为“成熟”区)，与其他TGF-β超家族成员相反，AMH需要N端结构域来增强C端结构域的活性以获得完整的生物活性。

抗缪勒氏管激素(AMH)是由睾丸中未成熟的支持细胞及卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌，负责缪勒氏管的消退，进而促进生殖道的正常发育。在男性体内，AMH由支持细胞从胚胎发育开始持续分泌，直至青春期开始缓慢下降。在女性体内，AMH水平随着卵巢储备功能的变化而变化，AMH水平越高，说明卵泡数量越多，卵巢储备功能好，女性生育能力就越强。而随着年龄增长及各种因素影响卵泡逐渐消耗，AMH浓度也会随之降低，反映卵巢储备功能降低，也预示着女性生育力的减弱，直到绝经后无法测出。因此，AMH被认为是评估卵巢储备功能的有效指标。本发明通过基因工程技术表达AMH重组蛋白，并以免疫学为基础的血清学检测，制备得到反应灵敏度高，特异性强的单克隆抗体，最后结合双抗体夹心技术应用于体外诊断试剂。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种反应灵敏度高，特异性强的AMH单克隆抗体及制备方法与在制备检测抗缪勒氏管激素试剂盒中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种AMH单克隆抗体，所述单克隆抗体是用抗原免疫Balb/c小鼠，通过辛酸-硫酸铵法及Protein G两步纯化获得；所述抗原氨基酸序列为SEQ ID No：3所示，核苷酸序列为SEQ ID No：2所示。

本发明还提供一种所述AMH单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)用基因工程技术制备AMH重组蛋白：将SEQ ID NO.2所示的AMH基因片段与表达载体pET-32a(+)双酶切，连接，热击法转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到AMH重组蛋白表达菌株，并诱导其表达AMH重组蛋白；(2)免疫动物：再用AMH重组蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，采用背部皮下多点初次免疫、腹腔常规免疫及脾脏加强免疫的方法免疫；(3)筛选单克隆抗体：取步骤(2)免疫后的小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，建立杂交瘤细胞系，从该细胞系中筛选出所有能产生特异性抗体的细胞株，利用小鼠腹腔诱生腹水的方法获取单克隆抗体。

本发明所述AMH单克隆抗体的制备方法：

(1)用AMH重组蛋白免疫Balb/c鼠：将SEQ ID No：3所示的AMH重组蛋白作为免疫原，初次免疫时与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，经皮下多点注射6～8周龄雌性Balb/c小鼠，免疫原用量为50μg/只，每间隔2周，将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化注射小鼠腹腔，免疫原用量为50μg/只，第四次免疫后第7天尾静脉采血，测血清效价，在细胞融合前3天，选择血清效价1.0×10⁵以上的小鼠用免疫原进行脾脏加强免疫，其免疫原用量为25μg/只；

(2)制备饲养层细胞：取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，摘眼球处死，用75％酒精浸润，用消毒后的剪刀在小鼠后腹部剪个小口，撕开其腹外皮肤，暴露腹膜；用无菌注射器取5ml37℃预热的IMDM无血清培养基注射小鼠腹腔，手指轻轻挤压腹部2～3次，悬浮腹腔细胞，回收腹腔液；从小鼠胸骨后轻轻地摘取胸腺，将其用IMDM无血清培养基冲洗数次后，用一个无菌注射器的芯挤压研磨，回收液体，并与腹腔液混合，以1500rpm离心3min后，用15％(v/v)胎牛血清IMDM培养基重悬，作为饲养层细胞；

(3)制备脾细胞：取经步骤(1)加强免疫后的小鼠，摘眼球处死，用75％酒精浸润，用消毒后的剪刀在小鼠加强部位的皮肤剪个口，同时剪开腹膜，用镊子和剪刀将脾脏剥离出来，除去脂肪和结缔组织，先用75％酒精洗涤，再用无血清IMDM培养基淋洗，置于筛网上，用无菌注射器的橡胶头充分研磨，通过无血清IMDM培养基使脾脏细胞冲洗进入无菌离心管，1500rpm离心3min，最后用无血清IMDM培养基重悬，并进行计数，调整细胞浓度至2×10⁸个/mL，作为免疫脾细胞；

(4)细胞融合：将骨髓瘤细胞SP2/0与步骤(3)制备的免疫脾细胞按体积比1:7的比例充分混匀，1500rpm离心3min，弃上清，尽量除去残留液，轻轻敲击离心管底部，置于37℃水浴上，1min内缓慢加入已预热的1ml PEG-1500，边加边摇晃，加完后及时用已预热的20ml无血清IMDM培养基终止融合作用，1500rpm离心3min，弃上清，沉淀用HAT完全培养基充分悬浮，以每孔300μl加入到96孔板内，置于细胞培养箱(37℃、5％CO₂)进行细胞培养；HAT完全培养基组成：次黄嘌呤100μmol/L、氨基喋呤0.4μmol/L、胸腺嘧啶核苷16μmol/L、15％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基；

(5)阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆：以AMH重组蛋白作为包被抗原，用CB(碳酸缓冲液0.05mol/L，pH9.6)稀释成1μg/ml，50μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜后拍干，用1％(w/v)BSA的PBS缓冲液封闭，300μl/孔，4℃封闭过夜后拍干备用；取步骤(4)融合培养后的细胞培养上清50μl/孔加入酶标板，放置37℃孵育30min后，0.01mol/L PBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤并拍干，加入50μl/孔二抗(HRP-羊抗鼠)放置37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50μl/孔TMB显色液放置37℃避光显色5min，加入50μl/孔的1mol/L HCl终止反应；将ELISA方法检测到的阳性杂交瘤细胞株接种至HT不完全培养基，使用有限稀释法进行多次亚克隆，直至所有单克隆细胞株阳性率达100％即为稳定细胞株，最终获得8株杂交瘤细胞；HT不完全培养基：次黄嘌呤100μmol/L、胸腺嘧啶核苷16μmol/L、15％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基；多次亚克隆只用15％胎牛血清的IMDM培养基；

(6)单克隆抗体的制备及纯化：选择8～10周龄的F1小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，7～14天后腹腔注入3×10⁵～4×10⁵个步骤(5)制备的8株杂交瘤细胞，接种后7～10天小鼠腹部明显膨大，用注射器分别抽取尽可能多腹水并将其编号为AMH-1、AMH-2、AMH-3、AMH-4、AMH-4、AMH-5、AMH-6、AMH-7、AMH-8；将获得的8个腹水分别取1倍体积腹水加入2倍体积0.06mol/L pH4.0的醋酸钠溶液稀释，然后缓慢加入3.3％腹水体积的正辛酸，控制流速0.5ml/min，边滴边搅拌；加完后计时搅拌30min，12000rpm离心30min，上清用四层纱布过滤，将滤液装入透析袋(直径16mm，截留分子量14000d)用0.01mol/L PB缓冲液透析，4℃过夜；取出截留液倒入烧杯，加入与截留液等体积的50％饱和硫酸铵(pH7.0)，控制流速3～5ml/min，边加边搅拌，加完后4℃静置2h，将悬浊液12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用0.5倍原腹水体积的PB透析液溶解，并将其装入透析袋(直径16mm，截留分子量14000d)于0.01mol/L PB缓冲液透析，4℃过夜，共换液3次，两次换液时间间隔不得少于5h；最后，将截留液用0.22μm滤器过滤后即得到8个单克隆抗体，分别为单抗AMH-1、单抗AMH-2、单抗AMH-3、单抗AMH-4、单抗AMH-4、单抗AMH-5、单抗AMH-6、单抗AMH-7、单抗AMH-8。

本发明还提供一种所述AMH单克隆抗体在制备检测抗缪勒氏管激素试剂盒中的应用，所述试剂盒包括一抗、二抗、显色剂、终止液、洗涤液和稀释液。本发明AMH单克隆抗体能特异性结合于AMH重组蛋白，也能特异性结合于天然AMH蛋白，因此，适用于检测人血清中AMH蛋白，还能用于体外诊断试剂盒。

本发明将小鼠腹水通过辛酸-硫酸铵法及Protein G两步纯化获得高纯度抗体，实现了抗体的大量制备。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明的试剂盒灵敏度可达1ng/ml，效价可达1.0×10⁶以上，在国内市场具有一定优势。同时，不需要价格昂贵的仪器设备，降低仪器维修及检测成本，存在试剂交叉污染与样品干扰可能性小，背景信号低，同时环境因素及非特异性反应对检测结果影响不大，具有快速、廉价、简便、灵敏的特点。

(四)附图说明

图1为PCR扩增结果图；M:DL2000Marker；1.PCR产物；2.阴性对照。

图2为重组质粒pET-32a(+)-AMH的双酶切鉴定图；M:DL2000Marker；1.pET-32a(+)-AMH质粒双酶切；2.pET-32a(+)-AMH质粒。

图3为重组蛋白的SDS-PAGE分析图；M:蛋白Marker；1.未诱导的菌体；2.经IPTG诱导表达的菌体。

图4为纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析图；M:蛋白Marker；1.菌体裂解后的上清；2.菌体裂解后的沉淀；3.平衡洗脱液；4.洗脱缓冲液1流出液；5.洗脱缓冲液2流出液。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1 AMH重组蛋白的制备

1.1获取AMH基因

根据NCBI获取人源AMH全长序列(Gene ID:268；NC_000019.10)，具体序列如序列表SEQ ID No.1所示。

1.2优化并合成编码AMH重组蛋白的核苷酸序列

为了提高AMH重组蛋白的表达量，在其氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将AMH基因进行优化，并在其上下游分别添加BamH I(GGATCC)和Sal I(GTCGAC)限制性内切酶酶切位点，委托安徽生物通用系统有限公司合成，核苷酸序列为SEQ ID No：2所示，氨基酸序列为SEQ ID No：3所示。

1.3构建AMH重组蛋白表达载体与菌株

将优化的AMH核苷酸序列(SEQ ID No：2所示)和pET-32a(+)载体分别用BamH I和Sal I限制性内切酶(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自NEB公司)于37℃双酶切10h，酶切产物进行1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳(图2)，用凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收重组蛋白核苷酸片段和pET-32a(+)载体。用T4连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含50μg/ml氨苄青霉素(上海生工生物工程服务有限公司)的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落至含50μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃恒温摇床过夜培养，采用质粒纯化试剂盒(Axygen公司)提取质粒，经BamH I和Sal I双酶切鉴定为阳性重组质粒，并将其送去南京金斯瑞公司测序，结果显示其插入片段与AMH核苷酸序列(SEQ ID No：2所示)一致，最终确定得到正确的重组表达载体的菌株，即重组蛋白表达菌体，重组表达载体命名为pET-32a(+)-AMH。

将上述重组蛋白表达菌体接种于含50μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃培养至OD₆₀₀达到0.6，加诱导剂IPTG(上海生工生物工程服务有限公司)至终浓度为0.1mmol/L，继续培养4.5h后，收集菌体，制备蛋白电泳样品。聚丙烯酰氨凝胶电泳结果(图3)表明AMH重组蛋白成功表达。LB液体培养基组成：胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。LB平板组成：胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

1.4纯化重组蛋白

接种1.3获得的重组蛋白表达菌体于含50μg/ml的氨苄青霉素的400ml LB液体培养基，于37℃培养至OD₆₀₀达到0.6，加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L，继续培养4.5h，以5000rpm、4℃、离心10min，收集菌体。将其用50ml重悬液(50mmol/LTris)重悬直至无菌块，以12000rpm、4℃、离心10min，分离并保留上清(图4中泳道1)与沉淀(图4中泳道2)进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，结果(图4)表明重组蛋白以包涵体的形式表达。将包涵体(即沉淀)用50ml抽提液(50mmol/L Tris，0.2mol/LNaCl，8mol/L尿素(Urea))重悬，搅拌30min，以功率400w、超声3s、间隔6s、共9次超声破碎菌体，以12000rpm、4℃、离心30min，保留上清和沉淀。上清用镍琼脂糖亲和层析柱纯化，先用抽提液平衡柱子，收集平衡洗脱液(图4中泳道3)，再用洗脱缓冲液1(50mmol/L Tris，0.2mol/L NaCl，8mol/L Urea，60mmol/L咪唑)洗脱杂蛋白(图4中泳道4)，最后用洗脱缓冲液2(50mmol/L Tris，0.2mol/L NaCl，8mol/L Urea，300mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白(图4中泳道5)。将洗脱后的重组蛋白用透析缓冲液(10mmol/L CBS(磷酸盐缓冲液)，pH 9.6)透析，每隔8h换一次，共换液3次，最终得到纯化的AMH重组蛋白，SDS-PAGE分析图见图4所示，可以看出蛋白大小于预期一致，且可以与镍琼脂糖亲和层析柱结合。

实施例2杂交瘤细胞株的获得及单克隆抗体的制备

2.1用AMH重组蛋白免疫Balb/c鼠

将实施例1制备的AMH重组蛋白作为免疫原，初次免疫时与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，经皮下多点注射6～8周龄雌性Balb/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，免疫原用量为50μg/只。每间隔2周，将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化注射小鼠腹腔，免疫原用量为50μg/只，第四次免疫后第7天尾静脉采血，测血清效价。在细胞融合前3天，选择血清效价1.0×10⁵以上的小鼠用免疫原进行脾脏加强免疫，其免疫原用量为25μg/只。

2.2制备饲养层细胞

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，摘眼球处死，用75％酒精浸润，用消毒后的剪刀在小鼠后腹部剪个小口，撕开其腹外皮肤，暴露腹膜。用无菌注射器取5ml 37℃预热的IMDM无血清培养基注射小鼠腹腔，手指轻轻挤压腹部2～3次，悬浮腹腔细胞，回收腹腔液。从小鼠胸骨后轻轻地摘取胸腺，将其用IMDM无血清培养基冲洗数次后，用一个无菌注射器的芯挤压研磨，回收液体，并与腹腔液混合，以1500rpm离心3min后，用15％(v/v)胎牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司)IMDM培养基(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)重悬，作为饲养层细胞。

2.3制备脾细胞

取经步骤2.1加强免疫的小鼠，摘眼球处死，用75％酒精浸润，用消毒后的剪刀在小鼠加强部位的皮肤剪个口，同时剪开腹膜，用镊子和剪刀将脾脏剥离出来，除去脂肪和结缔组织，先用75％酒精洗涤，再用无血清IMDM培养基淋洗，置于筛网上，用无菌注射器的橡胶头充分研磨，通过无血清IMDM培养基使脾脏细胞冲洗进入无菌离心管，1500rpm离心3min，最后用无血清IMDM培养基重悬，并进行计数，调整细胞浓度至2×10⁸个/mL，作为免疫脾细胞。

2.4细胞融合

将骨髓瘤细胞SP2/0(购自美国ATCC公司)与步骤2.3制备的免疫脾细胞按体积比1:7的比例充分混匀，1500rpm离心3min，弃上清，尽量除去残留液，轻轻敲击离心管底部，置于37℃水浴上，1min内缓慢加入已预热的1ml PEG-1500，边加边摇晃。加完后及时用已预热的20ml无血清IMDM培养基终止融合作用，1500rpm离心3min，弃上清，沉淀用HAT完全培养基充分悬浮，以每孔300μl加入到96孔板内，置于细胞培养箱(37℃、5％CO₂)进行细胞融合。HAT完全培养基组成：次黄嘌呤100μmol/L、氨基喋呤0.4μmol/L、胸腺嘧啶核苷16μmol/L、15％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基。

2.5阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆

AMH重组蛋白作为包被抗原，用CB(碳酸缓冲液0.05mol/L，pH9.6)稀释成1μg/ml，50μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜后拍干，用1％(w/v)BSA的PBS缓冲液封闭，300μl/孔，4℃封闭过夜后拍干备用；取步骤2.4融合培养后的细胞培养上清50μl/孔加入酶标板，放置37℃孵育30min后，0.01mol/L PBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤并拍干，加入50μl/孔二抗(HRP-羊抗鼠)放置37℃孵育30min后洗涤并拍干，加入50μl/孔TMB显色液放置37℃避光显色5min，加入50μl/孔的1mol/L HCl终止反应。将ELISA方法检测到的阳性杂交瘤细胞株接种至HT不完全培养基，使用有限稀释法进行多次亚克隆，直至所有单克隆细胞株阳性率达100％即为稳定细胞株，最终获得8株杂交瘤细胞。HT不完全培养基：次黄嘌呤100μmol/L、胸腺嘧啶核苷16μmol/L、15％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基；多次亚克隆只用15％胎牛血清的IMDM培养基。

2.6单克隆抗体的大量制备及纯化

选择8～10周龄的F1小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，7～14天后腹腔注入3×10⁵～4×10⁵个步骤2.5制备的8株杂交瘤细胞，接种后7～10天小鼠腹部明显膨大，用注射器分别抽取尽可能多腹水并将其编号为AMH-1、AMH-2、AMH-3、AMH-4、AMH-4、AMH-5、AMH-6、AMH-7、AMH-8。将获得的8个腹水分别取1倍体积腹水加入2倍体积0.06mol/L pH4.0的醋酸钠溶液稀释，然后缓慢加入3.3％腹水体积的正辛酸，控制流速0.5ml/min，边滴边搅拌。加完后计时搅拌30min，12000rpm离心30min，上清用四层纱布过滤，将滤液装入透析袋(直径16mm，截留分子量14000d)用0.01mol/L PB缓冲液透析，4℃过夜。取出截留液倒入烧杯，加入与截留液等体积的50％饱和硫酸铵(pH7.0)，控制流速3～5ml/min，边加边搅拌，加完后4℃静置2h，将悬浊液12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用0.5倍原腹水体积的PB透析液溶解，并将其装入透析袋(直径16mm，截留分子量14000d)于0.01mol/L PB缓冲液透析，4℃过夜，共换液3次，两次换液时间间隔不得少于5h。最后，将截留液用0.22um滤器过滤后即得到所需的8个单克隆抗体，分别为单抗AMH-1、单抗AMH-2、单抗AMH-3、单抗AMH-4、单抗AMH-4、单抗AMH-5、单抗AMH-6、单抗AMH-7、单抗AMH-8。利用间接ELISA法鉴定：将实施例1中重组AMH蛋白与这8个抗体进行反应，根据ELISA结果求P(实验组)/N(对照组)值大于2.1，即8个抗体有特异性。

实施例3单克隆抗体抗原表位的初步鉴定

根据DNAstar软件对AMH蛋白的二级结构、表面特性等方面进行分析，预测其抗原表位大致所在区域。参考预测结果，将SEQ ID NO.3所示AMH蛋白分为A(aa 1-281)，B(aa282-405)，C(aa406-506)以及A+B(aa 1-405)、B+C(aa282-506)共五段，将其表达并纯化。获得的各重组蛋白片段分别用碳酸缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释至1μg/mL，50μl/孔包被酶标板，4℃过夜。0.01mol/L PBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤酶标板并拍干，每孔加入300μl封闭液(0.01mol/L PBS，pH7.4，1％(w/v)BSA)，4℃过夜。0.01mol/L PBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤酶标板并拍干，待用。将筛选得到的单抗AMH-1到单抗AMH-8共8个单克隆抗体分别用磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)稀释至1μg/mg，50μl/孔加入酶标板中，同时设置PBS对照，37℃孵育30min，洗涤并拍干，加入50μl用稀释液(0.01mol/LPBS，pH7.4、1％(w/v)BSA)以体积比1:5000稀释的羊抗鼠抗体，37℃孵育30min，0.01mol/LPBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤并拍干，加入50μl TMB显色反应5min，加入50μl1mol/L HCl终止反应于酶标仪检测OD450nm，检测结果如下：

表1

由上表1可初步判定，AMH-3抗原表位大致在aa1-281，AMH-1和AMH-6抗原表位大致在aa282-405和AMH-4抗原表位大致在aa406-506。

实施例4单克隆抗体配对筛选

4.1HRP标记单抗的制备

称5mgHRP溶于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄水溶液，室温下避光搅拌20min，将其装入透析袋(直径16mm，截留分子量14000d)于1mmol/L pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。取出截留液加入20μl 0.2mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液，然后立即加入10mg步骤2.6制备的单克隆抗体AMH-1、AMH-3、AMH-4、AMH-6于0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液透析(直径16mm，截留分子量14000d)，4℃过夜。截留液加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄水溶液，混匀，4℃放置2h，将其装入透析袋(直径16mm，截留分子量14000d)于0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液透析，4℃过夜。取出截留液加入等体积饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，4℃放置30min，离心，弃上清。将沉淀溶于少量的0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液中，将其装入透析袋(直径16mm，截留分子量14000d)于0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液透析，4℃过夜。取出截留液离心，取沉淀，用0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液溶解，即得酶-抗体结合物，分别为HRP-AMH-1、HRP-AMH-3、HRP-AMH-4、HRP-AMH-6。

4.2单克隆抗体配对

将步骤2.6制备的单克隆抗体AMH-1、AMH-3、AMH-4、AMH-6，分别用碳酸缓冲液(0.05M、pH9.6)稀释至1μg/ml，50μl/孔包被酶标板，4℃过夜。0.01mol/LPBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤酶标板并拍干，每孔加入300μl封闭液(0.01mol/L PBS，pH7.4、1％(w/v)BSA)，4℃过夜。0.01mol/L PBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤酶标板并拍干，加入50μl阳性临床血清标本(正常女性静脉血样本，AMH含量为2～6.8ng/mL)，同时以阴性血清(AMH含量小于2ng/mL)作为对照，37℃孵育1h，洗涤并拍干，加入50μl用稀释液(0.01mol/L PBS，pH7.4、1％(w/v)BSA)以体积比1:1000稀释的HRP标记单抗(步骤4.1制备)，37℃孵育30min，0.01mol/L PBST(含Tween-20的磷酸缓冲溶液)洗涤并拍干，加入50μl TMB显色反应5min，加入50μl 1mol/L HCl终止反应，于酶标仪检测OD450nm和OD630nm值，根据酶标结果求P/N值(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值的比值)结果如下：

表2

由上表2可知，AMH-6与HRP-AMH-4配对检测AMH为最佳组合。

实施例5利用AMH重组蛋白单克隆抗体检测人血清样本

5.1特异性

采用实施例4方法，用AMH-6与HRP-AMH-4配对，检测人1000份阴性血清(AMH含量1ng/mL)，特异性为99.9％，假阳性为0.1％。

5.2灵敏度

采用实施例4方法，用AMH-6与HRP-AMH-4配对，检测阳性血清(AMH含量为2～6.8ng/mL)，灵敏度为100％。因此用这两个抗体，可以制备成抗缪勒试管激素检测试剂盒。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种AMH单克隆抗体及其制备与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgcgggacc tgcctctcac cagcctggcc ctagtgctgt ctgccctggg ggctctgctg 60

gggactgagg ccctcagagc agaggagcca gctgtgggca ccagtggcct catcttccga 120

gaagacttgg actggcctcc aggcagccca caagagcctc tgtgcctggt ggcactgggc 180

ggggacagca atggcagcag ctcccccctg cgggtggtgg gggctctaag cgcctatgag 240

caggccttcc tgggggccgt gcagagggcc cgctggggcc cccgagacct ggccaccttc 300

ggggtctgca acaccggtga caggcaggct gccttgccct ctctacggcg gctgggggcc 360

tggctgcggg accctggggg gcagcgcctg gtggtcctac acctggagga agtgacctgg 420

gagccaacac cctcgctgag gttccaggag cccccgcctg gaggagctgg ccccccagag 480

ctggcgctgc tggtgctgta ccctgggcct ggccctgagg tcactgtgac gagggctggg 540

ctgccgggtg cccagagcct ctgcccctcc cgagacaccc gctacctggt gttagcggtg 600

gaccgccctg cgggggcctg gcgcggctcc gggctggcct tgaccctgca gccccgcgga 660

gaggactccc ggctgagtac cgcccggctg caggcactgc tgttcggcga cgaccaccgc 720

tgcttcacac ggatgacccc ggccctgctc ctgctgccgc ggtccgagcc cgcgccgctg 780

cctgcgcacg gccagctgga caccgtgccc ttcccgccgc ccaggccatc cgcggaactc 840

gaggagtcgc cacccagcgc agaccccttc ctggagacgc tcacgcgcct ggtgcgggcg 900

ctgcgggtcc ccccggcccg ggcctccgcg ccgcgcctgg ccctggatcc ggacgcgctg 960

gccggcttcc cgcagggcct agtcaacctg tcggaccccg cggcgctgga gcgcctactc 1020

gacggcgagg agccgctgct gctgctgctg aggcccactg cggccaccac cggggatcct 1080

gcgcccctgc acgaccccac gtcggcgccg tgggccacgg ccctggcgcg ccgcgtggct 1140

gctgaactgc aagcggcggc tgccgagctg cgaagcctcc cgggtctgcc tccggccaca 1200

gccccgctgc tggcgcgcct gctcgcgctc tgcccaggtg gccccggcgg cctcggcgat 1260

cccctgcgag cgctgctgct cctgaaggcg ctgcagggcc tgcgcgtgga gtggcgcggg 1320

cgggatccgc gcgggccggg tcgggcacag cgcagcgcgg gggccaccgc cgccgacggg 1380

ccgtgcgcgc tgcgcgagct cagcgtagac ctccgcgccg agcgctccgt actcatcccc 1440

gagacctacc aggccaacaa ttgccagggc gtgtgcggct ggcctcagtc cgaccgcaac 1500

ccgcgctacg gcaaccacgt ggtgctgctg ctgaagatgc aggcccgtgg ggccgccctg 1560

gcgcgcccac cctgctgcgt gcccaccgcc tacgcgggca agctgctcat cagcctgtcg 1620

gaggagcgca tcagcgcgca ccacgtgccc aacatggtgg ccaccgagtg tggctgccgg 1680

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ctgcgcgcag aagaaccggc agtgggcacc agcggcctga tttttcgcga agatctggat 60

tggccgccgg gcagcccgca ggaaccttta tgcctggtgg ccctgggtgg tgacagtaat 120

ggcagtagca gcccgctgcg tgttgtgggt gcactgagcg catacgaaca ggcctttctg 180

ggtgccgtgc agcgtgcccg ttggggtcct cgtgatctgg ccacctttgg tgtgtgtaat 240

accggcgatc gccaggcagc cctgccgagt ctgcgcagac tgggtgcctg gctgcgcgat 300

ccgggtggtc agcgtctggt tgttctgcat ctggaagaag ttacctggga accgaccccg 360

agcctgcgtt ttcaggaacc gccgccgggt ggtgccggtc ctcctgagtt agcactgctg 420

gttctgtatc cgggtccggg tccggaagtg accgttaccc gcgccggtct gccgggtgct 480

cagtcactgt gcccgagccg tgatacccgt tatctggtgc tggccgtgga tcgtccggcc 540

ggtgcttggc gtggtagtgg cctggccctg accctgcagc cgcgtggtga agatagccgc 600

ctgagtaccg cacgcctgca ggccctgctg tttggtgacg atcatcgttg ctttacccgt 660

atgaccccgg cactgctgct gctgccgcgc tcagaaccgg cccctctgcc tgcacatggt 720

cagctggata ccgtgccgtt tccgccgccg cgtccgagtg cagaactgga agaaagcccg 780

ccgagcgcag atccgtttct ggaaaccctg acccgtctgg ttcgcgcact gcgtgtgccg 840

ccggcacgtg caagcgcacc tcgtctggca ctggaccctg atgcactggc cggctttccg 900

cagggcctgg ttaatctgag cgatccggca gccctggaac gcctgctgga tggtgaagaa 960

ccgctgctgc tgttactgcg cccgaccgcc gcaaccaccg gcgaccctgc acctctgcat 1020

gatccgacca gcgcaccgtg ggccaccgct ttagcccgcc gtgttgccgc cgaactgcag 1080

gctgccgccg cagaactgcg cagcctgcct ggtctgccgc cggcaacagc accgctgctg 1140

gcacgtctgc tggcactgtg tccgggtggt ccgggtggcc tgggtgaccc tctgcgtgca 1200

ctgctgttac tgaaagcact gcagggcctg cgtgttgaat ggcgcggccg cgatccgcgc 1260

ggtcctggtc gtgcacagcg ctcagccggt gcaaccgccg cagatggtcc gtgtgcactg 1320

cgtgaactga gcgttgatct gcgcgccgaa cgcagtgtgc tgattccgga aacctatcag 1380

gcaaataatt gccagggtgt ttgtggttgg ccgcagagtg atcgcaatcc gcgctatggc 1440

aatcatgttg ttctgctgct gaaaatgcag gcacgcggcg ccgccctggc aagacctcct 1500

tgttgcgtgc cgaccgcc 1518

<210> 3

<211> 506

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg

1 5 10 15

Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu

20 25 30

Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val

35 40 45

Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln

50 55 60

Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn

65 70 75 80

Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala

85 90 95

Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu

100 105 110

Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro

115 120 125

Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro

130 135 140

Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala

145 150 155 160

Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val

165 170 175

Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu

180 185 190

Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala

195 200 205

Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala

210 215 220

Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly

225 230 235 240

Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu

245 250 255

Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg

260 265 270

Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg

275 280 285

Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val

290 295 300

Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu

305 310 315 320

Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro

325 330 335

Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala

340 345 350

Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser

355 360 365

Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu

370 375 380

Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala

385 390 395 400

Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly

405 410 415

Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala Thr

420 425 430

Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg

435 440 445

Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys

450 455 460

Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly

465 470 475 480

Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala Arg Gly Ala Ala Leu

485 490 495

Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala

500 505

Claims

1.一种AMH单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体是用抗原免疫Balb/c小鼠，通过辛酸-硫酸铵法及Protein G两步纯化获得，所述抗原氨基酸序列为SEQ ID No：3所示。

2.如权利要求1所述AMH单克隆抗体，其特征在于所述抗原核苷酸序列为SEQ ID No：2所示。

3.一种权利要求1所述AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)制备AMH重组蛋白：将SEQ ID NO.2所示的AMH基因片段与表达载体pET-32a(+)双酶切，连接，热击法转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到AMH重组蛋白表达菌株，并诱导其表达AMH重组蛋白；(2)免疫动物：再用AMH重组蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，采用背部皮下多点初次免疫、腹腔常规免疫及脾脏加强免疫的方法免疫；(3)筛选单克隆抗体：取步骤(2)免疫后的小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，建立杂交瘤细胞系，从该细胞系中筛选出所有能产生特异性抗体的细胞株，利用小鼠腹腔诱生腹水的方法获取单克隆抗体。

4.一种权利要求1所述AMH单克隆抗体在制备检测抗缪勒氏管激素试剂盒中的应用。