CN106970057A - 人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用，特点是该试剂包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1‑微球偶联物和抗体Ab2‑荧光分子标记物，其制备方法步骤包括针对人抗苗勒管激素单克隆抗体的制备和配对，人抗苗勒管激素单克隆抗体与载体微球的偶联以及单克隆抗体的荧光分子标记，优点是根据荧光值的强弱直接判断AMH含量的高低，只需往试剂中添加血液样本，就能得到实验结果，简化了检测过程中的实验操作步骤，同时配合自动加样系统，就可实现高通量多样本的连续检测，极大的提高了检测的效率，检测的灵敏度可达到0.01ng/ml。

Description

人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及血清或血浆中抗苗勒氏管激素含量的检测技术，尤其是涉及一种人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用。
背景技术
抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)是转化生长因子β超家族的成员之一，由Professor Alfred Jost首先发现。AMH是由两个相同的70×103Da亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140×103Da；人类AMH编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。抗苗勒氏管激素(AMH)在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。在男性中AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿的发育过程中，AMH导致苗勒氏管退化，形成正常发育的男性生殖管道。在女性中AMH主要由卵巢颗粒细胞产生，血清AMH保持相对于男性较低的一个水平，从青春期开始，血清AMH水平随时间慢慢降低，并在更年期降低。
AMH是由卵巢窦前卵泡和小窦状卵泡颗粒细胞分泌的活性因子，不受促性腺激素(Gn)的反馈调节，可抑制卵泡的募集和选择，在始基卵泡上无表达，在初级卵泡的颗粒细胞上弱表达，在≤4mm的小窦卵泡中强表达，而在＞4mm窦卵泡中表达逐渐减弱至完全消失。抑制卵泡生长，参与了卵泡形成的两个重要调控，始基卵泡募集和周期募集。较其它卵巢评价指标更能准确地反映育龄期女性机体内分泌状态。人体内，AMH的平均半衰期为(27.6±0.8)h，完全清除约需8d。正常生育期女性血清AMH与年龄呈负相关，在0.43～43.19pmol/L间波动，峰值处于18～25岁，36岁后显著下降，41～47岁时降至8.0pmol/L，各个年龄段AMH的正常参考范围均较大。随着AMH的作用被越来越多人所熟知，AMH逐步被应用于妇科内分泌疾病、生殖医学领域、性别异常等范畴。
多囊卵巢综合征(PCOS)是一种生殖功能障碍和糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合征，存在于5％～10％的育龄期女性中，主要表现为稀少排卵或不排卵、闭经、不孕，卵巢多囊样改变、高雄激素和高胰岛素血症。AMH水平与PCOS的诊断和管理有潜在相关性。血清AMH可预测卵巢功能减退及绝经年龄。卵巢功能减退指卵巢产生卵母细胞的能力降低，卵泡质量下降，进一步可发展为卵巢早衰(POF)，严重影响女性生殖能力。
POF患者血清AMH水平相当于绝经期妇女AMH水平，在绝经前5年开始，逐渐降低，故认为血清AMH可以预测绝经年龄。POF患者的窦前卵泡存在缺陷，分泌AMH低，低AMH水平加速原始卵泡的募集，形成恶性循环，使原始卵泡库存提早衰竭。POF患者窦卵泡闭锁或者黄素化，导致AMH低表达，可能与颗粒细胞凋亡有关。胎儿性器官分化与AMH密切相关，男性睾丸的发育和功能与AMH亦有关，AMH的检测可以帮助分辨隐睾症、单睾症、持续性苗勒管综合征(PMDS)等。
有研究不断证实AMH是预测卵巢功能的最佳血清学指标，联合窦卵泡数(AFC)和FSH时更为准确。然而，随着AMH应用的广泛深入，对其实验室检测也提出了更高的要求，且目前尚存以下一些亟待解决的问题：(1)目前尚无统一的AMH检测标准和校正衡量值；(2)由于检测技术的原因，各实验室检测值波动较大；这为新的ANH检测技术提供的研发方向和应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种准确快速的人抗苗勒管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用，该流式检测试剂可有效检测人血清或血液中的抗苗勒管激素，检测的灵敏度可达到0.01ng/ml。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种人抗苗勒管激素的流式检测试剂，包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1-微球偶联物和抗体Ab2-荧光分子标记物，其中抗体微球偶联物的结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；所述的抗体荧光分子标记物的结构通式如图2所示，其中Ab2 为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子。
所述的抗体Ab1和Ab2为成熟AMH蛋白片段免疫小鼠所制备的AMH单克隆抗体对，所述的抗体Ab1和Ab2能同时与AMH抗原结合，所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR。
所述的AMH单克隆抗体对是从20个鼠源AMH单克隆抗体库中利用十字交叉法筛选配对得到的配对效果最佳一对抗体。
所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯(PS)或二氧化硅(SiO2)，所述的单分散微球的外表面功能化修饰有羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键；所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(APC)、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料(Cy2/3/5)。
2、上述人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)AMH单克隆抗体的制备
选取一段成熟AMH蛋白片段序列作为制备抗苗勒管激素抗体库的抗原，将抗原的碱基序列克隆至原核表达载体pET-41a上，E.coli原核表达系统表达出AMH抗原蛋白，用亲和层析的方法纯化带标签的AMH抗原蛋白；所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR；
将AMH抗原蛋白用水溶性佐剂接种免疫5只6-8周龄Balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分别进行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各100uL，ELISA检测血清效价；当效价达到1：50000后，选取血清效价最高的小鼠，拉劲处死，取该小鼠的脾脏，获取脾细胞，然后与小鼠Balb/c品系骨髓瘤细胞sp2/0进行3次融合；在融合24小时后，加HAT选择培养基培养两周，采用96孔板克隆化细胞，筛选出杂交瘤细胞；用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25Flask培养，培养的上清用protein A或proteinG纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；
(2)双抗夹心法筛选能够配对的AMH抗体对
将20个纯化好的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，同时将这20个单克隆抗体包被板，采用十字交叉法检测配对效果，以抗原浓度和标记抗体的量为变量因素，设置阴性对照，空白对照，如果测定值为阴性值的2.1倍，则表示为阳性，筛选出一对配对效果最佳的抗体对Ab1和Ab2，作为偶联微球和荧光分子的前期材料；
(3)AMH单克隆抗体Ab1与微球偶联
将碳二亚胺(EDC)粉末和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末加入到浓度为1mg/mL的AMH单克隆抗体Ab1溶液中，室温避光反应15分钟，然后向反应溶液中加入浓度为0.5wt％的单分散微球溶液，30℃避光震荡反应4小时，用含1wt％的SDS溶液洗涤微球2次，浓度为0.5wt％吐温-20的PBS溶液洗涤微球3次，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab1-微球偶联物，其结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1，将抗体Ab1-微球偶联物保存于含0.5wt％NaCl，PH＝7.4的PB溶液中，待用；
(4)AMH单克隆抗体Ab2的荧光分子标记
将浓度为1-10mg/ml的待交联的AMH单克隆抗体Ab2溶液，于4℃用交联反应液透析三次，至pH＝9.0得到抗体Ab2溶液；将荧光分子溶于二甲基亚砜中配置成浓度为1mg/mL的荧光分子溶液；将荧光分子溶液缓慢加入抗体Ab2溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；然后在反应液中加入5mol/L的NH4Cl直至NH4Cl终浓度为50mmol/L，4℃终止反应2h，然后在PBS缓冲液中透析四次以上直至透析液清亮，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab2-荧光分子标记物，其结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子，将抗体Ab2-荧光分子标记物置于pH＝7.4的含有0.1wt％NaN3、1wt％BSA磷酸盐缓冲液中，4℃避光保存。
步骤(2)所述的十字交叉法检测配对效果具体方法如下：
A.将单克隆抗体用0.05M pH＝9.0碳酸盐包被缓冲液稀释得到浓度为1-10μg/ml的抗体溶液，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml抗体溶液，4℃包被过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液冲洗3次，每次3分钟；
B.加样：取4ng/mL、0.4ng/ml、40pg/ml和4pg/ml四个浓度的AMH抗原样品0.1ml分别上述已包被的反应孔中，放置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；
C.加酶标抗体：于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5-1小时，洗涤3次；
D.加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃显色10-30分钟；
E.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止显色反应；
F.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，重复此实验三次，选取阳性中OD值最大的反应孔所对应的一对抗体，即为配对效果最佳的AMH蛋白的单克隆配对抗体Ab1和Ab2。
步骤(3)中所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯(PS)、二氧化硅(SiO2)，单分散微球的外表面具有功能化修饰羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键。
所述的碳二亚胺、所述的N-羟基琥珀酰亚胺、所述的单分散微球溶液与所述的AMH单克隆抗体Ab1溶液的混合比例为28g：56g：2ml：1ml。
步骤(4)所述的抗体Ab2蛋白与所述的荧光分子交联时的比例为1mg：15μg。所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(APC)、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料(Cy2/3/5)。
上述人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂的应用，将流式检测试剂的用于检测人抗苗勒氏管激素含量具体步骤如下：
将待测样本人血清或血液加入到抗体Ab1-微球偶联物溶液中，然后加入一定体积的抗体Ab2-荧光分子标记物溶液，37度孵育30min，样本中的INHB分别与Ab1抗体微球偶联物和Ab2抗体荧光分子标记物结合形成微球-Ab1-AMH-Ab2-荧光分子复合体，经流式细胞仪可以检测出荧光分子发射出的荧光，根据荧光强度与AMH的浓度关系，计算获得样本中的人抗苗勒氏管激素含量，其中Ab1抗体Ab1-微球偶联物与抗体Ab2-荧光分子标记物的摩尔比为1：1。
具体检测原理如下：血清或血液等样本加入到AMH单克隆抗体Ab1-微球偶联物溶液中，然后加入一定体积的AMH单克隆抗体Ab2的荧光分子标记物溶液，37度孵育30min。由于抗原抗体结合的特异性，样本中的AMH会分别与Ab1-微球偶联物和Ab2的荧光分子标记物结合形成微球-Ab1-AMH-Ab2-荧光分子复合体，此复合体由于偶联在微球上，具有一定粒径大小，经流式细胞仪上机，即可被识别，同时此复合体上标记有荧光分子，经流式细胞仪可以检测出荧光分子发射出的荧光，荧光强度的强弱与样本中AMH的含量成正相关性，根据AMH浓度与体系中的荧光强度之间的标准曲线，可以对通过流式细胞仪上未知样本的荧光强度，对样本中的AMH进行定量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明本发明人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法，采用AMH单克隆抗体库筛选出一对特异性最高的单克隆抗体对，并且能够很好的与血液中的AMH结合，最大限度的减少了样本中其他类似成分的干扰，使得检测准确度更高。其通过抗体微球偶联技术和抗体荧光标记技术，将检测试剂做成即用型试剂，往试剂里加入血清或血样后，根据抗原抗体特异性结合，样本中的AMH就能够与抗体微球和荧光抗体结合，形成复合体，此复合体上含有的一定粒径的微球和荧光分子能被流式细胞仪所识别，荧光强弱直接反应了样本中AMH含量的多少，实现了样本中AMH的流式细胞仪定量检测。
综上所述，本发明首次通过微球偶联抗体技术和荧光标记抗体技术实现了流式细胞仪检测AMH，根据荧光值的强弱直接判断AMH含量的高低，只需往试剂中添加血液样本，就能得到实验结果，简化了检测过程中的实验操作步骤，同时配合自动加样系统，就可实现高通量多样本的连续检测，极大的提高了检测的效率，检测的灵敏度可达到0.01ng/ml。
附图说明
图1为本发明抗体微球偶联物的结构通式示意图；其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；
图2为本发明抗体荧光分子标记物的结构通式示意图，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施一
一种人抗苗勒管激素的流式检测试剂，包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1-微球偶联物和抗体Ab2-荧光分子标记物，其中抗体微球偶联物的结构通式如图1所示，M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；抗体荧光分子标记物的结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子。
上述抗体Ab1和Ab2为成熟AMH蛋白片段免疫小鼠所制备的AMH单克隆抗体对，所述的抗体Ab1和Ab2能同时与AMH抗原结合。
上述AMH单克隆抗体对是从20个鼠源AMH单克隆抗体库中利用十字交叉法筛选配对得到的配对效果最佳一对抗体。
上述单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯(PS)或二氧化硅(SiO2)，所述的单分散微球的外表面功能化修饰有羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键；所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(APC)、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料(Cy2/3/5)。
具体实施例二
人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)AMH单克隆抗体的制备
首先从Uniprot网站上获取完整的AMH蛋白的编码序列和翻译成熟的相应蛋白质的氨基酸序列，用蛋白相关软件分析氨基酸序列的稳定性，抗原表位性，以及生理条件下AMH的结构与序列；选取一段成熟AMH蛋白序列(成熟片段较稳定，不会被降解)(其中成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下所示：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR)作为制备抗苗勒管激素抗体库的抗原，将抗原的碱基序列克隆至原核表达载体pET-41a上，E.coli原核表达系统表达出AMH抗原蛋白，用亲和层析的方法纯化带标签的AMH抗原蛋白；
将AMH抗原蛋白用水溶性佐剂接种免疫5只6-8周龄Balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分别进行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各100uL，ELISA检测血清效价；当效价达到1：50000后，选取血清效价最高的小鼠，拉劲处死，取该小鼠的脾脏，获取脾细胞，然后与小鼠Balb/c品系骨髓瘤细胞sp2/0进行3次融合；在融合24小时后，加HAT选择培养基培养两周，采用96孔板克隆化细胞，筛选出杂交瘤细胞；用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25Flask培养，培养的上清用protein A或proteinG纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；
(2)双抗夹心法筛选能够配对的AMH抗体对
将20个纯化好的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，同时将这20个单克隆抗体包被板，采用十字交叉法检测配对效果，以抗原浓度和标记抗体的量为变量因素，设置阴性对照，空白对照，如果测定值为阴性值的2.1倍，则表示为阳性，筛选出一对配对效果最佳的抗体对Ab1和Ab2，作为偶联微球和荧光分子的前期材料；
其中十字交叉法检测配对效果具体方法如下：
A.将单克隆抗体用0.05M pH＝9.0碳酸盐包被缓冲液稀释得到浓度为1-10μg/ml的抗体溶液，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml上述抗体溶液，4℃包被过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液冲洗3次，每次3分钟；
B.加样：取4ng/mL、0.4ng/ml、40pg/ml和4pg/ml四个浓度的AMH抗原样品0.1ml分别上述已包被的反应孔中，放置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；
C.加酶标抗体：于各反应孔中加入新鲜稀释(经滴定后的稀释度分别为0.5K、1K和2K)的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5-1小时，洗涤3次；
D.加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃显色10-30分钟；
E.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止显色反应；
F.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，重复此实验三次，选取阳性中OD值最大的反应孔所对应的一对抗体，即为配对效果最佳的AMH蛋白的单克隆配对抗体Ab1和Ab2；
(3)AMH单克隆抗体Ab1与微球偶联
将碳二亚胺(EDC)粉末和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末加入到浓度为1mg/mL的AMH单克隆抗体Ab1溶液中，室温避光反应15分钟，然后向反应溶液中加入浓度为0.5wt％的单分散微球溶液，30℃避光震荡反应4小时，用含1wt％的SDS溶液洗涤微球2次，浓度为0.5wt％吐温-20的PBS溶液洗涤微球3次，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab1-微球偶联物，其结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1，将抗体Ab1-微球偶联物保存于含0.5wt％NaCl，PH＝7.4的PB溶液中，待用；其中单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯(PS)、二氧化硅(SiO2)，单分散微球的外表面具有功能化修饰羧基、氨基、羟基或巯基；功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键；碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、单分散微球溶液与AMH单克隆抗体Ab1溶液的混合比为28g：56g：2ml：1ml；
(4)AMH单克隆抗体Ab2的荧光分子标记
将浓度1-10mg/ml的待交联的AMH单克隆抗体Ab2溶液，于4℃用交联反应液(交联反应液的主要成分为：0.09M NaHCO3，0.01M Na2CO3，0.125M NaCl)透析三次，至pH＝9.0得到抗体Ab2溶液；将荧光分子溶于二甲基亚砜中配置成浓度为1mg/mL的荧光分子溶液(每次交联使用的荧光分子溶液均应新鲜配制，避光)；将荧光分子溶液缓慢加入抗体Ab2溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；然后在反应液中加入5mol/L的NH4Cl直至NH4Cl终浓度为50mmol/L，4℃终止反应2h，然后在PBS缓冲液中透析四次以上直至透析液清亮，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab2-荧光分子标记物，其结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子，将抗体Ab2-荧光分子标记物置于pH＝7.4的含有0.1wt％NaN3、1wt％BSA磷酸盐缓冲液中，4℃避光保存；其中抗体Ab2蛋白与荧光分子交联时的比例为1mg：15μg，荧光分子为偶联的荧光染料，荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(APC)、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料(Cy2/3/5)。
具体实施例三
上述人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂的应用，将流式检测试剂的用于检测人抗苗勒氏管激素含量具体步骤如下：将待测样本人血清或血液加入到抗体Ab1-微球偶联物溶液中，然后加入一定体积的抗体Ab2-荧光分子标记物溶液，37度孵育30min，样本中的INHB分别与Ab1抗体微球偶联物和Ab2抗体荧光分子标记物结合形成微球-Ab1-AMH-Ab2-荧光分子复合体，经流式细胞仪可以检测出荧光分子发射出的荧光，根据荧光强度与AMH的浓度关系，计算获得样本中的人抗苗勒氏管激素含量，其中抗体Ab1-微球偶联物与抗体Ab2-荧光分子标记物的摩尔比为1：1。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 浙江星博生物科技股份有限公司
<120> 人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 109
<212> 氨基酸
<213> 人工序列
<220>
<223> 成熟AMH蛋白片段
<400> 1
SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR 109

Claims (10)

1.一种人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1-微球偶联物和抗体Ab2-荧光分子标记物，其中抗体微球偶联物的结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；所述的抗体荧光分子标记物的结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子。
2.根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于：所述的抗体Ab1和Ab2为成熟AMH蛋白片段免疫小鼠所制备的AMH单克隆抗体对，所述的抗体Ab1和Ab2能同时与AMH抗原结合，其中所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR。
3.根据权利要求2所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于：所述的AMH单克隆抗体对是从20个鼠源AMH单克隆抗体库中利用十字交叉法筛选配对得到的配对效果最佳一对抗体。
4.根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于：所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯或二氧化硅，所述的单分散微球的外表面功能化修饰有羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键；所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料。
5.一种根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)AMH单克隆抗体的制备
选取一段成熟AMH蛋白片段序列作为制备抗苗勒管激素抗体库的抗原，将抗原的碱基序列克隆至原核表达载体pET-41a上，E.coli原核表达系统表达出AMH抗原蛋白，用亲和层析的方法纯化带标签的AMH抗原蛋白；其中所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR；
将AMH抗原蛋白用水溶性佐剂接种免疫5只6-8周龄Balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分别进行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各100uL，ELISA检测血清效价；当效价达到1：50000后，选取血清效价最高的小鼠，拉劲处死，取该小鼠的脾脏，获取脾细胞，然后与小鼠Balb/c品系骨髓瘤细胞sp2/0进行3次融合；在融合24小时后，加HAT选择培养基培养两周，采用96孔板克隆化细胞，筛选出杂交瘤细胞；用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25Flask培养，培养的上清用protein A或protein G纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；
(2)双抗夹心法筛选能够配对的AMH抗体对
将20个纯化好的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，同时将这20个单克隆抗体包被板，采用十字交叉法检测配对效果，以抗原浓度和标记抗体的量为变量因素，设置阴性对照，空白对照，如果测定值为阴性值的2.1倍，则表示为阳性，筛选出一对配对效果最佳的抗体对Ab1和Ab2，作为偶联微球和荧光分子的前期材料；
(3)AMH单克隆抗体Ab1与微球偶联
将碳二亚胺粉末和N-羟基琥珀酰亚胺粉末加入到浓度为1mg/mL的AMH单克隆抗体Ab1溶液中，室温避光反应15分钟，然后向反应溶液中加入浓度为0.5wt％的单分散微球溶液，30℃避光震荡反应4小时，用含1wt％的SDS溶液洗涤微球2次，浓度为0.5wt％吐温-20的PBS溶液洗涤微球3次，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab1-微球偶联物，其结构通式如图1所示，其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1，将抗体Ab1-微球偶联物保存于含0.5wt％NaCl，PH＝7.4的PB溶液中，待用；
(4)AMH单克隆抗体Ab2的荧光分子标记
将浓度为1-10mg/ml的待交联的AMH单克隆抗体Ab2溶液，于4℃用交联反应液透析三次，至pH＝9.0得到抗体Ab2溶液；将荧光分子溶于二甲基亚砜中配置成浓度为1mg/mL的荧光分子溶液；将荧光分子溶液缓慢加入抗体Ab2溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；然后在反应液中加入5mol/L的NH4Cl直至NH4Cl终浓度为50mmol/L，4℃终止反应2h，然后在PBS缓冲液中透析四次以上直至透析液清亮，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab2-荧光分子标记物，其结构通式如图2所示，其中Ab2为AMH单克隆抗体2，其中F为荧光分子，将抗体Ab2-荧光分子标记物置于pH＝7.4的含有0.1wt％NaN3、1wt％BSA磷酸盐缓冲液中，4℃避光保存。
6.根据权利要求5所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的十字交叉法检测配对效果具体方法如下：
A.将单克隆抗体用0.05M pH＝9.0碳酸盐包被缓冲液稀释得到浓度为1-10μg/ml的抗体溶液，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml所述的抗体溶液，4℃包被过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液冲洗3次，每次3分钟；
B.加样：取4ng/mL、0.4ng/ml、40pg/ml和4pg/ml四个浓度的AMH抗原样品0.1ml分别上述已包被的反应孔中，放置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；
C.加酶标抗体：于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5-1小时，洗涤3次；
D.加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃显色10-30分钟；
E.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止显色反应；
F.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，重复此实验三次，选取阳性中OD值最大的反应孔所对应的一对抗体，即为配对效果最佳的AMH蛋白的单克隆配对抗体Ab1和Ab2。
7.根据权利要求5所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯、二氧化硅，所述的单分散微球的外表面具有功能化修饰羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键。
8.根据权利要求7所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于：所述的碳二亚胺、所述的N-羟基琥珀酰亚胺、所述的单分散微球溶液与所述的AMH单克隆抗体Ab1溶液的混合比例为28g：56g：2ml：1ml。
9.根据权利要求5所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的抗体Ab2蛋白与所述的荧光分子交联时的比例为1mg：15μg，所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料。
10.权利要求1-9中任一项所述的人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂的应用，其特征在于将流式检测试剂的用于检测人抗苗勒氏管激素含量具体步骤如下：
将待测样本人血清或血液加入到抗体Ab1-微球偶联物溶液中，然后加入一定体积的抗体Ab2-荧光分子标记物溶液，37度孵育30min，样本中的INHB分别与Ab1抗体微球偶联物和Ab2抗体荧光分子标记物结合形成微球-Ab1-AMH-Ab2-荧光分子复合体，经流式细胞仪可以检测出荧光分子发射出的荧光，根据荧光强度与AMH的浓度关系，计算获得样本中的人抗苗勒氏管激素含量，其中Ab1抗体Ab1-微球偶联物与抗体Ab2-荧光分子标记物的摩尔比为1：1。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109613276A (zh) * 2018-12-20 2019-04-12 北京贝尔生物工程股份有限公司 一种高灵敏度、宽检测范围的人抗缪勒管激素测定试剂盒
CN110128535A (zh) * 2019-03-27 2019-08-16 浙江工业大学 一种amh单克隆抗体及其制备与应用
CN110570952A (zh) * 2018-06-05 2019-12-13 北京大学第三医院 预测拮抗剂方案下受试者卵巢低反应概率的系统及指导促性腺激素起始用药剂量选择的系统
CN111077304A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法
CN113406320A (zh) * 2021-08-18 2021-09-17 南京立顶医疗科技有限公司 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103728459A (zh) * 2013-12-25 2014-04-16 李志荣 一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人抗苗勒氏管激素amh的试剂盒制备方法及其应用
CN104730247A (zh) * 2015-03-12 2015-06-24 广州市丰华生物工程有限公司 一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法
CN105527448A (zh) * 2015-12-31 2016-04-27 苏州市博纳泰科生物技术有限公司 抗苗勒管激素的荧光免疫层析检测方法及试剂盒
CN106146642A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 浙江星博生物科技股份有限公司 一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103728459A (zh) * 2013-12-25 2014-04-16 李志荣 一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人抗苗勒氏管激素amh的试剂盒制备方法及其应用
CN104730247A (zh) * 2015-03-12 2015-06-24 广州市丰华生物工程有限公司 一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法
CN105527448A (zh) * 2015-12-31 2016-04-27 苏州市博纳泰科生物技术有限公司 抗苗勒管激素的荧光免疫层析检测方法及试剂盒
CN106146642A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 浙江星博生物科技股份有限公司 一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法和应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110570952A (zh) * 2018-06-05 2019-12-13 北京大学第三医院 预测拮抗剂方案下受试者卵巢低反应概率的系统及指导促性腺激素起始用药剂量选择的系统
CN109613276A (zh) * 2018-12-20 2019-04-12 北京贝尔生物工程股份有限公司 一种高灵敏度、宽检测范围的人抗缪勒管激素测定试剂盒
CN110128535A (zh) * 2019-03-27 2019-08-16 浙江工业大学 一种amh单克隆抗体及其制备与应用
CN111077304A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法
CN113406320A (zh) * 2021-08-18 2021-09-17 南京立顶医疗科技有限公司 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用
CN113406320B (zh) * 2021-08-18 2021-11-02 南京立顶医疗科技有限公司 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用

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