CN113406320B

CN113406320B - 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用

Info

Publication number: CN113406320B
Application number: CN202110948738.0A
Authority: CN
Inventors: 张玉基; 王鹏; 顾佳; 王倩; 仲子进; 夏昌校
Original assignee: Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-08-18
Also published as: CN113406320A

Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其是一种基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用，该方法包括以下步骤：A.将鼠源单克隆抗体Fab段与人源化的IgG1的Fc段进行基因重组，并对人源化的IgG1的Fc段进行突变，在Fc段末端引入半胱氨酸；B.然后通过双功能交联剂，将抗体Fc段定向偶联至氨基微球上。本发明通过重组基因工程抗体的方式，在Fc段精准引入巯基，可避免试剂制备中需要对抗体进行复杂的前处理步骤，保证试剂的批间一致性；通过对Fc段进行了人源化改造，可避免检测样本时的异嗜性抗体等的干扰；并且通过定向偶联技术，提高了试剂测试的准确度以及灵敏度。

Description

基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体领域为一种基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法。

背景技术

鼠单抗作为异源性蛋白在临床检测过程中干扰因素很多，随地域、人种不同，所带来的检测干扰非常大。尽管单抗在诸多领域得到广泛的应用，但根据市场诊断需求的不同，通过杂交瘤技术获取人单抗技术上还存在诸多问题，无法后期加工改造，在治疗，诊断检测应用方面明显滞后。

上世纪90年代出现了抗体库技术，该技术绕过了单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，使人源化抗体的制备达到了一个全新的水平。噬菌体抗体库是其中最早出现，也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示技术是由Smith(Science ,1985)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库利用了以上原理使不同的抗体能够表达在不同的噬菌体表面，进而用抗原对它们进行筛选，由于噬菌体抗体库容量可达到10¹⁰，因此可以较容易从中筛选得到高亲和力(≥10⁹M^－1)的特异性抗体。

通过噬菌体抗体库筛选高亲和力的抗体，再结合基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中，在适当的宿主中表达抗体。借助于基因工程技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造及其它修饰，成为了解决诊断当中所遇到的干扰、偶联等问题的关键。

在体外诊断试剂中，基于抗原抗体免疫复合反应的方法正得到越来越多的应用，其中代表性的有化学发光免疫分析法、荧光免疫层析法、胶乳增强免疫比浊法等。这些方法的关键是将蛋白以共价键的方式偶联至固相载体上（磁微粒、乳胶微球、荧光微球等），其中以抗体偶联固相载体的应用最为广泛。

抗体偶联固相载体的方式主要分为物理吸附和共价偶联。其中，物理吸附是利用抗体与固相载体材料的疏水相互作用和静电力结合。该方法容易受到抗体等电点、疏水基团分布、温度、离子浓度等诸多因素的影响，并且可逆性的吸附对偶联物的稳定性有一定影响。而共价偶联是利用抗体与固相载体材料之间形成共价键进行偶联。但是抗体上的羧基或氨基丰富并且分布在抗体分子的各个位置，因此抗体与固相载体材料的偶联是非定向的，固相载体材料上的氨基或羧基会随机与抗体偶联，改变抗体的共轭结构，很可能由于空间位阻，将抗体与抗原结合的活性部位阻塞，从而降低抗体的结合抗原活性，影响免疫分析方法的稳定性和灵敏度。

目前，已有一些方法报道可以实现定向偶联。例如：

CN112630420A，利用抗体的糖基化位点来实现，但是这种方法有很大的局限性，多数抗体可能未有糖基化修饰，或者即便是有糖基化修饰，也可能位于F(ab)’端，如此无法就无法实现定向偶联。

CN107764992A，通过酶切除抗体Fc段，再将抗体铰链区二硫键打开，然后再实现定向偶联，这种方法也有较大局限，该过程较为复杂，酶切的过程不易控制，需要经过多次纯化，且在还原二硫键的过程中，F(ab)’二硫键也可能被还原，而使得整个抗体失去特异性。

CN109781978A，公开了一种定向偶联抗体Fc端的高分子微球及其制备方法及其应用，其提供的定向偶联抗体Fc端的高分子微球，包括氨基微球和Cys-结合亚基；氨基微球和Cys-结合亚基通过双功能偶联剂的马来酰亚胺基团连接；Cys-结合亚基为N端为半胱氨酸蛋白质亚基；由于Cys-结合亚基的引入，使所述微球能够特异性地结合抗体的Fc端，而不结合抗体的Fab端。该方法利用Protein A的片段桥联抗体，在Protein A上引入Cys，然后利用Protein A与抗体Fc端结合的原理来实现定向。该方法的局限性在于操作步骤较为复杂，需要在微球上先后联两个蛋白，且抗体的Fc端有两条链，在于Protein A片段结合时很容易形成凝集，对生产工艺要求较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用。

本发明通过噬菌体展示技术建立抗体库，并且筛选出亲和力高的抗体，通过基因工程将抗体重组，重组抗体基因经修饰并且融合人源化Fc端，且将人源化的IgG1抗体引入半胱氨酸，使其能够定向偶联到固相载体上。

为实现上述目的，本发明具体提供如下技术方案：

一种基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，包括以下步骤：

（1）将鼠源单克隆抗体的Fab段与人源化的IgG1的Fc段进行基因重组，并对人源化的IgG1的Fc段进行突变，在Fc段末端引入半胱氨酸；

其中，人源化的IgG1-Fc的核苷酸突变序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸突变序列如SEQ ID No：2所示；

（2）然后通过双功能交联剂，将抗体Fc段定向偶联至氨基微球上。

其中，所述步骤（1）中，所述鼠源单克隆抗体是通过噬菌体展示技术建立抗体库，并筛选出的亲和力高的抗体。

其中，所述步骤（1）的具体实验过程为，从免疫动物中获取B细胞——提取总RNA——逆转录获取cDNA-PCR获取目的基因——克隆至噬菌粒载体——电转至大肠杆菌——辅助噬菌体超染——收集上清获取文库——筛选文库找到目的噬菌粒——获取抗体基因——重组抗体——融合IgG1-Fc突变序列——在真核细胞中表达抗体。

其中，所述步骤（1）中，突变位点包括：48位P突变成C，168位Y突变成C，179位G突变成C，185位S突变成C，194位W突变成C，210位H突变成C，221位S突变成C。

其中，所述步骤（2）具体包括：

（1）取氨基聚苯乙烯微球，用PB，pH 7.2缓冲液稀释至3 mg/ml；

（2）称取2 mg双功能交联剂，用DMSO溶至3 mg/ml；将稀释好的SMCC溶液按照1:4的体积比例投入步骤（1）制备的微球稀释液中，37℃恒温震荡孵育0.5小时，完成后离心去除上清，并用PB，pH 7.2缓冲液重悬；所述双功能交联剂为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）、琥珀酰亚胺基-[4-(N-马来酰亚胺甲基)]-环己烷-1-甲酸-(6-氨基己酸酯) （LC-SMCC）、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯（SPDP）、3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯（MBS）等的任一种；

（3）用PB，pH 7.2缓冲液将基因工程改造的巯基化抗体稀释至1 mg/ml，按照1:5的体积比加入到步骤（2）制得的SMCC活化好的微球中；37℃恒温震荡孵育1小时，并在完成后加入1％牛血清白蛋白溶液封闭，37℃恒温震荡孵育1小时；

（4）取上述封闭后试剂离心去除上清，并用10 mM Tris，4% 海藻糖，pH7.5溶液重悬混匀；再用超声分散，即得定向偶联的抗体微球复合物。

本发明所述基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法可用于制备血清淀粉样蛋白A检测试剂、D-二聚体检测试剂或降钙素原检测试剂或者用于免疫比浊方法。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明通过重组基因工程抗体的方式，在Fc段精准引入巯基，可以避免试剂制备过程中需要对抗体进行复杂的前处理步骤，使得制备的试剂具有更为卓越的批间一致性。

（2）本发明在重组基因工程抗体的过程中对Fc段进行改造，可以避免在检测样本时的异嗜性抗体等的干扰，极大程度提高了试剂测试的准确度。

（3）本发明基于抗体Fc段的巯基，对传统抗体标记工艺改进，通过较为简单的方式实现定向偶联，提升了试剂的灵敏度。

附图说明

图1为本发明定向偶联方法的技术原理示意图；

图2为不同血清淀粉样蛋白A检测试剂（SAA试剂）受RF的干扰程度；其中，SAA-1为实施例3制备的SAA试剂；SAA-2为市售的SAA试剂；SAA-3为对比例2制备的SAA试剂；

图3为不同D-二聚体检测试剂（D-Dimer试剂）受RF的干扰程度；其中，D-Dimer-1为实施例4制备的D-Dimer试剂；D-Dimer-2为对比例3制备的D-Dimer试剂；D-Dimer-3为市售的D-Dimer试剂；

图4为本发明方法制备的PCT试剂（PCT-1）的LOD图；

图5为传统偶联技术制备的PCT试剂(PCT-2)的LOD图；

图6为市售PCT试剂(PCT-3)的LOD图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 基因工程改造的巯基化抗体的制备

（1）用重组目标蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏分离淋巴细胞；用RNA提取试剂盒，从分离的淋巴细胞中提取总RNA，用反转录试剂盒反转录合成cDNA，用鼠源单链抗体scfv通用简并引物扩增重链可变区以及轻链可变区基因；将目标基因克隆至噬菌体载体pCANTAB5E(Pharmacia)上，用细菌电转化仪分多次电转入大肠杆菌TG1电转感受态，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及2％葡萄糖的2× YTAG平板，于30℃恒温培养过夜后，取适量的2× YT培养基用无菌玻璃棒将平板上的菌落全部刮取下来并收集菌体悬液，用2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)稀释细胞悬液至OD600＝0.2，37℃培养至对数生长期(约OD600＝0.4)，加入辅助噬菌体M13K07超感染。37℃震荡培养后，离心取上清，即为单链抗体噬菌体表达文库。

（2）将重组目标蛋白包被于聚乙烯培养皿，将含有重组噬菌体的上清于该培养皿中37℃孵育2小时。用PBS洗培养皿20次，再用PBST洗平皿20次，弃PBST。加入10mL处于对数生长期TG1细胞，37℃培养1小时。离心，收集上清，进行下一轮筛选。重复“吸附-洗脱-繁殖”的筛选过程2次。在以M13K07辅助噬菌体超感染，针对目标蛋白的特异性scfv得以富集。将最后一轮洗脱中和后的噬菌体侵染TG1大肠杆菌后涂布于2×YTAG平板上，于30℃恒温培养12小时后随机挑取90个单克隆菌落于96孔深孔板中，用2×YT AG培养基37℃，250rpm振荡2h后加入一定量M13K07辅助噬菌体进行超感染，37℃，250rpm振荡1h后离心去掉上清加入含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及卡那青霉素抗性(50μg/mL)的2×YTAK培养基30℃，250rpm过夜培养。离心、收集上清，即为单克隆重组噬菌体。第二天进行单克隆ELISA筛选，从中挑选出与重组目标蛋白结合活性最强的几对阳性克隆，测序得到scfv序列。

（3）将得到的单链抗体scfv序列分别构建成人源化的IgG1抗体序列，并对人源化的IgG1的Fc段进行突变，其中，人源化的IgG1-Fc的核苷酸突变序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸突变序列如SEQ ID No：2所示；

突变位点包括：48位P突变成C，168位Y突变成C，179位G突变成C，185位S突变成C，194位W突变成C，210位H突变成C，221位S突变成C。

（4）将scfv中重链可变区与轻链可变区通过PCR分别与突变后的人源的IgG1重链恒定区和轻链恒定区桥接，再分别插入到pcDNA3.1(德国Novagen公司)质粒中。分别通过PEI将构建好的重链质粒与轻链质粒共转染HEK293F细胞，37℃，5％二氧化碳，120rpm细胞摇床表达7天后离心收集上清。用Protein A层析柱得到纯化的人源化单克隆抗体。

实施例2 利用双功能交联剂将基因工程改造的巯基化抗体与氨基微球定向偶联

结合图1所示，具体实验过程为：

（1）取Spherotech氨基聚苯乙烯微球（AP-025-100），用PB，pH 7.2缓冲液稀释至3mg/ml；

（2）称取2 mg SMCC，用DMSO溶至3 mg/ml；将稀释好的SMCC溶液按照1:4的体积比例投入上述微球稀释液中，37℃恒温震荡孵育0.5小时，完成后离心去除上清，并用PB，pH7.2缓冲液重悬；

（3）用PB，pH 7.2缓冲液将实施例1制备的基因工程改造的巯基化抗体稀释至1mg/ml，按照1:5的体积比加入到向上述SMCC活化好的微球中；37℃恒温震荡孵育1小时，并在完成后加入1％牛血清白蛋白溶液封闭，37℃恒温震荡孵育1小时；

（4）取上述封闭后试剂离心去除上清，并用10 mM Tris，4% 海藻糖，pH7.5溶液重悬混匀；再用超声分散，即为抗体微球复合物。

对比例1 利用传统偶联技术将杂交瘤鼠单克隆抗体与羧基微球偶联

（1）取JSR羧基聚苯乙烯微球（P0221），用MES，pH 6.0缓冲液稀释至3 mg/ml；

（2）称取2 mg EDAC，用水溶至1 mg/ml；将稀释好的EDAC溶液按照1:5的体积比例投入上述微球稀释液中，37℃恒温震荡孵育0.5小时，完成后离心去除上清，并用PB，pH 7.2缓冲液重悬；

（3）用PB，pH 7.2缓冲液将杂交瘤鼠单克隆抗体稀释至1 mg/ml，按照1:5的体积比加入到向上述活化好的微球中；37℃恒温震荡孵育1小时，并在完成后加入1％牛血清白蛋白溶液封闭，37℃恒温震荡孵育1小时；

（4）取上述封闭后试剂离心去除上清，并用10 mM Tris，4% 海藻糖，pH8.0溶液重悬混匀，再用超声分散，即为抗体微球复合物。

实施例3 利用实施例2的定向偶联技术制备血清淀粉样蛋白A检测试剂（胶乳增强免疫比浊法）

参照实施例1的重组基因工程方法制备两株配对的巯基化抗人SAA单克隆抗体，参照实施例2的方法分别制备抗体微球复合物，制备完成后将两种抗体微球复合物1:1混匀即为R2试剂。

血清淀粉样蛋白A检测试剂的具体成分如下：

试剂R1：

Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g/L

KH₂PO₄ 0.2 g/L

KCl 0.2 g/L

NaCl 8 g/L

Tween 20 0.1% v/v

PEG 6000 10 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

试剂R2：

Tris-HCl（pH8.0） 10 mM

重组抗人SAA抗体微球复合物 3 g/L

海藻糖 40 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

对比例2 利用传统偶联技术制备血清淀粉样蛋白A检测试剂（胶乳增强免疫比浊法）

参照对比例1的传统偶联技术，用配对的杂交瘤鼠抗人SAA单克隆抗体分别制备抗体微球复合物，制备完成后将两种抗体微球复合物1:1混匀即为R2试剂。

血清淀粉样蛋白A检测试剂的具体成分如下：

试剂R1：

Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g/L

KH₂PO₄ 0.2 g/L

KCl 0.2 g/L

NaCl 8 g/L

Tween 20 0.1% v/v

阻断剂 0.1 g/L

PEG 6000 10 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

试剂R2：

Tris-HCl（pH7.5） 10 mM

杂交瘤鼠抗人SAA抗体胶乳复合物 3 g/L

海藻糖 40 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

实施例4 利用实施例2的定向偶联技术制备D-二聚体检测试剂（胶乳增强免疫比浊法）

参照实施例1的重组基因工程方法制备的巯基化抗人D-Dimer单克隆抗体，按照实施例2的方法分别制备抗体微球复合物，即为R2试剂。

D-二聚体检测试剂的具体成分如下：

试剂R1：

Tris-HCl（pH7.2） 10 mM

NaCl 8 g/L

Tween 20 0.05% v/v

Proclin 300 0.1% v/v

试剂R2：

Tris-HCl（pH8.0） 10 mM

重组抗人D-Dimer抗体胶乳复合物 2 g/L

海藻糖 30 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

对比例3 利用传统偶联技术制备D-二聚体检测试剂（胶乳增强免疫比浊法）

参照对比例1的传统偶联技术，用杂交瘤鼠抗人D-Dimer单克隆抗体制备抗体微球复合物，即为R2试剂。

D-二聚体检测试剂的具体成分如下：

试剂R1：

Tris-HCl（pH7.2） 10 mM

NaCl 8 g/L

Tween 20 0.05% v/v

阻断剂 0.5 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

试剂R2：

Tris-HCl（pH8.0） 10 mM

杂交瘤鼠抗人D-Dimer抗体胶乳复合物 2 g/L

海藻糖 30 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

实施例5 利用实施例2的定向偶联技术制备降钙素原检测试剂（胶乳增强免疫比浊法）

参照实施例1的重组基因工程方法制备的两株配对巯基化抗人PCT单克隆抗体，参照实施例2的方法分别制备抗体微球复合物，即为R2试剂。

降钙素原检测试剂的具体成分如下：

试剂R1：

HEPES (pH 7.0) 20 mM

NaCl 40 g/L

Tween 20 0.3% v/v

Emulgen B66 0.1% v/v

BSA 1 g/L

PEG 6000 10 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

试剂R2：

HEPES (pH 7.6) 20 mM

重组抗人PCT抗体胶乳复合物 1.5 g/L

海藻糖 40 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

对比例4 利用传统偶联技术制备降钙素原检测试剂（胶乳增强免疫比浊法）

参照对比例1的传统偶联技术，用两株配对的杂交瘤鼠抗人PCT单克隆抗体制备抗体微球复合物，即为R2试剂。

降钙素原检测试剂的具体成分如下：

试剂R1：

HEPES (pH 7.0) 20 mM

NaCl 40 g/L

Tween 20 0.3% v/v

Emulgen B66 0.1% v/v

BSA 1 g/L

PEG 6000 10 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

试剂R2：

HEPES (pH 7.6) 20 mM

杂交瘤鼠抗人PCT抗体胶乳复合物 1.5 g/L

海藻糖 40 g/L

Proclin 300 0.1% v/v

实施例6 RF干扰检测

（1）向无溶血、黄疸、乳糜、浑浊现象的混合血清，添加高浓度的RF干扰物至4000IU/mL，得到高浓度的RF干扰血清；

（2）另取同样的混合血清加入与RF干扰物同体积的水，得到低浓度干扰血清；

（3）将两种血清按照不同比例混合，得到一系列梯度的RF干扰血清；

（4）分别用不同方法制备的检测试剂测定，对比测试结果。

一、不同SAA试剂受RF的干扰程度

分别选用实施例3制备的SAA试剂（SAA-1）、市售的SAA试剂（SAA-2）以及对比例2制备的SAA试剂（SAA-3）测试RF干扰物的影响程度。

结果如图2所示，随着RF浓度增加，SAA-1的检测结果偏差较小；SAA-2在RF干扰物浓度125 IU/mL以上时，检测结果偏差已经超过50%；SAA-3中添加了阻断剂，有一定抗干扰能力，但在RF干扰物浓度500 IU/mL以上时，检测结果偏差已经超过10%；综上，就抗RF干扰能力而言，SAA-1>SAA-3>SAA-2。

通过上述实验结果可以看出，采用本发明技术制备的SAA试剂显著提升了抗干扰能力。

二、不同D-Dimer试剂受RF的干扰程度

分别选用实施例4制备的D-Dimer试剂（D-Dimer-1）、对比例3制备的D-Dimer试剂（D-Dimer-2）以及市售的D-Dimer试剂（D-Dimer-3）测试RF干扰物的影响程度。

结果如图3所示，随着RF浓度增加，D-Dimer-1的检测结果偏差较小；D-Dimer-2在RF干扰物浓度500 IU/mL以上时，检测结果偏差已经超过10%；D-Dimer-3在RF干扰物浓度500 IU/mL以上时，检测结果偏差已经超过10%；所以，就抗RF干扰能力而言，D-Dimer-1>D-Dimer-3>D-Dimer-2。

通过上述实验结果可以看出，采用本发明技术制备的D-Dimer试剂显著提升了抗干扰能力。

实施例7 PCT试剂灵敏度对比

取无溶血、黄疸、乳糜、浑浊现象的低值混合血清，采用罗氏化学发光法测定其浓度，然后用PBS缓冲液稀释成一系列特定浓度的标本。

分别选用实施例5制备的PCT试剂（PCT-1）、对比例4制备的PCT试剂（PCT-2）以及市售的PCT试剂（PCT-3）测试其结果。其中，LOD用2SD的方法得到，LOQ的值以CV≤20%为界。LOD和LOQ值越低，试剂的灵敏度越高。

表1 实施例5制备的PCT试剂（PCT-1）测试结果

表2对比例4制备的PCT试剂(PCT-2)的测试结果

表3 市售PCT试剂(PCT-3)的测试结果

由表1以及图4结果可知，实施例5制备的PCT试剂（PCT-1）的LOD可达到0.05 ng/mL，LOQ可达到0.15 ng/mL；由表2以及图5结果可知，对比例4制备的PCT试剂（PCT-1）的LOD仅达到0.15 ng/mL，LOQ可达到0.25 ng/mL；由表3以及图6结果可知，市售的PCT试剂（PCT-1）的LOD仅达到0.1 ng/mL，LOQ可达到0.25 ng/mL；

综上所述，采用本发明方法制备的PCT试剂可明显提高试剂的灵敏度。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 南京立顶医疗科技有限公司

<120> 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 675

<212> DNA

<213> IgG1-Fc的核苷酸突变序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccccatgcc catcatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 60

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 120

gtggacgtga gccaggaaga ctgcgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 180

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 240

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 300

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 360

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 420

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 480

aatgggcagc cggagaacaa ctgcaagacc acgcctcccg tgctggactc cgactgctcc 540

ttcttcctct actgcaggct aaccgtggac aagagcaggt gccaggaggg gaatgtcttc 600

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgtgc aaccactaca cacagaagag cctctccctg 660

tgtccgggta aataa 675

<210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> IgG1-Fc的氨基酸突变序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

20 25 30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Cys

35 40 45

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

65 70 75 80

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

100 105 110

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Cys Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Cys Ser Phe Phe Leu Tyr Cys Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Cys Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

195 200 205

Leu Cys Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Cys Pro Gly Lys

210 215 220

Claims

1.一种基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：

A．将鼠源单克隆抗体的Fab段与人源化的IgG1的Fc段进行基因重组，此过程中对人源化的IgG1的Fc段进行突变，在Fc段末端引入半胱氨酸；

其中，人源化的IgG1-Fc的核苷酸突变序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸突变序列如SEQID No：2所示；

B. 然后通过双功能交联剂，将抗体Fc段定向偶联至氨基微球上，具体包括：

a. 取氨基聚苯乙烯微球，用PB，pH 7.2缓冲液稀释至3 mg/ml；

b．称取2 mg 双功能交联剂，用DMSO溶至3 mg/ml；将稀释好的SMCC溶液按照1:4的体积比例投入步骤a制备的微球稀释液中，37℃恒温震荡孵育0.5小时，完成后离心去除上清，并用PB，pH 7.2缓冲液重悬；所述双功能交联剂为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、琥珀酰亚胺基-[4-(N-马来酰亚胺甲基)]-环己烷-1-甲酸-(6-氨基己酸酯)、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯、3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯的任一种；

c. 用PB，pH 7.2缓冲液将基因工程改造的巯基化抗体稀释至1 mg/ml，按照1:5的体积比加入到步骤b制得的SMCC活化好的微球中；37℃恒温震荡孵育1小时，并在完成后加入1％牛血清白蛋白溶液封闭，37℃恒温震荡孵育1小时；

d. 取上述封闭后试剂离心去除上清，并用10 mM Tris，4% 海藻糖，pH7.5溶液重悬混匀；再用超声分散，即得定向偶联的抗体微球复合物。

2.根据权利要求1所述的基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于：所述步骤A中，所述鼠源单克隆抗体是通过噬菌体展示技术建立抗体库，并筛选出的亲和力高的抗体。

3.根据权利要求2所述的基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于：所述步骤A的具体实验过程为，从免疫动物中获取B细胞——提取总RNA——逆转录获取cDNA-PCR获取目的基因——克隆至噬菌粒载体——电转至大肠杆菌——辅助噬菌体超染——收集上清获取文库——筛选文库找到目的噬菌粒——获取抗体基因——重组抗体——融合IgG1-Fc突变序列——在真核细胞中表达抗体。

4.根据权利要求1所述的基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于：所述步骤A中，突变位点包括：48位P突变成C，168位Y突变成C，179位G突变成C，185位S突变成C，194位W突变成C，210位H突变成C，221位S突变成C。

5.权利要求1-4任一所述基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法制备的抗体微球复合物。

6.权利要求1-4任一所述基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法在制备血清淀粉样蛋白A检测试剂、D-二聚体检测试剂或降钙素原检测试剂中的应用或在免疫比浊方法中的应用。