CN116041487A - 一种模块化制备抗体的方法 - Google Patents

一种模块化制备抗体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116041487A
CN116041487A CN202211000499.7A CN202211000499A CN116041487A CN 116041487 A CN116041487 A CN 116041487A CN 202211000499 A CN202211000499 A CN 202211000499A CN 116041487 A CN116041487 A CN 116041487A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
fragment
plasmid
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211000499.7A
Other languages
English (en)
Inventor
罗绍祥
杨旭
高霞
杨洁
舒芹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cusabio Biotech Co ltd
Original Assignee
Cusabio Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cusabio Biotech Co ltd filed Critical Cusabio Biotech Co ltd
Priority to CN202211000499.7A priority Critical patent/CN116041487A/zh
Publication of CN116041487A publication Critical patent/CN116041487A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种模块化制备抗体的方法，包括载体设计、抗体库构建、抗体筛选、抗体分模块表达以及将分模块表达的抗体可变区和恒定区体外组装等步骤。该方法将SpyTag/SpyCatcher应用于抗体筛选和抗体表达环节，其中SpyTag标签插入抗体库展示载体实现标签和抗体可变区的融合表达，抗体恒定区部分与SpyCatcher融合表达形成通用的抗体组装模块，有效地解决了全长抗体需要哺乳表达的问题，可以实现抗体低成本，高通量，高效率制备。

Description

一种模块化制备抗体的方法
技术领域
本发明属于抗体筛选与表达技术领域，具体涉及一种抗体可变区和恒定区分模块表达后自动组装成完整抗体的方法。
背景技术
机体是在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。抗体是由重链和轻链构成的异源四聚体，重链和轻链之间通过二硫键连接。轻链有κ和λ两种，重链有μ、δ、γ、ε和α五种。抗体的主要功能是结合抗原、激活补体和结合细胞等，是科学研究、疾病诊断、药物开发的重要原料。
抗体库技术是利用分子生物学方法，扩增抗体重链和轻链的可变区基因，重组到展示载体，并转化宿主细胞获得抗体文库，结合抗原亲和力筛选获得特定抗体及其序列的技术。抗体库技术模拟动物体内抗体产生的过程，通过抗原亲和力筛选获得单克隆抗体。相对于杂交瘤技术，抗体库技术无需免疫动物，理论上多样性达到1010的抗体库，包含识别所有抗原的抗体。同时，由于抗体库技术无动物免疫过程，毒性蛋白、自身蛋白均可通过此技术获得抗体。按照抗体基因的来源，抗体库分为天然库、免疫库、半合成抗体库、合成抗体库四种。其中天然库采用未经动物免疫的淋巴细胞构建，免疫库采用免疫后动物的淋巴细胞构建，半合成抗体的部分抗体基因来源于基因合成，合成抗体库基因全部来源于基因合成。用于展示抗体库的技术有噬菌体展示、酵母表面展示、细菌表面展示和核糖体展示等，其中噬菌体展示是应用最普遍的展示技术，由于细菌扩增快速，培养成本低廉，便于大量制备单克隆抗体，用于生物学和医学研究。
SpyTag/SpyCatcher是来源于CnaB2结构域的蛋白/多肽连接体系，在多种条件下可以自发形成异肽键，使其在蛋白研究领域获得了广泛应用，如在生物藕连、疫苗研究和耐热酶制备等。CnaB2分为两个部分，其中一个为SpyTag，是一条13个氨基酸的多肽；另外一个部分为SpyCatcher，是含有116个氨基酸残基的蛋白。SpyTag上的Asp和SpyCatcher上的Lys之间形成异肽共价键，从而实现蛋白之间的稳定连接。
发明内容
有鉴于此，本发明将SpyTag/SpyCatcher应用于抗体筛选和抗体表达环节，实现了抗体恒定区和可变区分模块表达，并基于SpyTag/SpyCatcher的作用实现恒定区模块和可变区模块的体外自动组装。
本发明的技术方案具体如下：
本发明提供了一种模块化制备抗体的方法，包括以下步骤：
S1、载体设计：将Spytag片段与第一质粒体连接得到第一重组载体，将SpyCatcher片段与第二质粒连接得到第二重组载体，其中第二质粒中含有抗体恒定区基因片段；
S2、抗体库构建：将抗体可变区基因插入第一重组载体中，且所得连接产物转染宿主菌后，再与噬菌体混合培养，分离噬菌体后重悬即得噬菌体展示抗体库溶液；
S3、抗体筛选：利用包被有抗原蛋白的树脂从噬菌体展示抗体库溶液中淘选识别该抗原蛋白的单链抗体，再通过酶联免疫法进一步淘选得到阳性的单克隆噬菌体；
S4、抗体分模块表达：采用阳性的单克隆噬菌体感染宿主菌，培养表达并纯化得到抗体的可变区模块；将第二重组载体转染哺乳动物细胞，培养表达并纯化得到抗体的恒定区模块；
S6、将纯化后的可变区模和恒定区模块于体外组装，得到全长的抗体。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S1具体为：以第一质粒为模板，用SEQ ID NO:1～2所示的引物对扩增得到片段1，再将片段1和第一质粒分别酶切后连接即可得到第一重组载体；以SEQ ID NO:3所示序列为模板，用SEQ ID NO:4～5所示的引物对扩增得到片段2，再将片段2和第二质粒分别酶切后连接即可得到第二重组载体。在具体的实施例中，第一质粒可以为pCantab 5E质粒，第二质粒可以为pSecTag2A-Fc2质粒。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中的抗体可变区基因的制备方法为：用SEQID NO:6～7所示的引物对扩增天然纳米抗体库的FR1到FR3，得到片段3，再将片段3与人工合成的CDR3基因拼接即可获得抗体基因。
纳米抗体中只包含重链不包含轻链，故可以理解的是，本发明中的抗体可变区基因为重链可变区基因，抗体恒定区基因为重链恒定区基因。
更进一步地，上述技术方案中的CDR3基因的合成方法为：所述CDR3基因的合成方法为：用SEQ ID NO:8～9所示的引物对扩增天然纳米抗体库的FR4，得到片段4；片段4酶切后与NNNR1连接，所得连接产物扩增后酶切后与NNNR2连接，所得连接产物扩增后酶切后与NNNR3连接，如此重复用NNNR1、NNNR2和NNNR3拼接，使得最终拼接产物中含有6～16个拼接片段；其中所述NNNR1、NNNR2和NNNR3的序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15所示。
更进一步地，拼接NNNR1时所用扩增引物对的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9，拼接NNNR2时所用扩增引物对的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:9，拼接NNNR3时所用扩增引物对的序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9。
进一步地，在上述技术方案中，宿主菌可以为大肠杆菌。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中淘选识别抗原蛋白的单链抗体的方法为：取噬菌体展示抗体库溶液并加入Triton X-100混匀，再加入未活化的树脂进行反应，离心取上清加入并加入包被有抗原蛋白的树脂进行反应，离心得沉淀，多次漂洗后洗脱，再离心取上清并加入宿主菌感染，诱导培养即得。
更进一步地，上述技术方案的漂洗过程中，先用含Triton X-100的漂洗缓冲液多次漂洗，再用含Tween-20的漂洗缓冲液漂洗多次。
更进一步地，在上述技术方案中，树脂可以为His Bind Resin；包被有抗原蛋白树脂的制备方法为：先将树脂活化，再将抗原蛋白与活化后的树脂于缓冲液中混匀反应，多次漂洗后即得。
更进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中淘选阳性的单克隆的过程具体为：将感染的宿主菌诱导培养后离心取上清液，该上清液中含有制备好的单链抗体；将抗原蛋白加入到ELISA板中进行包被、封闭处理，然后加入单链抗体上清和PBSM进行反应，待结束后洗涤，再加入anti-E/HRP conjugation孵育，再次洗涤后加入TMB底物溶液并避光反应，终止反应后测定OD450值，并挑选OD450值较大的鉴定。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S6具体为：将纯化的可变区模块和恒定区模块按质量比2:1混合并于4℃放置结合，待结合完毕后进行纯化。其中纯化的方式可以为：先通过层析柱纯化，再通过透析袋纯化。
本发明的有益效果为：本发明将SpyTag标签插入抗体库展示载体，实现标签和抗体融合表达，且插入小的SpyTag标签不影响抗体活性；通过噬菌体展示高通量筛选获得抗体可变区基因，抗体可变区经筛选后可以在大肠杆菌中直接表达，获得抗体的可变区模块；SpyCatcher蛋白则与抗体表达载体融合，抗体恒定区部分与SpyCatcher融合后，通过哺乳细胞大量制备，形成通用的抗体组装模块，该模块在体外与抗体的可变区模块组装，形成完整的抗体分子。该方法有效地解决了全长抗体需要哺乳表达的问题，实现了抗体低成本、高通量、高效率的制备，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中第一重组载体的结构示意图；
图2为实施例1中第二重组载体的结构示意图；
图3为实施例1中制备的抗体可变区基因的凝胶电泳检测结果图；
图4为实施例1制备的噬菌体展示抗体库的库容测定图；
图5为实施例1中RBD蛋白的阳性克隆检测结果图；
图6为实施例1中抗体恒定区表达的SDS-PAGE检测结果图，其中第一个泳道为marker，第二泳道为纯化后的抗体恒定区，第三道为浓缩后的抗体恒定区；
图7为实施例1中全长抗体组装后的ELISA检测图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本实施例抗体的制备过程具体如下：
1、载体设计
以pCantab 5E为模板用F1/R1引物(序列如SEQ ID NO:1～2所示)扩增得到片段1，以合成的SpyCatcher基因(序列如SEQ ID NO:3所示)为模板用F2/R2引物(序列如SEQ IDNO:4～5所示)扩增得到片段2。其中，扩增体系为：模板加0.5μL，引物各0.5μL，taq酶10×buffer 5μL，dntp 4μL，taq 0.5μL，加水到50μL；反应条件为：94℃、30s，54℃、30s，72℃、60s，扩增30个循环；将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下目的片段，用天根胶回收柱回收目的片段的扩增产物。
将片段1、片段2、pCantab 5E质粒、pSecTag2A-Fc2质粒分别用sfiI和notI酶切。其中，酶切体系为：DNA 2μg，酶切10×buffer 5μL，酶2μL，加水至50μL；酶切2h后，1.5％的琼脂糖胶切胶，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用。再将酶切后的片段1与pCantab 5E质粒连接(所得产物即为噬菌粒载体，记为第一重组载体，其结构具体如图1所示)，酶切后的片段2与pSecTag2A-Fc2质粒连接(所得产物即为抗体恒定区表达载体，记为第二重组载体，且其结构具体如图2所示)。其中，连接体系为：载体1μL，片段7.8μL，10×连接buffer1μL，T4连接酶0.2μL；并于22℃连接1h。将连接产物加入到100μL氯化钙中转化为感受态，42℃热激90s立即插入冰上放置5min，加入800μL LB培养基并于37℃摇床复苏1h，涂平板37℃培养箱倒置培养过夜，挑斑3-5个克隆送测序分析，保种正确的克隆。
2、抗体库构建
(1)抗体可变区基因的制备
用引物F3/R3(序列如SEQ ID NO:6～7所示)扩增天然纳米抗体库的FR1到FR3，得到片段3，用引物F4/R4(序列如SEQ ID NO:8～9所示)扩增天然纳米抗体库的FR4，得到片段4。其中，扩增体系为：模板加0.5μL，引物各0.5μL，taq酶10×buffer 5μL，dntp 4μL，pfu酶0.5μL，加水到50μL；反应条件为：94℃、30s，54℃、30s，72℃、30s，扩增25个循环；将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下目的片段，用天根胶回收柱回收目的片段扩增产物。
以片段4为基础合成CDR3基因，合成方法包括以下步骤：
①将片段4用mlyi酶切，用天根回收试剂盒回收酶切产物；再将10pmol的NNNR1混合物(A＝3％，D＝6％，E＝3％，F＝3％，G＝15％，H＝2％，I＝3％，K＝3％，L＝4％，N＝3％，P＝3％，Q＝3％，R＝6％，S＝15％，T＝3％，V＝3％，W＝4％，Y＝18％)连接到3.3pmol的酶切后的片段4上，反应体积为20μL；将连接产物1000稀释，再使用高保真聚合酶(Pfu)100μL进行PCR扩增，使用天根DNA纯化试剂盒对PCR产物进行回收，将得到的DNA重悬在30μL的水中，其中扩增所用引物对的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9所示；
②取①中25μL产物，用10个单位的快速消化mlyi在50μL的反应体积中消化，然后热灭活；再参照步骤①将NNNR2连接到mlyi消化后的产物片段上，且将连接产物稀释后扩增，扩增所用引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:9所示，所得扩增产物重悬；
③取②中产物，参照②将NNNR2连接到mlyi消化后的产物片段上，扩增所用引物如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9所示；
④取③中产物，参照①将NNNR1连接；
⑤循环重复上述操作，一直拼接到16个长度的氨基酸。
其中，NNNR1、NNNR2和NNNR3具体如下所示：
NNNR1:NNN(RC)TACGTGACTCGCAATGACATCGTATTTTTACGATGTCATTGCGAGTCACGTANNN；
NNNR2:NNN(RC)CCGACGACTCAGTGTCACTGATCTTTTTAGATCAGTGACACTGAGTCGTCGGNNN；
NNNR3:NNN(RC)AGATGGACTCCCTAAGTGCCTGTTTTTTAACAGGCACTTAGGGAGTCCATCTNNN；
每个密码子包含一个“NNN”密码子[丙氨酸＝GCT；半胱氨酸＝TGC；天冬氨酸＝GAT；谷氨酸＝GAA；苯丙氨酸＝TTC；甘氨酸＝GGC；组氨酸＝CAT；异亮氨酸＝ATC；赖氨酸＝AAG；亮氨酸＝CTG；蛋氨酸＝ATG；天冬酰胺＝AAC；脯氨酸＝CCG；谷氨酰胺＝CAG；精氨酸＝CGT；丝氨酸＝TCT；苏氨酸＝ACC；缬氨酸＝GTG；酪氨酸＝TAC)，而“NNN(RC)”代表每个NNN密码子的反向序列。
将拼接好的6-16个长度的片段分别连接片段3，使用高保真聚合酶(Pfu)100μL进行PCR扩增，将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析并切下目的片段(具体如3所示)，用天根胶回收柱回收目的片段扩增产物。最后将6-16个长度的扩增产物混合在一起，备用。
(2)可变区抗体基因与噬菌粒载体的融合及检测
用SfiⅠ和NotⅠ双酶切噬菌粒载体(即第一重组载体)和可变区抗体基因片段，1.5％的琼脂糖胶切胶，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用；配制连接反应体系，将可变区抗体基因连入酶切后的第一重组载体，其中连接反应体系为：载体1.5μg，抗体0.5μg，T4连接酶2μL，10×buffer10μL，加水至100μL；在PCR仪上16℃连接过夜。
TG1划线接种到Minimal培养板37℃培养过夜，再接种TG1单菌落至5mL 2YT培养液中于37℃振荡培养过夜，次日将菌液加至300mL的2YT培养液中，振荡培养至OD600达到0.4～0.5。将菌液冰浴30min后，在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min，再用300mL预冷的灭菌去离子水于冰水浴中轻柔重悬沉淀至沉淀细胞完全均匀地分散于水中；再在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min，再依次用150mL预冷的灭菌去离子水和30mL预冷的10％甘油(用灭菌去离子水配制)按前述方法重悬细胞两次；最后将细胞重悬于1mL预冷的10％甘油中，置于冰上立即使用或分装，冻存于-80℃中待用。
向100μLTG1感受态中加入5μL连接产物(即可变区抗体基因与第一重组载体的连接产物)，放于冰上预冷，再转入预冷后的电转杯中；调节电转仪电压2.5KV电击时间5ms，电击后迅速加入0.9mL 2YT培养基，37℃振荡培养2小时。
取20μL菌液依次稀释到180μL 2YT培养基中，获得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8几个稀释浓度，并涂布于SOBAG平板上。图4中的5、6、7、8分别对应10-5、10-6、10-7、10-8几个稀释度，从图4可见，1mL菌液中的细菌个数约为2×108个，故整个库电转100次，获得的库容为2×1010。
可以取部分菌液涂布于10个SOBAG平板上，37℃培养过夜，再从SOBAG平板上随机挑取20个克隆，用菌落PCR检测抗体基因插入载体的效率；还可以测序分析，检测抗体库容，抗体基因的完整性及多样性。
(3)拯救噬菌体展示抗体库
将构建好的纳米抗体库以噬菌粒的形式保存在宿主菌中，在淘选过程开始前，应当先拯救文库，使其成为噬菌体展示的抗体库。具体方法如下：
将1.5mL带E-tag标签(pCantab 5E质粒上携带的)的抗体库接种到300mL 2YT-AG培养基中培养至OD600约0.3～0.4；37℃振荡培养约1.5h至OD600＝0.5～0.6，按细菌∶phage＝1:5加入helper phage辅助噬菌体(M13K07)，37℃振荡培养约1h；4000rpm 15℃离心15min去除培养基后，加入200mL 2YT-AK培养基(100μg/mL Amp，50μg/mL Kan)重悬细菌，37℃培养2h；10000rpm离心20min去除沉淀后，在上清中加入40mL PEG/NaCl沉淀phage，冰浴过夜；10000rpm离心20min去掉上清，并用0.6mL 2YT培养基重悬phage，4℃备用。在实际操作过程中，若需要大量制备phage，更换kan抗性的培养基以后，培养时间可以从两小时延长至过夜培养。获得的噬菌体经过梯度稀释，感染TG1菌，涂布SOBAG平板，通过菌落计数计算噬菌体库滴度。
3、抗体筛选
本实施例采用的树脂为His Bind Resin，抗原蛋白为RBD。His Bind Resin与RBD结合后，从噬菌体展示的抗体库中淘选抗体的具体过程如下：
(1)活化His Bind Resin：取200μL His Bind Resin于1.5mL离心管中，1000g离心1min以去掉保存溶液。加入200μL的ddH2O清洗树脂一次，1000g离心1min并去掉上清，重复此步骤一次。再加入200μL离子化缓冲液重悬树脂，静置10min，离心去掉上清。加入200μL结合缓冲液重悬树脂，静置10min。取40μL树脂加入1.5mL离心管中，离心去掉上清。
(2)抗原蛋白与树脂的结合
取纯化后的RBD蛋白35μL(约10μg)加入165μL PBS中，混匀后加入装有活化树脂的EP管中旋转混匀1h，1000g离心1min去掉上清。加入200μL漂洗缓冲液重悬树脂，1000g离心1min去掉上清，此步骤重复一次。
(3)淘选识别目的蛋白的单链抗体
取拯救后的噬菌体展示抗体库溶液300μL并加入0.3μL Triton X-100，用微量移液器轻轻混匀，再加入40μL未活化的树脂，轻微旋转反应1h。1000g离心1min取上清并加入40μL已包被抗原蛋白的树脂，轻微旋转反应2h，1000g离心1min去掉上清。加入500μL漂洗缓冲液(含0.1％Triton X-100)重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min去掉上清，此步骤重复5次。再加入500μL漂洗缓冲液含(0.1％Tween-20)重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min去掉上清，此步骤重复5次。最后一次漂洗后将树脂转移到新的EP管中，1000g离心1min去掉上清，加入200μL洗脱缓冲液，轻微旋转洗脱20min。1000g离心1min取上清，并加入5mL TG1菌液(挑取tg1单克隆摇菌到OD600至0.6)中，37℃感染1h，将感染的菌液涂布SOBAG平板，30℃倒置培养过夜；次日用2YT-AG培养基刮下平板上的菌落，并进行下一轮淘选。
(4)挑选识抗原蛋白的阳性克隆
从SOBAG平板上随机挑取单菌落接种到96孔细菌培养板中，每孔加入200μL 2YT-AG培养基，并于37℃培养过夜。吸取25μL菌液到新的细菌培养板中，加入175μL 2YT-AG培养基，37℃培养3h；然后3500rpm离心10min去上清，菌沉淀重悬于200μL 2YT-AI培养基(100μg/mL Amp，1mM IPTG)中，30℃诱导过夜；3500rpm离心10min取上清液，4℃保存备用。
将纯化的RBD蛋白加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(即PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入50μL以上的单链抗体上清液和50μL4％PBSM，并于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL anti-E/HRPconjugation(以4％PBSM按1:5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤3次，加入100μLTMB底物溶液避光反应15min，再加入25μL 2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450值判定抗原蛋白的浓度。部分克隆的检测结果如图5所示。
(5)阳性克隆测序和序列分析
将上述淘选得到的OD450值较大的抗原蛋白经ELISA鉴定，将鉴定为阳性的单克隆测序，测序的通用引物为S1：5’-GACCATGATTACGCCAAGC-3’，用DNAstar和Clustalw1.8分析抗体的重链与轻链可变区序列。
4、抗体模块化表达，分为可变区表达和恒定区表达两个模块。
(1)抗体可变区的表达
-80℃取出保种的大肠杆菌HB2151划线LB平板，37℃培养过夜，第二天挑取单克隆接种3mL LB培养基，37℃振荡培养至OD600为0.6左右。将得到的阳性克隆噬菌体感染HB2151，具体于37℃感染1h，再转接到100mL LB-A培养基(100μg/mL Amp)于37℃摇菌到OD600为0.6左右，6000rpm收菌；用100mL LB-AI培养基(100μg/mL Amp，100M/mL IPTG)重悬细菌，30℃培养过夜，8500rpm离心收菌。取1g细菌加入到10mL的精氨酸缓冲液(0.4M/L，pH8.0)中混匀，4℃放置45min，1000rpm离心收集上清，即得到了可溶性的抗体可变区。
抗体可变区的纯化：用去离子水洗涤Ni柱，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；5×柱体积的Charge Buffer(50mM NiSO4)充电；5×柱体积的去离子水洗涤，去游离的Ni离子；10×柱体积的Binding Buffer(20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，5mM咪唑，pH8.0)平衡；上样(手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定)；20×柱体积的Washing Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20～50mM咪唑，pH8.0)洗涤至无蛋白检出，收集流出液；Elution Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，500～1000mM咪唑，pH8.0)洗脱，每次1ml，应呈现正态分布。
(2)抗体恒定区的表达
将3μg质粒DNA(即第二重组载体)稀释到250μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3～4次。将5μL PEI试剂稀释到250μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3～4次。需要注意的是：无血清的DMEM培养基是稀释液，不能使用含血清的培养基。将稀释好的PEI转染试剂一次性全部加入到已稀释好的质粒DNA中，立即用移液枪吹吸3～4次，室温放置10～15分钟以形成PEI-DNA复合物。
转染前18～24小时进行细胞的计数并铺板，以便在转染时使贴壁细胞的汇合度大约在80％左右。弃去孔中原培养基，加入1mL新鲜的DMEM完全培养基；将PEI-DNA复合物均匀滴入细胞培养基中，轻轻做十字运动，让PEI-DNA复合物分散均匀；培养皿放于5％CO2、37℃恒温培养箱中，72h后收集细胞，检测蛋白表达量。按照相同的比例转化100mL细胞，纯化重组表达的抗体。
取上清液进行亲和层析纯化和SDS-PAGE电泳分析，结果如图6所示。
在此过程中，还可以通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度以及IPTG浓度等)，进一步提高目的蛋白表达量，为大量制备重组提供了途径。
5、抗体体外组装及测试
将纯化的可变区和恒定区按质量比2:1混合4℃放置，然后采用层析柱纯化。纯化前，可以用紫外可见分光光度计测定结合后上清中蛋白的浓度确定结合率。
用于纯化的层析柱的制备方法为：称取经CNBr活化了的sepharose 4B 0.5g，溶于2mM的HCl溶液中并于4℃过夜，使其充分溶胀。将溶胀好了的sepharose 4B预装于层析柱中，用10倍体积的2mM HCl溶液洗涤3次后用0.1M NaHCO3溶液对柱子进行平衡，将5mgprotein A/G溶于0.1M NaHCO3溶液中，加入已平衡好的柱子，置于摇床上轻轻混合并于2～8℃过夜或者室温2～4h，用0.1M NaHCO3溶液洗涤已经结合了蛋白的柱子3次。用0.01Mtris base平衡柱子3次，加入0.5％BSA封闭sepharose 4B上未结合的位点，置于摇床上在室温反应2～4h，再用0.01M tris base平衡柱子3次。
纯化过程为：将结合后的上清加入层析柱中，然后置于摇床上在室温反应2～4h；用0.01Mtris base洗涤柱子3次以上，洗掉未结合的杂蛋白；用0.1M pH2.5的甘氨酸洗脱结合在柱子上的抗体，并将1M NaHCO3溶液加入EP管中中和洗脱的抗体；将抗体溶液装入透析袋，经PEG20000或者蔗糖浓缩后，于0.01M PBS中透析4次以上，每次换液间隔时间为1h以上。
将透析好了的抗体用紫外可见分光光度计测定其在波长280nm处的吸光值，用吸光值除以1.35即为所测抗体的浓度，将所纯化的抗体加入30％-50％的甘油中并置于-20℃或者-80℃即可长期保存。
ELISA检测组装效率：将纯化的的目的蛋白RBD加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入50μL抗体上清和50μL 4％PBSM，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μLanti-Fc HRP conjugation(以4％PBSM按1:5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤3次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL 2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450值判定目的蛋白的浓度。结果如图7所示：未加入SpyCatcher-Fc2的抗体不识别RBD蛋白，加入SpyCatcher-Fc2后的抗体识别RBD蛋白，随着蛋白浓度增加信号逐渐增加。
综上所述，根据本发明的方法能够实现抗体的分模块制备，即通过噬菌体展示高通量筛选获得抗体可变区基因，抗体可变区在大肠杆菌中表达后，获得抗体的可变区模块；通过哺乳表达载体表达通用的抗体恒定区模块，可变区和恒定区在体外通过SpyTag/SpyCatcher组装，进而形成全长的抗体。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种模块化制备抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、载体设计：将Spytag片段与第一质粒体连接得到第一重组载体，将SpyCatcher片段与第二质粒连接得到第二重组载体，所述第二质粒中含有抗体恒定区基因片段；
S2、抗体库构建：将抗体可变区基因插入第一重组载体中，且所得连接产物转染宿主菌后，再与噬菌体混合培养，分离噬菌体后重悬即得噬菌体展示抗体库溶液；
S3、抗体筛选：利用包被有抗原蛋白的树脂从噬菌体展示抗体库溶液中淘选识别该抗原蛋白的单链抗体，再通过酶联免疫法进一步淘选得到阳性的单克隆噬菌体；
S4、抗体分模块表达：采用阳性的单克隆感染宿主菌，培养表达并纯化后得到可变区模块；将第二重组载体转染哺乳动物细胞，培养表达并纯化后得到恒定区模块；
S5、将可变区模块和恒定区模块组装得到全长的抗体。
2.根据权利要求1所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，步骤S1具体为：以第一质粒为模板，用SEQ ID NO:1～2所示的引物对扩增得到片段1，再将片段1和第一质粒分别酶切后连接；以SEQ ID NO:3所示序列为模板，用SEQ ID NO:4～5所示的引物对扩增得到片段2，再将片段2和第二质粒分别酶切后连接。
3.根据权利要求2所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，所述第一质粒为pCantab5E质粒，所述第二质粒为pSecTag2A-Fc2质粒。
4.根据权利要求1所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，步骤S2所述的抗体可变区基因的制备方法为：用SEQ ID NO:6～7所示的引物对扩增天然纳米抗体库的FR1到FR3，得到片段3，再将片段3与CDR3基因拼接，即可获得抗体基因。
5.根据权利要求4所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，所述CDR3基因的合成方法为：用SEQ ID NO:8～9所示的引物对扩增天然纳米抗体库的FR4，得到片段4；片段4酶切后与NNNR1连接，所得连接产物扩增后酶切后与NNNR2连接，所得连接产物扩增后酶切后与NNNR3连接，如此重复用NNNR1、NNNR2和NNNR3拼接，使得最终拼接产物中含有6～16个拼接片段；其中所述NNNR1、NNNR2和NNNR3的序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15所示。
6.根据权利要求5所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，拼接NNNR1时所用扩增引物对的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9，拼接NNNR2时所用扩增引物对的序列如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:9，拼接NNNR3时所用扩增引物对的序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9。
7.根据权利要求1所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。
8.根据权利要求1所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，步骤S3中淘选识别抗原蛋白的单链抗体的过程具体为：取噬菌体展示抗体库溶液并加入Triton X-100混匀，再加入未活化的树脂进行反应，离心取上清加入与包被有抗原蛋白的树脂进行反应，离心得沉淀，多次漂洗后洗脱，再离心取上清并加入宿主菌感染，诱导培养即得。
9.根据权利要求8所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，步骤S3中淘选阳性的单克隆的过程具体为：将感染的宿主菌诱导培养后离心取上清液；将抗原蛋白加入到ELISA板中进行包被、封闭处理，然后加入前述上清液进行反应，待结束后洗涤，再加入anti-E/HRPconjugation孵育，再次洗涤后加入TMB底物溶液并避光反应，终止反应后挑选OD450值大的进行鉴定。
10.根据权利要求1所述模块化制备抗体的方法，其特征在于，步骤S5具体为：将可变区模块和恒定区模块按质量比2:1混合并于4℃结合。
CN202211000499.7A 2022-08-19 2022-08-19 一种模块化制备抗体的方法 Pending CN116041487A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211000499.7A CN116041487A (zh) 2022-08-19 2022-08-19 一种模块化制备抗体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211000499.7A CN116041487A (zh) 2022-08-19 2022-08-19 一种模块化制备抗体的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116041487A true CN116041487A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86127892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211000499.7A Pending CN116041487A (zh) 2022-08-19 2022-08-19 一种模块化制备抗体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116041487A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111018985B (zh) 针对牛血清白蛋白bsa的单域抗体的应用
CN108341870B (zh) 一种抗bsa纳米抗体、其生产方法及应用
CN111057148B (zh) 针对牛血清白蛋白bsa的单域抗体及其衍生蛋白
CN112028997A (zh) 抗ceacam5纳米抗体
CN110845582A (zh) 一种猫细小病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN111138533B (zh) 针对甲型肝炎病毒的单域抗体及其衍生蛋白
CN117285640B (zh) 一种鲨源赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体及其制备方法和应用
CN111138532B (zh) 针对甲型肝炎病毒的单域抗体的应用
CN114805559B (zh) 全人源抗新冠病毒受体结合域单链抗体No4及其应用
CN112812190A (zh) 一种抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体及应用
CN113406320B (zh) 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用
CN116041487A (zh) 一种模块化制备抗体的方法
CN113121669B (zh) 一种人脂联素的抗原模拟表位及制备方法
CN113667014B (zh) 一种抗bsa纳米抗体及应用
CN109762065B (zh) 针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72
CN110563806A (zh) 靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列及应用
CN110563804A (zh) 基于天然免疫库筛选识别氧氟沙星单链抗体的多肽序列及应用
CN116987194B (zh) 人st2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用
CN116854788B (zh) 一种重组蛋白a及其应用
CN114262375B (zh) 一种抗血蓝蛋白的特异性人源scFv抗体及其应用
CN111518210B (zh) 一种特异性识别faim3受体的全人源单抗
CN113912729B (zh) 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用
CN117285649B (zh) 抗体SEA33、融合蛋白SEA33-vHRP、制备方法及应用
CN116854829B (zh) 抗体SEB27、融合蛋白SEB27-vHRP、制备方法及应用
CN110066337B (zh) 一种抗TNF-α抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination