CN108341870B

CN108341870B - 一种抗bsa纳米抗体、其生产方法及应用

Info

Publication number: CN108341870B
Application number: CN201810002538.4A
Authority: CN
Inventors: 林坚; 周鹏; 李日飞; 周斌; 李成鹏; 代青松; 徐良; 房景刚
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-01-02
Filing date: 2018-01-02
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2038-01-02
Also published as: CN108341870A

Abstract

本发明涉及一种抗BSA的纳米抗体、编码所述抗BSA纳米抗体的基因序列以及表达该纳米抗体的宿主细胞。本发明提供的抗BSA纳米抗体可用于血清学试验检测混合样本中的BSA组分、或用于检测食品/饮品中的牛源性成分。

Description

一种抗BSA纳米抗体、其生产方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及噬菌体展示抗体文库和纳米抗体重组表达技术，特别是涉及一种针对于BSA蛋白分子抗原表位的纳米抗体、其编码序列。

背景技术

牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是从牛血清中分离的一种蛋白质，其来源丰富，价格便宜，在水中溶解性较好，容易纯化，具有较好的小分子物质结合特性、体内代谢过程不会产生有害降解产物，无免疫原性；而且生物降解性好、无毒，在药物传递中被广泛应用。BSA含3个结构相似的结构域，每个结构域包含2个亚结构域，它们聚集在一起形成了一个不对称的心形结构，心形结构的内部集中了大量的疏水性氨基酸，构成了疏水性内核和亲水性外壳，这使BSA与亲水性和疏水性小分子物质均可发生相互作用。同时，BSA是单链蛋白质，由583个氨基酸残基组成，分子量约为66kDa，等电点为4.7。BSA有很多用途，在做Western或ELISA时，可作为封闭剂，同时也应用于生化研究，遗传工程和药物研究。BSA与其他材料或药物也可做成纳米颗粒，用于载药。利用相关技术制备BSA的抗体，做成BSA检测试剂盒，从而用于科学研究。

食物过敏是人体对食物中抗原物质产生的由免疫介导的不良反应，据报道90％的食物过敏反应主要由八种常见的过敏原引起，包括大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、蛋类、鱼类和甲壳纲动物。牛奶引起的食物过敏日益引起研究人员的关注，其中牛血清白蛋白(BSA)是牛奶中引起食物过敏的主要过敏原之一，目前食品中BSA血清学检测试剂盒较少。多克隆抗体检测效果变异较大，不满足商业化试剂盒的需求。传统骨髓瘤杂交技术生产的单克隆抗体虽然检测效果较稳定，但成本高且生产单克隆抗体的杂交瘤易退化，难以持续稳定的提供抗BSA单抗。

纳米抗体是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到的，其分子量约为15KD，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。因此，应用纳米抗体技术研发抗BSA的纳米抗体具有广阔的应用前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种抗BSA抗体、其编码序列、制备方法、以及应用。具体而言，

一方面，本发明提供一种抗BSA抗体，其含有由SEQ ID NO:3所示的CDR1、由SEQ IDNO:4示的CDR2、以及由SEQ ID NO:5所示的CDR3。

本发明所述抗BSA抗体，其是单克隆抗体、Fab、F(ab)2、Fv、scFv、单域抗体、纳米抗体等。

本发明所述抗BSA抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选，本发明的抗BSA抗体是由两条多肽链形成的同源二聚体，每条多肽链的序列如SEQ ID NO:1所示

本发明所述抗BSA抗体，其进一步带有标记，所述标记包括酶标记(如辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记)、光学标记(化学发光标记)、荧光标记、同位素标记等。

第二方面，本发明提供一种基因，其编码本发明所述抗体。

本发明所述基因，其含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明所述基因可以是DNA、cDNA、mRNA，除了编码序列以外，还包括非编码区序列，例如5’UTR和3’UTR等。

第三方面，本发明提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含本发明所述的基因。

本发明所述核酸构建体，可以为阅读框、表达盒、操纵子、质粒、粘粒、病毒载体、噬菌体载体等。

第四方面，本发明提供一种宿主，所述宿主包含本发明所述的基因或核酸构建体。

本发明所述宿主，可以为基因工程领域常用的宿主，包括原核宿主、真核宿主。所述原核宿主包括但不限于大肠杆菌，所述真核宿主包括但不限于酵母(毕赤酵母、酿酒酵母)、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。

第五方面，本发明提供一种生产抗BSA抗体的方法，其包括：(1)培养本发明的宿主细胞，(2)使所述宿主表达抗体，(3)从含有抗体的组分中分离和纯化抗体。

本发明所述生产抗BSA抗体的方法，通过诱导使大肠杆菌宿主细胞表达重组抗BSA抗体，从菌体破碎的上清中分离和纯化抗BSA抗体。

第六方面，本发明提供一种制备抗BSA抗体的方法，其包括：(1)用BSA作为饵蛋白筛选噬菌体展示抗体库；(2)阳性克隆的鉴定和测序；(3)抗BSA重组抗体的表达和纯化；(4)抗BSA重组抗体功能的鉴定。

本发明所述制备抗BSA抗体的方法，用纯化的BSA包被ELISA板/条，筛选噬菌体表面展示的单域抗体库，经过三至四轮淘筛，从洗脱下的噬菌体中挑取噬菌体克隆，与辅助噬菌体M13K07共感染宿主菌得到噬菌粒，用PHAGE-ELISA鉴定阳性克隆并测序。

第七方面，本发明提供所述抗BSA抗体的用途，用于鉴定食品中牛源蛋白、或用于血清学试验。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

(1)易于生产，性能稳定。相对于普通抗体或抗体片段，本发明所述抗BSA单域抗体是由一条多肽链形成的同源二聚体，可以通过原核或真核重组表达，并且只要序列不变所生产的重组纳米抗体特异性结合BSA的性能就会保持稳定。

(2)亲和力高，特异性好。scFv或抗体的片段等小分子抗原结合蛋白由于缺乏抗体分子的完整结构，通常对抗原的亲和力远远达不到完整抗体的水平。本发明经过长期试验，采用了高库容的噬菌体展示单域抗体文库，经过条件优化和反复筛选，获得了亲和力和特异性接近IgG型抗体的纳米抗体。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1：本发明所述纳米抗体的氨基酸序列。

CDR1、CDR2、CDR3为互补决定区；FR1、FR2、FR3为框架区。

图2：噬菌体纳米抗体库淘筛富集图。

1为第一轮；2为第2轮；3为第三轮。

每轮淘筛投入的噬菌体CFU相同，但随着淘筛轮次的增加，洗脱回收的噬菌体量增加。第三轮淘筛的洗脱量为第一轮淘筛洗脱量的三倍。

图3：PHAGE-ELISA实验结果图。

横坐标1为阳性对照组,直接包被噬菌粒；

横坐标2为阴性对照组，包被BSA、结合步骤使用随机噬菌粒克隆2；

横坐标3为空白对照组，包被PBS、结合步骤使用空噬菌粒克隆3；

横坐标4-9为实验组，包被BSA、结合步骤使用第三轮淘筛后选取的噬菌粒克隆4-9。

纵坐标为OD450。

其中，克隆7的OD450值甚至超过了阳性对照。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例一、抗BSA蛋白纳米抗体的淘选、阳性克隆的鉴定和测序

采用固相淘选的方法，将BSA蛋白用1xPBS稀释到30-100ug/ul，包被到ELISA板条上，每孔加入100ul，4℃过夜包被。PBS洗三遍，每孔加入300ul 4％的脱脂牛奶，37℃封闭2小时。PBS洗三遍后加入噬菌体展示库(约有1x10¹²CFU)，37℃1小时。吸出未结合的噬菌体，加入PBS洗5-10遍(逐轮增加洗涤次数)，再PBST洗三遍后加入100ul的PH＝2.2的甘氨酸-盐酸溶液，37℃7分钟。轻轻吹打板孔将吸附的噬菌体洗下来，然后加入Tris-HCl溶液(PH＝8.8)15ul，取10ul测定滴度，根据回收的洗脱液体积和噬菌体滴度计算本轮洗脱回收的噬菌体克隆形成单位(CFU)数，结果图2所示。其余洗脱回收的噬菌体扩增后用于下一轮淘选，每轮淘筛投入的噬菌体CFU相同，均为1x10¹²CFU。经过三轮淘选后，随机从测滴度的平板上挑取克隆用辅助噬菌体M13K07进行救援，得到展示目的蛋白的噬菌粒，用phage-elisa实验进行验证，加样表如下：

表1：PHAGE-ELISA实验设计和步骤

PHAGE-ELISA的实验结果如图3所示。将编号为克隆7的阳性噬菌粒克隆送去测序，得到插入的纳米抗体基因碱基序列如下：

5’-CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATCAACGTTCGGTACTTATGCCGTAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGATCTCATGTATTAGCGGTAGGGGTGAGAGAACATATTATGCGGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAGCGTGCTATATCTACAAATGAACAACGTGAATGCTGAGGACACGGCCGTTTACTACTGTGCTTTAGCCAGGTGGCGCGGTAGTGCGTGTGGCCCCATTACGCCCATGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA-3’

根据上述基因碱基序列，按照大肠杆菌密码子确定阳性噬菌粒克隆7中纳米抗体的氨基酸序列为：

NH₂-QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFGTYAVGWFRQAPGKEREGISCISGRGERTYYADSVKGRFTISRDNAKSVLYLQMNNVNAEDTAVYYCALARWRGSACGPITPMGQGTQVTVSS-COOH

通过结构分析和序列比对，确定纳米抗体克隆7的CDRs和FRs，结果如图1所示。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 申请人名称北京大学

<120> 一种抗BSA纳米抗体、其生产方法及应用

<130> 无

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 抗BSA纳米抗体

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Gly Thr Tyr

20 25 30

Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Gly Arg Gly Glu Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Val Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Val Asn Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Ala Arg Trp Arg Gly Ser Ala Cys Gly Pro Ile Thr Pro Met

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 366

<212> DNA

<213> 抗BSA纳米抗体编码基因

<400> 2

cagttgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgcgcag cctctggatc aacgttcggt acttatgccg taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaagg agcgcgaggg gatctcatgt attagcggta ggggtgagag aacatattat 180

gcggactccg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagag cgtgctatat 240

ctacaaatga acaacgtgaa tgctgaggac acggccgttt actactgtgc tttagccagg 300

tggcgcggta gtgcgtgtgg ccccattacg cccatgggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> CDR1

<400> 3

Gly Ser Thr Phe Gly Thr Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> CDR2

<400> 4

Ile Ser Gly Arg Gly Glu Arg Thr

1 5

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> CDR3

<400> 5

Ala Leu Ala Arg Trp Arg Gly Ser Ala Cys Gly Pro Ile Thr Pro Met

1 5 10 15

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

20 25

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> FR1

<400> 6

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> FR2

<400> 7

Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile Ser

1 5 10 15

Cys

<210> 8

<211> 38

<212> PRT

<213> FR3

<400> 8

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Ser Val Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Val Asn Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

Claims

1.一种抗BSA纳米抗体，其含有由SEQ ID NO:3所示的CDR1、由SEQ ID NO:4示的CDR2、以及由SEQ ID NO:5所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的抗BSA纳米抗体，其包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

3.一种核酸分子，其编码权利要求1-2任一所述纳米抗体。

4.如权利要求3所述核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

5.一种核酸构建体，其包含权利要求3或4所述核酸分子。

6.一种宿主，其包含权利要求3或4所述核酸分子、或包含权利要求5所述核酸构建体。

7.一种生产抗BSA纳米抗体的方法，其包括：

(1)培养权利要求6所述的宿主，

(2)使宿主表达抗体，

(3)从含有抗体的组分中分离和纯化抗BSA纳米抗体。

8.权利要求1-2任一项所述抗BSA纳米抗体的用途，其用于鉴定食品中牛源蛋白、或用于血清学试验。