CN107857816B - 一种抗干扰素α-2b纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗干扰素α-2b纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种抗干扰素α‑2b纳米抗体及应用，包括一条或两条VHH链，所述VHH链由框架区FR和互补决定区CDR组成，其中，所述互补决定区CDR由如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2和如SEQ ID NO:3所示的CDR3组成，所述框架区FR由如SEQ ID NO:4所示的FR1，如SEQ ID NO:5所示的FR2，如SEQ ID NO:6所示的FR3和如SEQ ID NO:7所示的FR4组成。本发明还包括抗干扰素α‑2b纳米抗体的应用。本发明的优点在于抗干扰素α‑2b纳米抗体具有稳定性高、特异性高、分子量小和可大规模生产的优点，可制作成纯化干扰素α‑2b的纯化柱，也可制作成检测干扰素α‑2b的二抗试剂，具有着广阔的应用前景。

Description

一种抗干扰素α-2b纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种纳米抗体及其应用，具体涉及一种抗干扰素α-2b纳米抗体及应用。
背景技术
自杂交瘤技术问世以来，单克隆抗体已经被广泛的应用于多种疾病的诊断和治疗。但这些主要来源于小鼠的单克隆抗体体积大、稳定性差，在临床应用上受到一定的限制。
纳米抗体又称单域重链抗体或VHH抗体，是骆驼体内中天然存在一种缺失轻链的抗体，与普通抗体及重组单链抗体(single chain fragment variable，scFv)相比，纳米抗体具有适合进行基因改造，可转变为多种形式等优点，因此具有广阔的应用前景。
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为三类，α-(白细胞)型、β-(成纤维细胞)型，γ-(淋巴细胞)型；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。
目前，我国市场销售的基因工程干扰素有α-1b,α-2a,α-2b三种亚型,其中，市场上纯化和质检干扰素α-2b的均是单克隆或多克隆抗体，由于单克隆抗体的生产过程及其繁琐和复杂，稳定性差；多克隆抗体特异性既不高又不稳定，同时市场又对干扰素α-2b的需求量很大。因此，亟待开发一种不仅特异性高，而且稳定性也高，还可大规模生产的抗干扰素的纳米抗体尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种相对于现有干扰素抗体而言，特异性高，稳定性好，分子量小，且适于大规模生产需要的新型抗干扰素α-2b纳米抗体。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种抗干扰素α-2b纳米抗体的VHH链，其特征在于，由框架区FR和互补决定区CDR组成，其中，所述互补决定区CDR由如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，和如SEQ ID NO:3所示的CDR3组成，所述框架区FR由如SEQ ID NO:4所示的FR1，如SEQ IDNO:5所示的FR2，如SEQ ID NO:6所示的FR3，和如SEQ ID NO:7所示的FR4组成。
进一步，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种抗干扰素α-2b纳米抗体，其特征在于，包括一条或者两条权利要求1或2所述的抗干扰素α-2b纳米抗体的VHH链。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种编码α-2b纳米抗体的VHH链或抗干扰素α-2b纳米抗体的基因。
进一步，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明进一步涉及一种核酸构建体，其包含一种编码α-2b纳米抗体的VHH链或抗干扰素α-2b纳米抗体的基因。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种重组表达载体，包含所述的核酸构建体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种重组宿主，包含所述的核酸构建体或所述的重组表达载体。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种生产抗干扰素α-2b纳米抗体的方法，通过培养所述的重组宿主，诱导表达抗干扰素α-2b纳米抗体的形式大量制备。
本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种抗干扰素α-2b纳米抗体的VHH链或抗干扰素α-2b纳米抗体在制备亲和纯化干扰素α-2b的材料或检测干扰素α-2b的二抗试剂中的应用。
本发明的优点在于：本发明制备的抗干扰素α-2b纳米抗体与现有的抗体相比，具有稳定性高、特异性高、分子量小和可大规模生产的优点，可制作成纯化干扰素α-2b的纯化柱，也可制作成检测干扰素α-2b的二抗试剂，具有着广阔的应用前景。实验证明，本发明抗干扰素α-2b纳米抗体与rhIFN-α2b的KD平均可达3.91E-09M，结合特异性非常好，是一种应用前景非常广阔的特异性抗干扰素α-2b纳米抗体。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为单噬菌体的间接Phage-ELISA结合图。图中，1为阳性对照，2为阴性对照，3为空白对照，4-9为实验组。
图2为本发明抗干扰素α-2b纳米抗体的氨基酸结构示意图。
图3为蛋白表达纯化SDS-PAGE分析图。图中，1为IPTG诱导的BL21细胞总裂解液；2为IPTG诱导的BL21细胞沉淀；3为IPTG诱导的BL21细胞上清液；4为IPTG诱导的BL21细胞纯化结果。
图4为本发明纳米抗体I22与rhIFN-α2b的Western图谱。
图5为本发明纳米抗体I22与rhIFN-α2b抗体依赖性曲线图。
图6为本发明纳米抗体I22与rhIFN-α2b的结合力测定示意图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施方式。虽然附图中显示了本发明的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1：抗干扰素α-2b纳米抗体的淘选及鉴定
本发明所用的试剂和材料均可商业化购得。其中，抗干扰素α-2b购买自中国食品药品检定研究院，噬菌体展示文库购买自南昌大学。
1、噬菌体文库淘选
(1)包被：取抗原溶于PBS中，加入酶标板(100μL/孔)，4℃包被过夜。
(2)封闭：吸出包被液，用PBS洗板3次，用300μL，3％BSA-PBS，37℃，孵育2h。
(3)结合：吸出封闭液，用PBS洗板3次，加入100μL噬菌体展示文库(干扰素α-2b的免疫库，羊驼种属)
(可选步骤：滴度为2×1012cfu/mL，与等体积BSA-PBS溶液混匀，预先在20～30℃孵育1h)，37℃孵育1h。
(4)洗涤：吸出未结合的噬菌体，用PBST洗板3～6次，再用PBS洗板10～20次(洗涤次数根据淘选轮次，先少后多)。
(5)洗脱：加入100μL Gly-HCl(pH2.2)，37℃,6～8min，用移液器轻柔吸打数次。
(6)中和：吸出孔中液体至离心管，与15μL中和缓冲液混匀。(要求中和后pH在7～8中间，可先按体积混合，然后测定pH)
取10μL中和后的洗脱液测定滴度，其余140μL扩增后用于下一轮淘选，如此进行3轮淘选。噬菌体逐步得到淘筛，抗干扰素α-2b纳米抗体的淘选见表1。(测滴度时，通常第一轮洗脱物稀释102、103、104、105)
表1-抗干扰素α-2b纳米抗体的淘选
Figure GDA0001549803090000041
2、挑取6个克隆鉴定
(一)表达噬菌体
(1)无菌操作：分装LB/葡萄糖2％/Amp于1.5mL离心管，每管0.9mL；
(2)从测定洗脱物滴度转接的平板上，分别随机挑取6个单菌落接种于LB/葡萄糖2％/Amp，37℃,220rpm，离心过夜培养(可将管子放置于试管盒中，倾斜30度固定于摇床里)；
(3)按1％接种量接种LB/葡萄糖2％/Amp，37℃,220rpm，离心至OD600＝0.3～0.5(约2～5h)；
(4)每管加入辅助噬菌体(感染复数1:1)；37℃,220rpm，离心培养1h；
(5)转速3000rpm，离心10min；
(6)用等体积LB/Amp/kan培养基重悬细胞；30℃,250rpm，离心培养5～8h；
(7)在4℃,10000rpm，离心10min，取上清(上清不能有沉淀，可直接用于phage-ELISA测定，不能用于间接phage-ELISA)；
(8)加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，4℃，放置＞1h；
(9)4℃,10000rpm，离心20min，弃去上清；
(10)沉淀用0.2mL PBS重悬，测定滴度。
(二)间接Phage-ELISA测定噬菌体克隆
(1)用1×PBS将抗原(干扰素α-2b蛋白)稀释至5μg/mL；
(2)酶标板中，加入抗原稀释液100μL/孔，4℃包被过夜；
(3)PBST洗板3次，1×封闭液300μL/孔，37℃封闭2h；
(4)PBST洗板3次，加入经PEG-NaCl纯化的噬菌体(可选步骤：PBST稀释后，分别与等体积的1×封闭液混合，37℃，孵育15min)，100μL/孔，37℃，孵育1h；
(5)PBST洗板3次，加入HRP/anti-M13(1×Blocking Buffer按1:5000稀释)，100μL/孔，37℃,孵育1h；
(6)PBST洗板3次，加入显色液100μL/孔，37℃，孵育8min。
(7)按50μL/孔，加入2M硫酸终止反应，测定450nm吸光值。
实验设定阳性对照、阴性对照和空白对照，见表2，实验结果见图1。
表2-间接phage-ELISA加样表
Figure GDA0001549803090000051
注：原始抗体库可用辅助噬菌体代替
由图1可知，对照实验数据均正常，实验组5、9号为阳性，与测序结果一致，均是rhIFN-α2b最为富集的序列，到此筛选获得rhIFN-α2b纳米抗体。
选取噬菌体编号为5、9号的噬菌粒阳性克隆送去测序，二者序列一致，得到插入噬菌粒中的碱基序列，如SEQ ID NO:10所示。
进一步测定分析，得到噬菌体中插入的纳米抗体基因碱基序列,如SEQ ID NO:9所示。
对纳米抗体的氨基酸序列进行结构分析，可知该序列具有典型的纳米抗体结构，由框架区(FR1，FR2，FR3，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)构成。其中，纳米抗体的氨基酸序列为如SEQ ID NO:8所示。纳米抗体的氨基酸结构示意图，如图2所示。
其框架区(FR1，FR2，FR3，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)的氨基酸序列分别如下：
CDR1：如SEQ ID NO:1所示；
CDR2：如SEQ ID NO:2所示；
CDR3：如SEQ ID NO:3所示；
FR1：如SEQ ID NO:4所示；
FR2：如SEQ ID NO:5所示；
FR3：如SEQ ID NO:6所示；
FR4：如SEQ ID NO:7所示。
实施例2：纳米抗体的表达和纯化
取2ul普尔普乐公司构建的pET28a载体加入到50ul的BL21感受态中，冰上放置30分钟，然后放入到42℃水浴中热激90秒，再冰上放置5分钟，接着加入600ul的LB培养基放入37℃恒温箱中培养1小时；之后取100ul上述培养液涂到氨苄平板上，放入37℃恒温培养箱中过夜培养。第二天从平板上挑取单克隆接种到1L培养基中培养，37℃，220rmp培养，当菌液OD＝0.5时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃，180rmp，过夜诱导。第二天将菌液离心收集用50ml PBS重悬菌体后进行超声破碎，超声条件为200w，破碎3秒，间歇3秒；然后4℃，在转速8000rpm，离心收集上清，过镍柱，纳米抗体吸附到镍柱上，用洗涤液(10um咪唑溶液)洗去杂蛋白，加入洗脱液(250um咪唑溶液)洗脱纳米抗体，在得到的纳米抗体溶液中加入PBS进行超滤(4000rmp/min,30min)，得到的纳米抗体是溶在PBS中，测定浓度后加入20％的甘油-80℃保存备用，蛋白表达纯化SDS-PAGE分析图见图3，将抗rhIFN-α2b纳米抗体命名为纳米抗体I22。
实施例3：Western blot验证
分别以1ug的rhIFN-α2b，2ug的rhIFN-α2b和1ug的MG53蛋白为样品，加入5ug I22抗体，孵育1h后加入抗HIS标签二抗，实验结果见图4。
由图4可以看出rhIFN-α2b有清晰条带，MG53处没有条带，证明本发明的纳米抗体I22可以和IFN-α2b蛋白特异性的结合。
实施例4：检测干扰素α-2b的二抗试剂
1、用1×PBS将抗原(干扰素α-2b蛋白)稀释至5μg/mL；
2、酶标板中，加入抗原稀释液100μL/孔，4℃包被过夜；
3、PBST洗板3次，1×封闭液300μL/孔，37℃封闭2h；
4、PBST洗板3次，加入实施例2获得的纳米抗体；
5、PBST洗板3次，加入HRP/anti-his，100μL/孔，37℃,1h；
6、PBST洗板3次，加入TMB显色液100μL/孔，37℃,5min。
7、按50μL/孔，加入2M硫酸终止反应，测定450nm吸光值。
将rhIFN-α2b纳米抗体稀释至不同浓度0.5-1000μg/mL，分别与milk、rhIFN-α2b结合，以纳米抗体浓度取log值作为X轴，纳米抗体I22与rhIFN-α2b抗体依赖性曲线见图5。
由图5可见，ELISA实验分析可以看出其值成S型曲线，证明rhIFN-α2b与本发明的纳米抗体I22成特异性结合。
实施例5：抗干扰素α-2b纳米抗体结合力的测定
将干扰素α-2b蛋白(rhIFN-α2b)稀释到5ug/ml，将实施例2获得的纳米抗体122稀释到40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，稀释液为PBST(PBS+0.1％的吐温-20)+0.1％的BSA，表加样如表3，平衡200s，包被加样200s，平衡200s反应300s，解离300s，进行抗干扰素α-2b纳米抗体结合力的测定，纳米结合力见图6，测定结果见表4，其中解离常数KD＝Kd/Ka，式中Kon为结合常数，Kdis解离常数，KD为平衡解离常数。
表3-抗干扰素α-2b纳米抗体结合力的测定加样表
试液 实验组 对照组
平衡液 PBST+BSA PBST+BSA
传感器包被液 干扰素α-2b+PBST+BSA 干扰素α-2b+PBST+BSA
平衡液 PBST+BSA PBST+BSA
反应液 PBST+BSA+纳米抗体 PBST+BSA
解离液 PBST+BSA PBST+BSA
表4-抗干扰素α-2b纳米抗体平衡常数、分离常数和解离常数的测定值
Figure GDA0001549803090000071
上述测定的抗体亲和力常数表明，本发明制备的纳米抗体结合力高，亲合力强，特异性好，是一种应用前景广阔的抗干扰素α-2b纳米抗体。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
110 北京大学
120 一种抗干扰素α-2b纳米抗体及应用
130
160 10
170 PatentIn version 3.5
210 1
211 8
212 PRT
213 CDR1
400 1
Gly Phe Thr Phe Asp Ser Ala Thr
1 5
210 2
211 7
212 PRT
213 CDR2
400 2
Thr Ser Gly Gly Gly Met Ile
1 5
210 3
211 7
212 PRT
213 CDR3
400 3
His Arg Leu Gly Thr Phe His
1 5
210 4
211 25
212 PRT
213 FR1
400 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
210 5
211 17
212 PRT
213 FR2
400 5
Met Ser Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Met
210 6
211 38
212 PRT
213 FR3
400 6
Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
210 7
211 11
212 PRT
213 FR4
400 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
210 8
211 113
212 PRT
213 抗干扰素α-2b纳米抗体
400 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Ser Ala
20 25 30
Thr Met Ser Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Met Thr Ser Gly Gly Gly Met Ile Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Arg Leu Gly Thr Phe His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
210 9
211 339
212 DNA
213 抗干扰素α-2b纳米抗体
400 9
caggtgcagc tcgtggagtc ggggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt cacgttcgac agtgccacca tgagctggca ccgccaggct 120
ccagggaggg agcgcgagtt cgtcgcgatg actagtggtg ggggtatgat aaactatgca 180
aactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatggaca gcctaaaacc cgaggacacg gccgtctatt actgccatag attgggaacc 300
ttccactggg gccaggggac ccaggtcacc gtctcctca 339
210 10
211 411
212 DNA
213 重组质粒
400 10
atggcccagt tgcagctcgt ggagtcaggg ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60
agactctcct gtgcagcctc tggaaaagct ttgagatatt atgccatagg ctggttccgc 120
caggccccag ggaaggagcg tgaggcggtc tcatgtatta gtagtagtgg ttttagcaca 180
aactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaccacg 240
gtgtatctgc aactgaacag cctgaaacct gaggacacag ccgtttatta ctgtgcagct 300
caggggtcgc tttcagatag tgcctgccag tctattctga gggctgactt tggttcctgg 360
ggccagggga cccaggtcac cgtctcctcg gcgcaccaca gcgaagaccc c 411

Claims (9)

1.一种抗干扰素α-2b纳米抗体，其特征在于，其VHH链由框架区FR和互补决定区CDR组成，其中，所述互补决定区CDR由如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，和如SEQ ID NO:3所示的CDR3组成，所述框架区FR由如SEQ ID NO:4所示的FR1，如SEQ ID NO:5所示的FR2，如SEQ ID NO:6所示的FR3，和如SEQ ID NO:7所示的FR4组成。
2.根据权利要求1所述的抗干扰素α-2b纳米抗体，其特征在于，其VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求1或2中任意一项所述的抗干扰素α-2b纳米抗体，其特征在于，包括一条或者两条所述的VHH链。
4.一种编码权利要求1-3中任意一项所述的抗干扰素α-2b纳米抗体的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
6.一种核酸构建体，其特征在于，包含权利要求5所述的基因。
7.一种重组宿主，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸构建体。
8.一种生产抗干扰素α-2b纳米抗体的方法，其特征在于，通过培养权利要求7所述的重组宿主，诱导表达抗干扰素α-2b纳米抗体的形式大量制备。
9.权利要求1-3中任意一项所述的抗干扰素α-2b纳米抗体在制备亲和纯化干扰素α-2b的材料或检测干扰素α-2b的试剂中的应用。
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