CN112457407B - 一种丙烯酰胺特异性纳米抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙烯酰胺特异性纳米抗体及其应用。所述丙烯酰胺特异性纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该纳米抗体可以特异性识别丙烯酰胺衍生物，且具有优异的有机溶剂耐受性，在实际样品检测中不受前处理加工过程中的有机溶剂的影响，对食品中丙烯酰胺含量的检测线性范围为0.028μg/mL～0.18μg/mL，IC₅₀为0.07μg/mL，最低检测限(LOD)为5.2ng/mL，稳定性好、特异性强，灵敏度高，且适用条件广，操作简单快速；本发明丙烯酰胺特异性纳米抗体的制备简单，具有普遍适用性，在检测食品中丙烯酰胺的污染水平及进一步开发免疫检测试剂盒等方面具有广泛的应用前景。

Description

一种丙烯酰胺特异性纳米抗体的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种丙烯酰胺特异性纳米抗体及其应用。

背景技术

丙烯酰胺(Acrylamide，AA)是一种普遍存在于食物中的小分子有毒物质，国际癌症研究机构将其定义为2A类致癌物质，即人类可能致癌物质。研究发现丙烯酰胺具有神经毒性，遗传毒性，生殖毒性，免疫毒性等毒害作用，长期暴露于丙烯酰胺含量高的环境，可能引起生物体皮肤脱皮红斑、四肢麻木、手足多汗、体重减轻及远端触痛觉减退、深反射减退等神经功能受损等危害。

淀粉含量丰富的食物经高温加热(≥120℃)易由美拉德反应生成丙烯酰胺，因此诸如烘焙或煎炸的马铃薯制品，焙烤的含谷物类面包，咖啡豆等，都是丙烯酰胺含量极高的食物，而这些食物在日常生活中的需求巨大，因此找到一种可以准确快速检测食品中丙烯酰胺含量的方法十分必要。

现有常见的检测丙烯酰胺的方法有：气相色谱法(简称GC)、高效液相色谱法(简称HPLC)、气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法，毛细管电泳法(简称CE)以及其他定量检测方法，但这些方法需要专业的技术人员、繁琐的样品前处理过程和昂贵的仪器设备，不适合大批量市场检测和现场监控。免疫学分析方法是一种基于抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)建立的快速分析检测方法，该方法灵敏度高、特异性强、操作简单、价格低廉，能够实现小体积、大通量检测，逐渐成为小分子有毒有害残留物检测的替代方法。中国专利CN103288697A公开了一种丙烯酰胺半抗原、人工抗原、抗体，但是在极端条件下该抗体稳定性差，容易失活，有机溶剂的残留也会使以单克隆抗体和多克隆抗体为主的免疫学检测的灵敏度、准确度大大降低。

丙烯酰胺是一种极性分子，在检测食品，尤其在检测高脂食品中的丙烯酰胺含量时，常采用强有机溶剂对丙烯酰胺进行萃取，有机溶剂可将包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺完全提取出来，且便于浓缩，但对抗体稳定性要求增高，因此，研发一种稳定性好、适用条件广、准确度高、灵敏度强的用于快速检测丙烯酰胺的抗体和方法，对于实际样品检测具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服上述现有技术的不足，提供一种丙烯酰胺特异性纳米抗体及其应用。

本发明的第一个目的在于提供一种丙烯酰胺特异性纳米抗体。

本发明的第二个目的在于提供一种编码所述丙烯酰胺特异性纳米抗体的基因。

本发明的第三个目的在于提供一种特异性纳米抗体表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种重组细胞。

本发明的第五个目的在于提供所述纳米抗体、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在检测丙烯酰胺中的应用。

本发明的第六个目的在于提供所述纳米抗体、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在制备丙烯酰胺检测试剂/试剂盒中的应用。

本发明的第七个目的在于提供一种检测丙烯酰胺的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明首先提供了一种丙烯酰胺特异性纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明经过创造性的探索研究，通过用噬菌体展示技术，从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示能与丙烯酰胺衍生物特异性结合的纳米抗体。

所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种编码上述丙烯酰胺特异性纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了一种含有编码上述丙烯酰胺特异性纳米抗体基因的重组表达载体。

本发明还提供了一种含有上述重组表达载体的重组细胞。

本发明丙烯酰胺特异性纳米抗体能够特异性识别丙烯酰胺衍生物，且具有优异的有机溶剂(甲醇)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高。因此，上述纳米抗体、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在检测丙烯酰胺衍生物、制备丙烯酰胺衍生物检测试剂/试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

另外，本发明还提供了一种检测丙烯酰胺衍生物的方法，用丙烯酰胺衍生物半抗原与载体蛋白偶联得到的丙烯酰胺衍生物完全抗原作为包被原，用上述纳米抗体作为检测抗体进行检测。

优选地，所述丙烯酰胺衍生物半抗原的结构式如式(I)所示：

优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

优选地，所述检测采用间接竞争酶联免疫分析方法。具体为丙烯酰胺包被原与丙烯酰胺药物共同竞争纳米抗体，并通过HRP与TMB的显色反应最终完成该纳米抗体对丙烯酰胺的检测。

本发明还提供一种检测丙烯酰胺及其衍生物的试剂盒，所述试剂盒上述丙烯酰胺特异性纳米抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过噬菌体展示技术，从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙烯酰胺特异性纳米抗体，该纳米抗体能够特异性识别丙烯酰胺衍生物，且具有优异的有机溶剂(甲醇)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高，对丙烯酰胺衍生物的检测范围为0.028μg/mL～0.18μg/mL，IC50为0.07μg/mL，最低检测限(LOD)为5.2ng/mL，检测灵敏度高，且操作简单、所耗时间较短；另外，通过基因工程重组表达的方式即可大量制备该纳米抗体，制备方法简单，具有普遍适用性；因此，该纳米抗体在检测丙烯酰胺衍生物、制备丙烯酰胺衍生物检测试剂/试剂盒中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为特异性纳米抗体的氨基酸编号及结构域示意图。

图2为不同比例甲醇/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体的活性曲线图。

图3为基于特异性纳米抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1骆驼免疫抗体文库的构建

(1)免疫原的制备

以丙烯酰胺衍生物偶联牛血清蛋白作为免疫原，丙烯酰胺衍生物的结构式如式(I)所示，免疫原具体合成步骤参考文献《罗林.几种超小分子有害物特异性抗体制备及免疫检测技术研究与应用[D].2017.》。

(2)骆驼的免疫

用健康的骆驼作为实验动物，以步骤(1)人工抗原作为免疫原，在骆驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与免疫原乳化后用于免疫，后续的加强免疫用0.5mL不完全弗氏佐剂与免疫原乳化后免疫，每次免疫间隔1～2周。

免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测。当出现较好的免疫应答效果时，取血100mL外周血进行淋巴细胞的分离，用于构建纳米抗体文库。

(3)骆驼淋巴细胞的分离

取骆驼全血与等体积生理盐水混合成1：1稀释血液，常温放置。在无菌的离心管中加入淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入稀释血液。离心后，取淋巴细胞层到新的离心管中，用生理盐水稀释2倍，离心后弃上清。用生理盐水吹散淋巴细胞，再次离心弃上清，以充分洗涤淋巴细胞。每份淋巴细胞中加入裂解液(TRNsol)，并分装至无菌离心管中，于-80℃保存备用。

(4)总RNA的提取

总RNA的提取依据Invitrogen公司的Trizol试剂方法进行。具体方法如下：

将上述裂解液每1mL加入0.2mL的氯仿。盖上离心管盖子，剧烈震荡15秒，在冰上孵育5min。室温下12000rpm离心10min。转移不多于80％上层水相至新的离心管，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入GBC吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液；向GBC吸附柱中加入500μL Wash Buffer I离心1min，弃废液；向GBC吸附柱中加入600μL Wash Buffer II，12000rpm，离心30秒，弃废液。12000rpm离心1min，弃废液，室温打开盖子晾干吸附柱中残留漂洗液。将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加入30～100μL ddH₂O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心1min。收集管内液体，于-80℃保存。

(5)cDNA的合成

以RNA为模板，参照Takara公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：

A.按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；

表1 cDNA合成的第一步反应体系

Total RNA	3μg
		Oligo(dT)<sub>18</sub>primer	1μL
RNase free ddH<sub>2</sub>O	Up to12μL
		Total	12μL

B.上述反应体系65℃孵育5min，冰浴冷却2min；

C.按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤A反应后的体系中加入试剂；

表2 cDNA合成的第二步反应体系

步骤A反应后的体系	12μL
		5×Reaction Buffer	4μL
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)	1μL
		10mM dNTP Mix	2μL
RevertAid M-MiLVRT(200U/μL)	1μL
		Total	20μL

D.42℃孵育60min，70℃孵育5min。反转录产物cDNA于-80℃保存。

(6)纳米抗体目的基因的扩增

第一轮PCR：将步骤(5)得到的反转录产物cDNA作为模板，利用引物CALL001和CALL002进行第一轮PCR反应，引物CALL001和CALL002的核苷酸序列如表5所示，第一轮PCR的反应体系如表3所示。

表3 第一轮PCR的反应体系

第一轮PCR反应条件为：94℃，10min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最终72℃延伸10min。

第二轮PCR：采用试剂盒回收第一轮PCR反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物Fr1-sfi1和Fr4-sfi1进行第二轮PCR反应，引物Fr1-sfi1和Fr4-sfi1的核苷酸序列如表5所示，第二轮PCR的反应体系如表4所示。

表4 第二轮PCR的反应体系

第二步PCR反应条件同第一步。经过两轮PCR反应并通过试剂盒回收，最终得到纳米抗体的基因片段。

表5 纳米抗体目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列

(7)文库构建

A.目的基因及载体的酶切

采用Sfi I酶对目的基因及pComb3xss载体进行酶切。酶切条件：50℃水浴锅反应16h。

B.酶切产物的连接

将载体pComb3xss和目的基因片段混匀(摩尔比1：3)，于16℃连接反应16h后用试剂盒清洁回收。

C.电转化

取一定量的连接产物加至电转感受态E.coliTG1中，轻轻混匀后转入0.1cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，立即向电转杯加入950μL SOC培养基，37℃，250rpm培养1h，将菌液涂布于LB-Amp平板，37℃倒置培养过夜。

(8)文库的救援

接种超过10倍库容量的细胞于200mL LB(Amp)中37℃，250rpm培养至对数生长期；加入辅助噬菌体M13K07进行救援，37℃静置适当时间后，250rpm培养1h，加入卡那抗生素(1：1000)37℃，250rpm培养过夜。4℃离心取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，冰浴。再次4℃离心，弃上清，沉淀用TBS重悬，转移到2mL离心管，4℃离心，过0.22μm聚醚砜滤膜，取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。

实施例2纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

(1)纳米抗体的亲和淘选

首先，以与前述相同的丙烯酰胺衍生物偶联鸡卵清白蛋白作为包被原，用包被液将包被原稀释至终浓度10μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％脱脂奶粉，37℃封闭2h。甩干孔内液体并拍干，37℃烘箱烘干。每孔加入100μL噬菌体库(滴度约为10¹²pfu/mL)，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用PBST(0.01M PBS，0.1％Tween-20(v/v))洗涤5次，PBS(pH 7.0)洗涤15次，加入Gly-HCl(0.2M，pH2.2)37℃洗脱10min，立即用10μL Tris-HCl(1M，pH 9.0)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后噬菌体，并测定噬菌体的滴度。

在第二、三、四轮的淘选过程中，用包被液将包被原稀释至终浓度分别为2μg/mL，0.4μg/mL，0.08μg/mL，加入噬菌体孵育1h，用PBST(0.01M PBS，0.2/0.3/0.4％Tween-20(v/v))与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。其余步骤同上。药物洗脱浓度分别为1000ng/mL，200ng/mL，100ng/mL。

(2)阳性噬菌体克隆的鉴定

采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：

A.包板：用包被液将包被原稀释至合适浓度，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭后，倒掉孔内封闭液并置于37℃烘干。

B.从第三、四轮淘选后测定滴度的平板上随机挑选95个克隆于加有Amp抗性的LB培养基的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃培养过夜。第二天从96孔深孔板中取出10μL菌液加入到另一块96孔深孔板，37℃培养至对数生长期，每孔加入IPTG(1：1000比例，v/v)并培养过夜。第三天离心取上清100μL，加入到已经包被好的酶标板中，加入效价组：50μL的上清液和50μL的PBS；抑制组：50μL的上清液和50μL适当稀释的丙烯酰胺衍生物标准品；空白对照组：100μL PBS。37℃孵育一定时间，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入适当稀释的抗His二抗100μL，37℃孵育，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入适当稀释的带HRP标记的三抗100μL，37℃孵育，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，每孔加100μL底物显色液，37℃避光显色；加入反应终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取OD_450nm效价大于0.5，同时抑制率大于50％的单克隆作为阳性克隆。

结果显示：获得一株能够特异性识别丙烯酰胺衍生物的纳米抗体的菌株。

实施例3特异性纳米抗体编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

1、实验方法

将实施例2经过间接竞争ELISA鉴定获得的特异性纳米抗体的菌株送到测序公司进行测序，获得特异性纳米抗体的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得特异性纳米抗体的氨基酸序列。

2、实验结果

特异性纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，特异性纳米抗体的氨基酸编号及结构域示意图如图1所示，可以看出，该特异性纳米抗体包括4个框架区(Frameworkregion，FR)和3个互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)；框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5；互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8。

其中，第1-26位氨基酸序列为FR1，其氨基酸如SEQ ID NO.2所示；第27-38位氨基酸序列为CDR1，其氨基酸如SEQ ID NO.6所示；第39-55位氨基酸序列为FR2，其氨基酸如SEQID NO.3所示；第56-65位氨基酸序列为CDR2，其氨基酸如SEQ ID NO.7所示；第66-104位氨基酸序列为FR3，其氨基酸如SEQ ID NO.4所示；第105-118位氨基酸序列为CDR3，其氨基酸如SEQ ID NO.8所示；第119-127位氨基酸序列为FR4，其氨基酸如SEQ ID NO.5所示。

所述特异性纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

实施例4特异性纳米抗体的大量制备

以蛋白表达的形式进行制备特异性纳米抗体，具体方法为：

将实施例2获得的特异性纳米抗体的菌株，用试剂盒提取其质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coli BL21(DE3)中。从转化平板上挑一单菌落接种于LB(Amp)培养基中，37℃培养过夜。次日取少量菌液加20％甘油冻存，同时取部分菌液送去测序。测序结果符合后，将过夜培养菌液扩大培养至500mL LB(Amp)培养基中，37℃培养至对数生长期，加入IPTG(1:1000比例,v/v)，37℃培养过夜。第二天4℃，离心收集上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的特异性纳米抗体。

实施例5特异性纳米抗体的应用

1、包被及封闭

用包被液将丙烯酰胺衍生物包被原稀释至合适浓度，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭，甩干封闭液并于37℃烘箱烘干，用密封袋装于4℃待用。

2、特异性纳米抗体的有机耐受性分析

(1)实验方法

用不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％)的甲醇作为稀释液，将特异性纳米抗体稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100％，评价纳米抗体对不同有机溶剂、同一有机溶剂不同浓度时的耐受能力。具体方法为：

将50μL的特异性纳米抗体和50μL含不同浓度甲醇的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入适当稀释的HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μL底物显色液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2MH2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。

(2)实验结果

不同比例甲醇/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体的活性曲线图如图2所示，可以看出，特异性纳米抗体在60％的甲醇下仍具有100％的活性，在60％的甲醇下仍具有86％的活性。

以上结果说明：特异性纳米抗体具有优异的有机溶剂(甲醇)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高。

3、标准曲线的建立

(1)实验方法

用包被液将包被原稀释至工作浓度，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭后，弃封闭液，37℃烘箱烘干。每孔加入50μL纳米抗体和一系列不同浓度的50μL的丙烯酰胺衍生物标准品，37℃孵育，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入适当稀释的HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育，用PBST洗五次，拍干孔内液体，每孔加入100μL底物显色液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以丙烯酰胺衍生物标准品浓度对横坐标，B/B0(加入丙烯酰胺衍生物的孔的OD450nm/未加入丙烯酰胺衍生物的孔的OD450nm)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(2)实验结果

基于特异性纳米抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图3所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围为0.028μg/mL～0.18μg/mL，IC₅₀为0.07μg/mL，最低检测限(LOD)为5.2ng/mL，检测灵敏度高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种丙烯酰胺特异性纳米抗体的制备及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Tyr Thr Arg Ile Asn Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val

35 40 45

Ala Gly Phe Gly Thr Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Arg Ala Cys Trp Ser Asn Thr Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Arg Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Tyr Thr Arg Ile Asn Tyr Cys

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Phe Gly Thr Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Ala Arg Ala Cys Trp Ser Asn Thr Tyr Thr Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggtgcagc tggtgcagtc ggggggaggt ccggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcatgtacag cctctgaata cacccgcatt aactactgca tgggctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgagcg ggtcgcaggt tttggcaccg gtggtagcac gaggtacgcc 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaggac tctgtatctg 240

gaaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc ccgtgcgtgt 300

tggtctaata cgtatacgta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354

Claims (9)

1.一种丙烯酰胺衍生物特异性纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述丙烯酰胺衍生物的结构式如式（I）所示：

。

2.一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.一种含有权利要求3所述重组表达载体的重组细胞。

5.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组细胞在检测权利要求1中所述丙烯酰胺衍生物中的应用。

6.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组 表达载体或权利要求4所述重组细胞在制备检测权利要求1中所述丙烯酰胺衍生物的试剂/试剂盒中的应用。

7.一种检测权利要求1中所述丙烯酰胺衍生物的方法，其特征在于，用权利要求1中所述丙烯酰胺衍生物作为半抗原与载体蛋白偶联得到的丙烯酰胺完全抗原做包被原，用权利要求1所述的纳米抗体作为检测抗体进行检测。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述检测采用间接竞争酶联免疫分析方法。

9.一种检测权利要求1所述丙烯酰胺衍生物的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述纳米抗体。

Images