CN114957478B

CN114957478B - 一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体及其应用

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Publication number: CN114957478B
Application number: CN202210603341.2A
Authority: CN
Inventors: 沈玉栋; 张咏仪; 王弘; 徐振林; 杨金易; 孙远明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-05-30
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2042-05-30
Also published as: CN114957478A

Abstract

本发明公开了一种抗肉桂酰胺类杀菌剂纳米抗体及其应用。本发明所述纳米抗体可单独或同时识别肉桂酰胺类杀菌剂，烯酰吗啉和氟吗啉，且具有良好的热稳定性、有机溶剂耐受性及优异的耐酸性，可用于烯酰吗啉和/或氟吗啉的检测或用于制备相应的检测产品。此外，本发明还提供了一种检测肉桂酰胺类杀菌剂的方法，对肉桂酰胺类杀菌剂烯酰吗啉和氟吗啉的检测灵敏度(IC₅₀)分别为2.63和5.18ng/mL，线性范围分别为0.70～9.89ng/mL和0.95～28.22ng/mL，检测灵敏度高，准确性好，且操作简单耗时短，适于推广使用。

Description

一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体及其应用。

背景技术

烯酰吗啉(Dimethomorph，DIM)和氟吗啉(Flumorph，FLM)是两种常用的肉桂酰胺类杀菌剂，其对霜霉属、疫霉属和腐霉属等病原卵菌引发的果蔬真菌性病害具有良好的防治效果。烯酰吗啉是最早研发成功的，氟吗啉则是在烯酰吗啉的基础上利用氟原子取代氯原子而来。烯酰吗啉和氟吗啉虽对病原卵菌引发的病害具有良好的防治效果，但其本身具有中低毒性，使用后容易经过吸附、沉降等方式积累并残留，进而对健康造成危害。有报道称，烯酰吗啉对雄性激素活性有抑制作用；氟吗啉则具有肝脏毒性，会引发肝细胞脂肪变性等。因此，有必要对农作物中残留的烯酰吗啉和氟吗啉进行灵敏、准确的检测，避免其给人畜健康造成损伤。

现有用于检测烯酰吗啉的方法中，酶联免疫吸附测定法(ELISA)由于具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低以及样本前处理相对简单等优点而被广泛应用。但酶联免疫吸附测定法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，此类抗体在极端条件下的稳定性差，容易失活。另在对样品进行前处理的过程需要使用有机溶剂，而有机溶剂的残留使得以单克隆抗体和多克隆抗体为主的免疫学检测的灵敏度和准确度大大降低。因此，提供一种稳定性好，能耐有机溶剂的烯酰吗啉抗体对烯酰吗啉的准确检测具有重要意义。而目前关于氟吗啉检测方法的报道较少，且多是利用QuEChERS法结合HPLC-MS/MS或QuEChERS法结合液相串联质谱法进行检测，对仪器设备的要求高。综上，亟需提供一种检测准确度高、灵敏度强、稳定性好的快速检测肉桂酰胺类杀菌剂(即烯酰吗啉和氟吗啉)的产品和方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述纳米抗体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。

本发明的第五个目的是提供一种检测肉桂酰胺类杀菌剂的方法。

本发明的第六个目的是提供所述纳米抗体在检测肉桂酰胺类杀菌剂中的应用。

本发明的第七个目的是提供所述纳米抗体、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备检测肉桂酰胺类杀菌剂的产品中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种用于检测肉桂酰胺类杀菌剂的试剂盒试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体，所述纳米抗体是以本发明制备所得人工抗原免疫骆驼后从骆驼免疫抗体文库中筛选得到，命名为纳米抗体NbX-44E，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，本发明所述肉桂酰胺类杀菌剂为烯酰吗啉和/或氟吗啉。

具体地，所述纳米抗体NbX-44E包括4个框架区(FR1、FR2、FR3、FR4)和3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)，4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种编码所述纳米抗体NbX-44E的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

本发明还提供了一种重组载体，所述载体中含有编码纳米抗体NbX-44E的基因。

本发明还提供了一种重组细胞，所述细胞中含有上述重组载体。

由于本发明已给出了纳米抗体NbX-44E的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因序列，本领域技术人员可在此基础上通过已知的重组DNA技术得到本申请所述纳米抗体。因此，任何可用于制备本发明所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种检测肉桂酰胺类杀菌剂，即检测烯酰吗啉和/或氟吗啉的方法，所述方法为：用半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用纳米抗体NbX-44E作为检测抗体进行检测。

具体地，所述半抗原的结构式如式(I)所示：

具体地，所述包被原的结构式如式(Ⅱ)所示：

具体地，所述包被原中的载体蛋白为卵清白蛋白(OVA)，所述包被原被称为DIM-OVA。

本发明利用式(I)所示半抗原与乳铁蛋白(LF)偶联得到的完全抗原(DIM-LF)作免疫原，通过免疫骆驼获得纳米抗体基因文库，后续通过生物淘筛，从骆驼免疫抗体基因文库中筛选得到了一种抗烯酰吗啉和/或氟吗啉的纳米抗体NbX-44E。所述纳米抗体NbX-44E具有良好的热稳定性，良好的有机溶剂(甲醇)耐受性及优异的耐酸性，在实际样品检测的前处理过程中不会受到有机溶剂以及pH的影响，对烯酰吗啉和/或氟吗啉进行免疫检测的结果准确度高、特异性强、灵敏度高。

因此，本发明申请保护所述纳米抗体NbX-44E在检测烯酰吗啉和/或氟吗啉中的应用。

本发明还申请保护所述纳米抗体NbX-44E、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备检测烯酰吗啉和/或氟吗啉的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于检测烯酰吗啉和/或氟吗啉的试剂盒试剂盒，其中含有纳米抗体NbX-44E。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种抗烯酰吗啉和/或氟吗啉的纳米抗体NbX-44E，所述纳米抗体具有良好的热稳定性，良好的有机溶剂(甲醇)耐受性及优异的耐酸性，不易受有机溶剂以及pH的影响。在此基础上，本发明提供了一种检测烯酰吗啉和/或氟吗啉的方法，该方法操作简单，耗时短，结果准确度高。本发明所述方法检测烯酰吗啉和氟吗啉两种肉桂酰胺类杀菌剂的线性范围分别为0.70～9.89ng/mL和0.95～28.22ng/mL，半抑制浓度(IC₅₀)分别为2.63和5.18ng/mL，最低检测限(LOD)分别为0.43和0.58ng/mL，检测灵敏度高。本发明所述纳米抗体NbX-44E可用于实际样品中烯酰吗啉和/或氟吗啉的残留检测或用于制备检测烯酰吗啉和/或氟吗啉的产品，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为纳米抗体NbX-44E的氨基酸序列及结构域划分示意图。

图2烯酰吗啉半抗原、卵清白蛋白OVA、乳铁蛋白(LF)和人工抗原的紫外全波长扫描结果图。

图3为基于纳米抗体NbX-44E建立的间接竞争ELISA标准曲线图。

图4为不同比例甲醇/PBS作为稀释液时纳米抗体NbX-44E的活性曲线图。

图5为纳米抗体NbX-44E的酸碱耐受性分析结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1构建骆驼免疫抗体文库

1、完全抗原DIM-LF和DIM-OVA的制备

本发明所用半抗原的结构式如式(I)所示：

本发明将式(I)所示半抗原通过活泼酯法分别偶联乳铁蛋白(LF)和卵清白蛋白(OVA)，制备获得完全抗原DIM-LF和DIM-OVA。其中，DIM-LF为免疫抗原，DIM-OVA为包被原。利用紫外分光光度计对制备得到的烯酰吗啉半抗原DIM、载体蛋白(乳铁蛋白LF、卵清白蛋白OVA)和人工抗原(DIM-OVA、DIM-LF)进行紫外全波长扫描，结果如图2所示。由图2所示结果可知，乳铁蛋白LF和卵清白蛋白OVA分别在210nm左右出现了显著的吸收峰，烯酰吗啉半抗原DIM在250nm左右出现了一定的吸收峰，而人工抗原同时具有半抗原DIM和载体蛋白的吸收特征和在最大吸收峰均有偏移；说明本发明成功合成了人工抗原。

所述完全抗原的结构式如式(Ⅱ)所示：

2、骆驼的免疫

用DIM-LF作为免疫抗原对健康的骆驼进行动物免疫，在骆驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mg的免疫抗原。首次免疫时，用0.5mL完全弗氏佐剂与免疫抗原混合乳化后免疫，后续加强免疫用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后免疫，之后每间隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫。

免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测。在第三次免疫后，采集50～100mL外周血，用于构建纳米抗体文库。

3、骆驼淋巴细胞的分离

骆驼外周血采集后需尽快进行淋巴细胞分离，具体操作方法如下：

将骆驼外周血与无菌生理盐水在容积为50mL的无RNA酶离心管中以2:1的体积比混合稀释，稀释后用商品化的淋巴细胞分离液进行淋巴细胞分离；在无菌的50mL离心管中加入15mL淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入15mL的稀释血液，800g离心25min；取淋巴细胞层到新的50mL离心管，用生理盐水稀释2倍，4℃条件下1500g离心10min，弃上清；用5mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次1500g离心10min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞；每份淋巴细胞中加入适量的裂解液(TRNsol)后分装，每1mL作为一份分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用，用于总RNA的提取。

4、总RNA的提取

采用广州捷倍斯生物科技有限公司的RNA提取试剂盒(R4105)提取上述分离保存的淋巴细胞总RNA，根据说明书进行操作即可。

提取总RNA后取少许样品，利用核酸电泳对RNA的质量进行检测，同时利用超微量分光光度计(nanodrop)中测定RNA的浓度。理想的RNA样品应完整无降解，从核酸电泳凝胶上可见清晰的28S和18S条带，且无基因组DNA混杂，在260nm及280nm下的紫外吸收值比值(A₂₆₀/A₂₈₀)应在2.0左右。如果出现基因组DNA污染，应在反转录前用DNA酶去除基因组DNA，并再次通过电泳验证基因组DNA已除去且RNA没有在此过程中发生降解；如果RNA已经发生降解，则需要重新提取RNA。RNA应尽快反转录成cDNA或短暂保存在-80℃环境。

5、cDNA的合成

以提取的总RNA为模板，参照Takara公司的第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：

(1)按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；

表1 cDNA合成的第一步反应体系

(2)按表格配制好反应体系后于65℃孵育5min，冰浴冷却2min；

(3)按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤A反应后的体系中加入试剂；

表2 cDNA合成的第二步反应体系

步骤A反应后的体系	12μL
		5×Reaction Buffer	4μL
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)	1μL
		10mM dNTP Mix	2μL
RevertAid M-MiLVRT(200U/μL)	1μL
		Total	20μL

(4)配制好反应体系后于42℃孵育60min，70℃孵育5min；反转录产物cDNA于-80℃保存。

6、纳米抗体目的基因的扩增

本发明利用巢式PCR对目的基因进行两步法扩增。

第一轮PCR：以反转录所得cDNA作为第一轮PCR模板，利用引物Q1/Q2进行第一轮PCR反应，引物Q1/Q2的核苷酸序列如表5所示，第一轮PCR的反应体系如表3所示。

表3巢式PCR第一步反应体系

第一轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min，30cycle；72℃10min。

第二轮PCR：采用DNA回收试剂盒回收第一轮PCR的反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物Q3/Q4进行第二轮PCR反应，引物Q3/Q4的核苷酸序列如表5所示，第二轮PCR的反应体系如表4所示。

表4巢式PCR第二步反应体系

第二轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃30s，30cycle；72℃10min。

表5 PCR引物序列表

引物Q1	5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′
		引物Q2	5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′
引物Q3	5′-ACTGGCCCAGGCGGCCGAGGTGCAGCTGSWGSAKTCKG-3′
		引物Q4	5′-ACTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCWGGGTC-3′

7、基因文库的构建

(1)VHH目标基因及载体的酶切

采用SfiI酶对VHH目标基因及pComb3xss载体进行酶切反应。酶切条件为50℃恒温反应16h。

pComb3xss载体酶切产物通过琼脂糖凝胶回收分子量为3500bp的条带；VHH基因酶切产物通过DNA回收试剂盒直接清洁回收。

(2)酶切产物的连接

将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1：3)，16℃反应16h后用DNA回收试剂盒清洁回收。

(3)电击转化

取5μL连接产物加入到50μL电转感受态E.coli TG1中，轻轻混匀后转移到0.2cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，电击后立即向电转杯分两次加入800μL和150μL预热到37℃的SOC培养基，收集到无菌离心管中，于37℃，250rpm培养1h复苏细胞。

取50μL复苏菌液进行梯度稀释，将各浓度梯度稀释菌液各取100μL涂布于直径90mm的LB-Amp培养皿作为计数板，37℃培养过夜。剩余未稀释的复苏菌液全部涂布于直径120mm的LB-Amp培养皿，每1mL菌液涂布于2～3个培养皿作为扩增板，37℃扩增培养过夜。

统计计数培养皿上的菌落数，计算复苏菌液中的细菌总数，进行多次电击转化，使转化菌落总数累计达到10⁷cfu以上，此数目即为纳米抗体基因文库的库容量。

将扩增板中的转基因大肠杆菌菌落用细胞刮刀刮下，离心收集菌体，弃上清后重新加入LB-Amp液体培养基(每电转一管加入0.5mL)重悬，混合均匀后加入终浓度为25％的无菌甘油(v/v)，取50μL菌液进行梯度稀释后测定细胞数，其余菌液分装后于-80℃冻存，即为纳米抗体基因库。

8、噬菌体救援

根据上述转基因大肠杆菌细胞数测定结果接种10倍库容量以上的细胞于150mL的LB-Amp液体培养基中，控制OD₆₀₀＜0.2，37℃下250rpm培养至对数期(OD₆₀₀约0.4～0.6)；加入1mL滴度为10¹²cfu/mL以上的辅助噬菌体M13K07，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入Kana(卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)37℃，250rpm培养过夜。将菌液转移到离心瓶，12000rpm 4℃离心15min，取上清，加入1/4体积的PEG/NaCl，冰浴2.5h以上。12000rpm 4℃离心15min，弃上清，沉淀用750μL TBS重悬，转移到1.5mL离心管，4000rpm25℃离心5min，过0.22μm聚醚砜滤膜。取10μL噬菌体测定滴度，其余混合均匀后加入终浓度50％的无菌甘油(v/v)，-80℃保存，即为纳米抗体噬菌体库，可直接用于亲和淘选。

实施例2纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

1、纳米抗体的亲和淘选

(1)抗原和载体蛋白固定化

亲和淘选使用吸附力较强的强吸附酶标板，每轮淘选包板1列，共4轮包板4列。以式(I)所示半抗原通过活泼酯法偶联卵清白蛋白(OVA)后制备所得的完全抗原DIM-OVA作为检测抗原。

AB孔用包被原载体蛋白OVA(卵清白蛋白)稀释至1mg/mL，CDEF孔用CB包被液将检测抗原DIM-OVA稀释至10μg/mL，加入强吸附板微孔中，每孔100μL，37℃静置过夜。此外，因骆驼可能免疫过多种载体蛋白，将ConA(刀豆蛋白)、LF(乳铁蛋白)、KLH(钥孔血蓝蛋白)三种免疫载体蛋白混合稀释，使终浓度均为2mg/mL，单独包被1列免疫原载体蛋白孔。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板两次后，每孔加入120μL 1％鱼胶蛋白溶液37℃静置3h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1h，4℃保存备用。

(2)阳性噬菌体筛选

将实施例1的噬菌体文库加入到2个免疫原载体蛋白孔，每孔150μL，37℃震荡孵育1h(仅第1轮需要此步骤，第2，3，4轮直接从AB孔开始)。将游离噬菌体转移到包被原载体蛋白AB孔，每孔150μL，37℃震荡孵育1h。将游离噬菌体转移到3个有固定化抗原(DIM-OVA)的微孔中，每孔100μL，37℃震荡孵育1h。弃去孔中游离的噬菌体，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤微孔10次，再用PBS洗涤微孔5次。加入100μL 10mg/mL的胰蛋白酶-TBS溶液37℃洗脱30min。收集噬菌体，取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于侵染5mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。

在第二、三、四轮的淘选过程中，DIM-OVA的包板浓度分别降到1000ng/mL、500ng/mL和100ng/mL，重复步骤(2)的筛选方案。用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。药物洗脱浓度分别1000ng/mL、500ng/mL和100ng/mL。以上条件可以根据实际免疫情况进行调整，如果血清效价较低，可以适当提高淘选时的检测抗原DIM-OVA浓度；如果抑制率较低，则需适当提高竞争反应的药物浓度。

2、阳性克隆的鉴定

采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：

(1)抗原固定化

检测抗原DIM-OVA用包被液稀释至1μg/mL，每孔100μL，37℃静置过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板两次后，每孔加入120μL 2％的脱脂奶粉溶液37℃静置3h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1h，4℃保存备用。

(2)纳米抗体小量表达

从第3、4轮淘选的output滴度测定平板上每轮随机挑选96个单菌落，接种到每孔装有0.5mL LB-Amp的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃，180rpm培养过夜，作为菌液“母板”。

从母板中每孔取出10μL菌液接种到另一块每孔装有1mL LB-Amp的96孔深孔板中，接种的孔编号要与母板对应，37℃，180rpm培养4h至对数期，每孔加入IPTG(1：1000比例，v/v)37℃，180rpm培养过夜。

(3)酶联免疫鉴定阳性克隆

将培养过夜的加入IPTG的深孔板4000rpm，10min离心，加入50μL上清到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01MPBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

选取OD₄₅₀大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆进行阳性纳米抗体的鉴定。加入效价组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的PBS；抑制组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的烯酰吗啉/氟吗啉标准品(浓度为1μg/mL)，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min，加入50μL终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值。

选取在板1中OD值大于阴性对照孔3倍，且具有明显抑制的克隆，记录其为NbX-44E菌株，并将母板中对应孔的菌液转移到无菌离心管中，加入甘油冻存备用。

实施例3纳米抗体NbX-44E编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

1、实验方法

将经过间接竞争ELISA鉴定获得的纳米抗体NbX-44E的菌株送到测序公司进行测序，获得纳米抗体NbX-44E的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得纳米抗体NbX-44E的氨基酸序列。

2、实验结果

纳米抗体NbX-44E的VHH的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)所示：

EVQLVQSGGGSVQSGGSLRLSCVVSGYIKTSYCMGWFRQAPGKEREGVVFNDLNGNTGHADSVKGRFTISQDYAKSTFYLQMNSLKPEDTATYYCASKYAVSCAATSTRATDFTYWGQGTLVTVSSGQAG

纳米抗体NbX-44E的氨基酸编号及结构域示意图如图1所示，由图可以看出，所述纳米抗体NbX-44E包括4个框架区(Framework region，FR)和3个互补决定区(Complementarity-determiningregion，CDR)。4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

其中，第1～25位氨基酸序列为FR1，其氨基酸序列为EVQLVQSGGGSVQSGGSLRLSCVVS(SEQ ID NO.2)；第26～33位氨基酸序列为CDR1，其氨基酸序列为GYIKTSYC(SEQ ID NO.6)；第34～50位氨基酸序列为FR2，其氨基酸序列为MGWFRQAPGKEREGVVF(SEQ ID NO.3)；第51～57位氨基酸序列为CDR2，其氨基酸序列为NDLNGNT(SEQ ID NO.7)；第58～95位氨基酸序列为FR3，其氨基酸序列GHADSVKGRFTISQDYAKSTFYLQMNSLKPEDTATYYC(SEQ ID NO.4)；第96～115位氨基酸序列为CDR3，其氨基酸序列为ASKYAVSCAATSTRATDFTY(SEQ ID NO.8)；第116～130位氨基酸序列为FR4，其氨基酸序列为WGQGTLVTVSSGQAG(SEQ ID NO.5)。

纳米抗体NbX-44E的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.9)所示：

GGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTCCCCTGGCCCCAATAAGTAAAATCAGTCGCCCGGGTGGATGTTGCCGCACAAGAGACTGCGTACTTCGACGCACAGTAATACGTGGCCGTGTCCTCAGGCTTCAGGCTGTTCATTTGCAGATAAAATGTGCTCTTGGCGTAGTCCTGGGAGATGGTGAATCGGCCCTTCACGGAGTCTGCGTGTCCTGTGTTACCATTAAGATCGTTAAAGACGACCCCCTCGCGCTCCTTCCCTGGAGCCTGGCGGAACCAGCCCATGCAGTAGCTAGTCTTTATGTATCCAGAGACTACACAGGAGAGTCTCAGGGACCCTCCAGACTGCACCGAGCCTCCCCCAGACTGCACCAGCTGCACCTC

实施例4纳米抗体NbX-44E的大量制备

本发明以蛋白表达的形式大量制备纳米抗体NbX-44E，具体方法为：

用试剂盒提取纳米抗体NbX-44E菌株的质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coli BL21(DE3)中。从转化平板上挑一单菌落接种于10mL LB(含Amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于750mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养至OD_600nm约为0.4～0.6时，加入IPTG(1:1000比例，v/v)，37℃，250rpm培养过夜。第二天4℃，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000rpm离心10min，取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的特异性纳米抗体NbX-44E。

实施例5利用纳米抗体NbX-44E检测烯酰吗啉和氟吗啉

1、包被及封闭

用包被液将DIM-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入1％鱼胶蛋白溶液，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h，用密封袋装于4℃待用。

2、检测烯酰吗啉和/或氟吗啉

(1)实验方法

用包被液将DIM-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入120μL/孔2％的脱脂奶粉溶液，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h。每孔加入50μL纳米抗体和一系列不同浓度的50μL的烯酰吗啉标准品(或氟吗啉标准品)，37℃条件下孵育40min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL的终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以肉桂酰胺类杀菌剂(烯酰吗啉或氟吗啉)标准品的浓度为横坐标，B/B₀(肉桂酰胺类杀菌剂)的孔的OD₄₅₀/未加入肉桂酰胺类杀菌剂的孔的OD₄₅₀为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(2)实验结果

基于纳米抗体NbX-44E建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图3所示，由图可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，针对烯酰吗啉和氟吗啉两种肉桂酰胺类杀菌剂的线性范围分别为0.70～9.89ng/mL和0.95～28.22ng/mL，半抑制浓度(IC₅₀)分别为2.63和5.18ng/mL，最低检测限(LOD)分别为0.43和0.58ng/mL。

3、特异性探究

(1)实验方法

配置其他5种与肉桂酰胺类杀菌剂结构及功能类似的药物标准溶液，使用实施例2中的间接竞争ELISA鉴定方法，测定其他5种类似物，用酶标仪读取450nm处的OD值。绘制标准曲线，计算IC₅₀值与交叉反应率(CR)，CR(％)＝IC₅₀(标准品)/IC₅₀(类似物)如下：

(2)实验结果

表6纳米抗体NbX-44E特异性分析

特异性测定结果如表6所示，纳米抗体NbX-44E与肉桂酰胺类杀菌剂的其它功能及结构类似物(咪鲜胺、抑霉唑、肟菌酯、粉唑醇、咯菌酯)交叉反应率均低于0.1％。结果说明纳米抗体NbX-44E可以特异性识别肉桂酰胺类杀菌剂(暨烯酰吗啉和氟吗啉)。

实施例6纳米抗体NbX-44E的有机耐受性分析

(1)实验方法

用不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％)的甲醇作为稀释液，将纳米抗体NbX-44E稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100％，评价纳米抗体对甲醇耐受能力。具体方法为：

将50μL的稀释好的纳米抗体NbX-44E和50μL的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。

(2)实验结果

不同比例甲醇/PBS作为稀释液时，纳米抗体NbX-44E的活性曲线图如图4所示，由图可以看出，随着有机浓度的提高，纳米抗体NbX-44E的活性逐渐下降，但20％的甲醇溶液下，仍具有80％以上的活性，表明该纳米抗体NbX-44E具有良好的甲醇耐受性，在实际样品检测的前处理过程中，可以添加低浓度的甲醇溶液。

实施例7纳米抗体在不同pH条件下的活性测定

(1)实验方法

用不同pH值(1.4，2.4，3.4，4.4，5.4，6.4，7.4，8.4，9.4，10.4，11.4，12.4)的0.01MPBS作为抗体稀释液。将纳米抗体NbX-44E稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100％，评价纳米抗体对甲醇耐受能力。具体方法为：

(2)实验结果

测定结果如图5所示，由图可以看出，在pH 2.4～8.4范围内，纳米抗体NbX-44E的结合活性有所提升，但是随pH上升提升的幅度下降。在强碱性环境中(9.4～12.4)，纳米抗体活性下降，pH＝12.4时，活性接近失活，结果表明纳米抗体NbX-44E具有良好的耐酸和耐弱碱性，纳米抗体NbX-44E更适合在酸性与弱碱性环境下工作。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Ile Lys Thr Ser Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Phe Asn Asp Leu Asn Gly Asn Thr Gly His Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Tyr Ala Lys Ser Thr Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Lys Tyr Ala Val Ser Cys Ala Ala Thr Ser Thr Arg Ala Thr Asp

100 105 110

Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln

115 120 125

Ala Gly

130

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser

20 25

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Phe

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly His Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Tyr

1 5 10 15

Ala Lys Ser Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Ala Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Tyr Ile Lys Thr Ser Tyr Cys

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asn Asp Leu Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Ser Lys Tyr Ala Val Ser Cys Ala Ala Thr Ser Thr Arg Ala Thr

1 5 10 15

Asp Phe Thr Tyr

20

<210> 9

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggccggcctg gcctgaggag acggtgacca gggtcccctg gccccaataa gtaaaatcag 60

tcgcccgggt ggatgttgcc gcacaagaga ctgcgtactt cgacgcacag taatacgtgg 120

ccgtgtcctc aggcttcagg ctgttcattt gcagataaaa tgtgctcttg gcgtagtcct 180

gggagatggt gaatcggccc ttcacggagt ctgcgtgtcc tgtgttacca ttaagatcgt 240

taaagacgac cccctcgcgc tccttccctg gagcctggcg gaaccagccc atgcagtagc 300

tagtctttat gtatccagag actacacagg agagtctcag ggaccctcca gactgcaccg 360

agcctccccc agactgcacc agctgcacct c 391

Claims

1.一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；所述肉桂酰胺类杀菌剂为烯酰吗啉和/或氟吗啉。

2.一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述基因。

4.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体。

5.一种检测肉桂酰胺类杀菌剂的方法，其特征在于，用烯酰吗啉半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用权利要求1所述纳米抗体作为检测抗体进行检测；所述烯酰吗啉半抗原的结构式如式(I)所示：

所述包被原的结构式如式(Ⅱ)所示：

所述载体蛋白为卵清白蛋白；所述肉桂酰胺类杀菌剂为烯酰吗啉和/或氟吗啉。

6.权利要求1所述纳米抗体在检测肉桂酰胺类杀菌剂中的应用，其特征在于，所述肉桂酰胺类杀菌剂为烯酰吗啉和/或氟吗啉。

7.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在制备检测肉桂酰胺类杀菌的产品中的应用，其特征在于，所述肉桂酰胺类杀菌剂为烯酰吗啉和/或氟吗啉。

8.一种用于检测肉桂酰胺类杀菌剂的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述纳米抗体，其特征在于，所述肉桂酰胺类杀菌剂为烯酰吗啉和/或氟吗啉。