CN110747172B - 杂交瘤细胞株das5g11e7及其产生的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株DAS5G11E7及其产生的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体。本发明提供的杂交瘤细胞株DAS5G11E7(CCTCC NO:C201881)可以用于制备高效价抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达3.2×105；本发明提供的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对二乙酸镳草镰刀菌烯醇的50％抑制浓度IC50为3.08ng/mL，与其他真菌毒素，T2毒素、HT2毒素、呕吐毒素、3‑乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、赭曲霉毒素、伏马毒素的交叉反应均小于0.01％。

Description

杂交瘤细胞株DAS5G11E7及其产生的抗二乙酸镳草镰刀菌烯 醇单克隆抗体
技术领域
本发明涉及杂交瘤细胞株DAS5G11E7及其产生的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体。
背景技术
二乙酸镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol,DAS)又名蛇形毒素，属于单端孢霉烯毒素的一种，主要由梨孢镰孢霉、木贼镰孢霉和镳草镰孢霉等镰孢霉代谢所生。其主要污染谷物和饲料，其毒性较高，损害人类及动物骨髓等造血器官、脑与中枢神经细胞变性、淋巴结、睾丸与胸腺等。因此蛇形毒素污染是威胁农产品质量安全及农业产业发展的重大风险隐患。农产品生产涉及环节多，霉菌毒素污染不可避免，我国已对食品中的主要真菌毒素做了限量规定，但对于蛇形毒素并未做出限定。从而增加了农产品质量安全风险隐患。
现有二乙酸镳草镰刀菌烯醇的检测方法主要是基于大型仪器的实验室确证性检测技术。免疫学检测法是基于抗原-抗体特异性识别，通过酶、荧光等标记技术将免疫信号转变为可检测信号，从而定性或定量显示靶标物的含量。此类方法具有样品处理简单、灵敏度高、特异性强、实验周期短等优点，抗体的灵敏度与特异性直接决定免疫检测法准确与否的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供杂交瘤细胞株DAS5G11E7、其产生的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol，DAS)单克隆抗体及其应用。
本发明提供了杂交瘤细胞株DAS5G11E7，该杂交瘤细胞株已于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C201881。其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO:2所示的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。
抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。本发明提供的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体灵敏度高，同时特异性高。其对二乙酸镳草镰刀菌烯醇(DAS)的50％抑制浓度，IC50为3.08ng/mL；与T2毒素、HT2毒素、呕吐毒素、3-乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、赭曲霉毒素、伏马毒素的交叉反应均小于0.01％。
抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体在二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量测定中的应用。
本发明提供的杂交瘤细胞株DAS5G11E7通过采用两步筛选法获得，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经二乙酸镳草镰刀菌烯醇完全抗原DAS-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的完全抗原DAS-BSA做加强免疫，3天后进行细胞融合，采用HAT半固体培养基培养1-2周后，将单个细胞集落移至96孔细胞培养板培养，待细胞长至孔1/10时，采用间接竞争ELISA法进行筛选，用二乙酸镳草镰刀菌烯醇标准品作为竞争原，选择吸光值和抑制率均较高的孔，采用有限稀释法进行4-5次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株DAS5G11E7。
本发明进一步提供抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将上述获得的杂交瘤细胞株DAS5G11E7注射到预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，待腹水长出，收集至离心管，采用辛酸硫酸铵法纯化即得抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体。
按上述方案，所述的纯化方法辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，10000r/min离心10min以上，将所得上清与2-4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下逐滴加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，上清液用双层滤纸过滤加入1/10滤液体积(0.1mol/L和pH为7.4)的磷酸盐缓冲液，用氢氧化钠(2mol/L)溶液将该混合液pH调节至7.4，冰浴条件下缓慢加入，其最终溶液硫酸铵浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，12000r/min，4℃离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10磷酸盐缓冲液(0.01mol/L、pH为7.4)重悬，置入透析袋用0.01mol/LPBS透析三天，将透析袋中抗体溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体。
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.29g十二水磷酸氢二钠，0.8g氯化钠，0.02g磷酸二氢钾，0.02g氯化钾，加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为2.9g十二水磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，加水定容至100mL所得。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的杂交瘤细胞株DAS5G11E7可以用于制备高效价二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，通过酶联免疫吸附法(ELISA)测得抗体的效价可达3.2×105。
(2)本发明提供的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体灵敏度高、同时特异性好，灵敏度(对二乙酸镳草镰刀菌烯醇(DAS)的50％抑制浓度，IC50)为3.08ng/mL。对T2毒素、HT2毒素、呕吐毒素(DON)、3-乙酰脱氧瓜萎镰菌醇(3-acetyl DON)、赭曲霉毒素(OTA)、伏马毒素B1(FB1)的交叉反应均小于0.01％。
(3)本发明提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体可应用于二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的测定。
附图说明
图1为本发明提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体亲和力测定数据；
图2(a)为本发明提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体与其他真菌毒素交叉反应结果；(b)本发明提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体建立的二乙酸镳草镰刀菌烯醇酶联免疫方法标准曲线。
具体实施方式
实施例1：杂交瘤细胞株DAS5G11E7的筛选
1.动物免疫
采用实验室制备的二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原DAS-BSA对6-7周龄BALB/c小鼠进行免疫。第一次免疫将二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠70μg。前3次每次免疫后8～10天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA对小鼠的血清效价进行检测。第3次免疫后8天，断尾采血，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。
2.细胞融合
加强免疫3天后，采用重量百分数为50％的聚乙二醇分子量为1450的PEG作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死小鼠，取出脾脏，用均质器碾碎脾脏，采用过滤网分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5︰1的个数比混合，离心，用RPMI-1640基础培养液重悬混合细胞，离心，弃上清。加入50％PEG 1-2mL，共用时1分钟，贴壁加入RPMI-1640基础培养液10-20mL，离心，弃上清，管底的融合细胞用20mL含1％HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，2％(体积百分数)生长因子(HFCS)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于sigma-Aldrich公司。
细胞株的筛选及克隆
待细胞融合后2-3周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用HAT液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接ELISA方法，筛选出抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用二乙酸镳草镰刀菌烯醇作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦IC50值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株DAS5G11E7。该杂交瘤细胞株已于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201881。
实施例2：抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体杂交瘤细胞株DAS5G11E7抗体可变区序列测定。
(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株DAS5G11E7的总RNA；
(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScriptTM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；
(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-CAG GTS MAR CTG MAG GAG TCW G-3’(22mer)和5’-CAG GGG CCA GTGGAT AGA CAG ATG GGG G-3’(28mer),其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATC AAG ATG ACC CAG TCT CCA-3’(24mer)和5’-CCGTTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。
得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长351bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由117个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长324bp,序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由108个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。
实施例3：抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定
将实施例1获得的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体杂交瘤细胞株DAS5G11E7注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/LPBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。
用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的亚型为IgG2b。
用常规非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)测得小鼠腹水纯化得到的抗体效价可达到3.2×105，即抗体稀释3.2×105倍时溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA测定其对二乙酸镳草镰刀菌烯醇灵敏度为3.08ng/mL。与其他真菌毒素，T2毒素、HT-2毒素、呕吐毒素、3-乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、赭曲霉毒素、伏马毒素的交叉反应均小于0.01％(表1；图2)。抗体的特异性高低可用交叉反应率来评价。采用间接竞争ELISA方法测定DAS5G11E7单克隆抗体，将DAS、T2毒素、HT-2毒素、DON、3-ACDON、OTA、FB1配制系列浓度的标准溶液，分别与等体积抗体共同加入酶标板中，孵育1h，其他步骤同间接竞争ELISA方法。以上述毒素标准品浓度为横坐标，以酶标仪测定的450nm下OD值B/B0为纵坐标，绘制竞争抑制曲线，通过计算DAS与其他毒素的IC50值比值来判定交叉反应率。计算公式如下：
CR％＝(IC50DAS/IC50其他毒素)×100。
利用间接非竞争ELISA测定DAS5G11E7的亲和力。用DAS-OVA按1.0、0.5、0.25、0.125μg/mL浓度包被酶标板，100μL/孔，37℃，2h；封闭液封闭1h后，将用PBS稀释好的抗体(稀释因子1:2)加入酶标板，其余步骤同间接非竞争ELISA方法。以测定的OD450值为纵坐标，抗体浓度(mol/L)的对数值为横坐标，做出4个浓度的4条S形曲线。找出每条S曲线最顶部的最大OD值即ODmax，找出每条曲线50％ODmax值对应的抗体浓度。将4个浓度任意两两一组，根据公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)计算抗体的亲和力常数，其中[Ab’]t、[Ab]t为每组中两个50％最大OD值对应的抗体浓度，n为每组中包被抗原浓度的倍数(包括1：2，1：4，1：8三个比值)，共得到6个Ka值。将得到的六个Ka值取平均，得抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法亲和力可达5.4×108L/moL(图1)。
实施例4：上述二乙酸镳草镰刀菌烯醇ic-ELISA检测方法的建立：
大米样品的处理：取20g大米样品，加入100mL 80％(体积分数)的甲醇水，用高速研磨机搅拌反应2分钟，制得样品混合液，静置2min，然后用双层滤纸过滤，收集滤液2mL，加入4mL PBS稀释滤液，混匀，得到样品检测液。另取已知的二乙酸镳草镰刀菌烯醇空白大米样品经同样处理获得空白玉米样品检测液。
具体操作步骤如下：将二乙酸镳草镰刀菌烯醇完全抗原包被于96孔酶标板，4℃过夜。PBST洗板三次，加入3.5％-5％脱脂奶粉37℃封闭一小时。加入合适的工作浓度的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体与梯度稀释的二乙酸镳草镰刀菌烯醇标准品溶液各50ul，37℃孵育一小时。PBST洗板三次，加入HRP标记的二抗，PBST洗板三次，显色终止，酶标仪读取OD值。抗原用量为0.05μg/mL，抗体稀释浓度为18000，盐离子浓度为10mM，pH为7.4、抗体稀释液中吐温浓度为0.025％，ic-ELISA检测本发明抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的灵敏度(对二乙酸镳草镰刀菌烯醇(DAS)的50％抑制浓度，IC50)为3.08ng/mL。基于获得的OD值与二乙酰镳草镰刀菌烯醇浓度的关系曲线获得待测样品液中二乙酰镳草镰刀菌烯醇的含量。
为了评价建立的二乙酸镳草镰刀菌烯醇ic-ELISA(间接竞争ELISA)方法准确性，建立基质标准曲线，对空白的小麦样品进行加标回收实验。具体步骤为：称取20g经过液相色谱检测的空白小麦样品，用高速粉碎机磨细过筛。加入70％甲醇水(v/v)，震荡提取10min，超声15min，离心机8000rpm，10min。取上清，过0.45μm的有机滤膜。得到的提取液用PBS以1：3的比例进行稀释。在基质溶液中分别添加系列浓度的DAS标准品，使其最终浓度为2000、500、125、31.25、7.81、1.95、0.48和0.12ng/mL，采用8.6(Origin Lab Corporation,Northampton,MA,USA)，通过四参数逻辑回归绘制了Bx/B0随DAS(log 10)浓度变化的校准曲线，每个数据点为三个独立测量值的平均值(图2b)。另外，样品稀释液分别添加二乙酸镳草镰刀菌烯醇标准品5ng/mL,50ng/mL,100ng/mL三个浓度，采用上述建立的ic-ELISA方法对加标样品含量进行检测，计算样品的加标回收率分别为103.1，86.1％，97％。
采用建立的ic-ELISA方法对搜集的5份小麦样品进行检测，并与液相色谱法进行比对验证。检测结果表明(表2)，ic-ELISA与HPLC的检测结果具有高度相关性，相关曲线为y＝1.0658X-0.3294,R2为0.9952。
表1.DAS5G11E7与其他毒素的交叉反应.
Figure BDA0002275590920000081
表2.实际样品检测
Figure BDA0002275590920000091
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 杂交瘤细胞株DAS5G11E7及其产生的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体
＜160＞ 4
＜210＞ 1
＜211＞ 351bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 1
gaagtgcaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgttcag cctccggatt cactttcaat tactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagacaacc tcctggagtg ggtcgcaggc attagtagtg gtggttctta cacctattat 180
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＜210＞ 1
＜211＞ 324bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 2
caggctgttg tgactcagga acctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60
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cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacagggaca 240
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acaccgacca tttggtgttc 300
ggtggaggaa ccaaattgac tgtc 324
＜210＞ 1
＜211＞ 117
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Asn Leu Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Thr Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Gln Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Arg Leu Pro Phe Gly Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
＜210＞ 1
＜211＞ 108
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 4
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ala Thr Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Gly
20 25 30
Asn Tyr Val Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Ser Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Asn Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Thr
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Thr Asp
85 90 95
His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105

Claims (4)

1.杂交瘤细胞株DAS5G11E7，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201881。
2.抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生。
3.根据权利要求2所述的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体在二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量检测中的应用。
4.根据权利要求2所述的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的杂交瘤细胞株DAS5G11E7注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体。
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