CN111007244B

CN111007244B - 二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法

Info

Publication number: CN111007244B
Application number: CN201911122531.7A
Authority: CN
Inventors: 张兆威; 唐晓倩; 王督; 张奇; 李培武
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN111007244A

Abstract

本发明涉及二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法。二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，包括单独存放的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、酶标条、包被酶标条用二乙酸镳草镰刀菌烯醇‑半谷氨酸‑乳清蛋白偶联物、过氧化氢溶液、表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子和用于检测气压的气压检测传感器；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生。该方法具有灵敏度高、便携、廉价和易于操作等优点。

Description

二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法

技术领域

本发明涉及二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及利用其检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的方法。

背景技术

二乙酸镳草镰刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol,DAS)又名蛇形毒素，属于单端孢霉烯毒素的一种，主要由梨孢镰孢霉、木贼镰孢霉和镳草镰孢霉等镰孢霉代谢所生。其主要污染谷物和饲料，其毒性较高，损害人类及动物骨髓等造血器官、脑与中枢神经细胞变性、淋巴结、睾丸与胸腺等。因此蛇形毒素污染是威胁农产品质量安全及农业产业发展的重大风险隐患。农产品生产涉及环节多，霉菌毒素污染不可避免，我国已对食品中的主要真菌毒素做了限量规定，但对于蛇形毒素并未做出限定。从而增加了农产品质量安全风险隐患。

现有二乙酸镳草镰刀菌烯醇的检测方法主要是基于高效液相色谱等大型仪器的实验室确证性检测技术，样品处理复杂，不便于现场检测等不足。免疫学检测法是基于抗原-抗体特异性识别，通过酶、荧光等标记技术加以放大，从而定性或定量显示靶标物的含量。此类方法具有样品处理简单、灵敏度高、特异性强、实验周期短、适用于现场检测等优点。

发明内容

针对目前现有技术的不足，提供一种检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法。

提供一种二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，包括单独存放的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、酶标条、包被酶标条用二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物、过氧化氢溶液、表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子和用于检测气压的气压检测传感器；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生。

按上述方案，所述的金核铂壳纳米粒子粒径在10-150nm。

按上述方案，所述的竞争型气压免疫传感器还包括橡胶条和放置酶标条的金属容器，金属容器上设有气压检测孔，酶标条放置于金属容器中，然后用橡胶条密封后，利用气压检测传感器检测体系压力。

按上述方案，所述修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子的制备方法：将抗小鼠二抗添加到铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子中混匀，孵育一段时间后，加入封闭液封闭，获得表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子。封闭后的溶液离心去上清，用含有2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸的缓冲液保存培养，4℃贮存备用。

按上述方案，羊抗鼠抗体修饰金核铂壳纳米粒子的时间为6-12h。

按上述方案，羊抗鼠抗体的浓度范围为1-32μg/mL。

一种利用上述二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器检测抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的方法，包括以下步骤：

将包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条加入样品提取液和抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液，孵育，所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生；

加入经过羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子溶液，孵育，后处理；

将后处理后的包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条加入过氧化氢溶液，保持一段时间，待过氧化氢反应产气完成后测量其气压值，基于气压值与二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量关系，分析获得二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量。

按上述方案，所述的孵育条件为25-40℃，30min-2h。

按上述方案，所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液的浓度0.25-0.8ug/mL。

按上述方案，待测样品加样量范围为20-100μL。

按上述方案，产气反应时间范围为5-20min。

按上述方案，所述的后处理为孵育完成后，弃去包被液，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体。

按上述方案，在酶标条上包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的方法为：将酶标条加入到含有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的包被缓冲液中，25-40℃孵育1-4h，接着弃去包被液后，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体，得到包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条。

按上述方案中，包被缓冲液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液。

按上述方案中，二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的包被浓度范围为0.25-10μg/mL。

使用时，将包被有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条加入样品提取液和抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液，孵育，包被于酶标条上的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物与待检测溶液中的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争结合抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的抗原表位，样品中的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量越多，与包被的二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物结合的抗体越少，从而与之结合的经过羊抗鼠(山羊抗小鼠)抗体修饰的金核铂壳粒子的量越少，因此单位时间内催化过氧化氢分解产生的氧气的量越少，从而在恒定体积内产生的气压值也越少。也就是说，所显示的气压值与样品中的二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量呈负相关。由此可实现二乙酸镳草镰刀菌烯醇的含量检测。

本发明的优点在于：

本发明二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器的信号方式由传统的酶联免疫放大改为金属催化放大方式，相对传统的酶联免疫放大，铂金属催化能力强信号放大能力强，同时基于高灵敏的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体，可实现微量甚至痕量检测IC50为4.16ng/mL,检测范围0.46-30.6ng/mL；

基于气压检测的便携性，具有易于操作和可实现现场检测等特点。

金核铂壳纳米粒子结构中铂和金纳米粒子具有生物相容性，可降低贵金属铂的用量，在保留原有强信号放大任你管理的同时兼顾了价格低廉的特点。

附图说明

图1为抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体在竞争型气压免疫传感检测的应用和方法的基本工作原理图，其中1金属溶液，2酶标条，3橡胶条，4便携式气压计；

图2为二乙酸镳草镰刀菌烯醇和气压值的关系图。

图3为本发明提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体亲和力测定数据；

图4(a)为本发明提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体与其他真菌毒素交叉反应结果；(b)本发明提供的二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体建立的二乙酸镳草镰刀菌烯醇酶联免疫方法标准曲线。

具体实施方式

抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的获得

抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201881的杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌产生，制备方法为：

将杂交瘤细胞株DAS5G11E7注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH 为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min， 4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为 0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/LPBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入- 70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇 B₁单克隆抗体；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为 8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到 100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株DAS5G11E7分泌的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体的亚型为IgG2b。

用常规非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)测得小鼠腹水纯化得到的抗体效价可达到3.2×10⁵，即抗体稀释3.2×10⁵倍时溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA测定其对二乙酸镳草镰刀菌烯醇灵敏度为3.08ng/mL。与其他真菌毒素，T2毒素、HT2 毒素、呕吐毒素、3-乙酰脱氧瓜萎镰菌醇、赭曲霉毒素、伏马毒素的交叉反应均小于 0.01％(表1；图4)。抗体的特异性高低可用交叉反应率来评价。采用间接竞争ELISA 方法测定DAS5G11E7单克隆抗体，将DAS、T2毒素、HT2毒素、DON、3-ACDON、 OTA、FB₁配制系列浓度的标准溶液，分别与等体积抗体共同加入酶标板中，孵育1h，其他步骤同间接竞争ELISA方法。以上述毒素标准品浓度为横坐标，以酶标仪测定的 450nm下OD值B/B0为纵坐标，绘制竞争抑制曲线，通过计算DAS与其他毒素的 IC50值比值来判定交叉反应率。计算公式如下：

CR％＝(IC50DAS/IC50其他毒素)×100。

表1.DAS5G11E7与其他毒素的交叉反应.

利用间接非竞争ELISA测定DAS5G11E7的亲和力。用DAS-OVA按1.0、0.5、 0.25、0.125μg/mL浓度包被酶标板，100μL/孔，37℃，2h；封闭液封闭1h后，将用 PBS稀释好的抗体(稀释因子1:2)加入酶标板，其余步骤同间接非竞争ELISA方法。以测定的OD450值为纵坐标，抗体浓度(mol/L)的对数值为横坐标，做出4个浓度的4条S形曲线。找出每条S曲线最顶部的最大OD值即ODmax，找出每条曲线50％ ODmax值对应的抗体浓度。将4个浓度任意两两一组，根据公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab’]t- [Ab]t)计算抗体的亲和力常数，其中[Ab’]t、[Ab]t为每组中两个50％最大OD值对应的抗体浓度，n为每组中包被抗原浓度的倍数(包括1：2，1：4，1：8三个比值)，共得到6个Ka值。将得到的六个Ka值取平均，得抗二乙酰镳草镰刀菌烯醇小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法亲和力可达5.4×10⁸L/moL(图3)。

杂交瘤细胞株DAS5G11E7的筛选

1.动物免疫

采用实验室制备的二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原DAS-BSA对6-7周龄BALB/c 小鼠进行免疫。第一次免疫将二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠70μg。前3次每次免疫后8～10天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA对小鼠的血清效价进行检测。第3次免疫后8天，断尾采血，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。

2.细胞融合

加强免疫3天后，采用重量百分数为50％的聚乙二醇分子量为1450的PEG作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死小鼠，取出脾脏，用均质器碾碎脾脏，采用过滤网分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5︰1的个数比混合，离心，用RPMI-1640基础培养液重悬混合细胞，离心，弃上清。加入 50％PEG 1-2mL，共用时1分钟，贴壁加入RPMI-1640基础培养液10-20mL，离心，弃上清，管底的融合细胞用20mL含1％HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数) 胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和 10000微克每毫升链霉素)，2％(体积百分数)生长因子(HFCS)和1％(重量百分数) 次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于sigma-Aldrich公司。

细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后2-3周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用HAT液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接ELISA方法，筛选出抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用二乙酸镳草镰刀菌烯醇B₁作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株 DAS5G11E7。该杂交瘤细胞株已于2018年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201881。

抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体杂交瘤细胞株DAS5G11E7抗体可变区序列测定

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株DAS5G11E7的总RNA；

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15 由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、 58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体 pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-CAG GTS MAR CTG MAG GAG TCW G-3’(22mer)和5’-CAG GGG CCAGTG GAT AGA CAG ATG GGG G-3’(28mer),其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C， W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATC AAG ATG ACC CAG TCT CCA-3’(24mer)和5’-CCG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长351bp，序列如SEQ ID NO:1 所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由117个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长324bp,序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由108个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。

实施例1金核铂壳粒子及金核铂壳粒子修饰羊抗鼠抗体制备过程

金核铂壳粒子的合成如下：10毫升AuNPs溶液加入200μL 3.86mM H2PtCL4。磁性搅拌将混合物加热到80℃保持5分钟后,400μL,10mM抗坏血酸滴加到混合物，80℃保持30分钟。将得到的金核铂壳粒子水溶液自然冷却贮存备用。

金核铂壳粒子修饰抗体制备：将抗小鼠的二抗(羊抗鼠抗体)4ug添加到金核铂壳粒子中混匀，孵育1-3h后加入含有吐温-20以及惰性蛋白的封闭液中封闭1-3h，得到修饰羊抗鼠抗体的金核铂壳粒子溶液。将封闭后的金核铂壳粒子溶液离心去上清，用含有2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸的缓冲液保存培养，4℃贮存备用。

基于金核铂壳粒子催化产气的免疫方法检测二乙酸镳草镰刀菌烯醇

首先在酶标条上包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物：

将二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物用包被缓冲液(0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液)配制成包被浓度为2μg/mL二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的包被液，将酶标条加入包被液中37℃孵育2h；接着弃去包被液后，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体，得到处理后包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条；

将处理后包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条加入50 μL不同浓度二乙酸镳草镰刀菌烯醇标准品和50μL 0.05μg/mL抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液，在37℃孵育1h；接着弃去酶标条中液体后，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体；然后加入100μL经过羊抗鼠抗体修饰后的金核铂壳纳米粒子溶液，在37℃，孵育1h；接着弃去酶标条中液体后，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体；然后酶标条放置于金属容器中，在加入30％过氧化氢溶液后用橡胶条迅速封口，将金属容器盖子压紧，防止漏气。20min后用便携式气压计测量气压值，得到的二乙酸镳草镰刀菌烯醇浓度和气压之间的关系，如图2。该方法二乙酸镳草镰刀菌烯醇浓度检测范围为0.46-30.6ng/g。实际样品检测时，将酶标条包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物后，加入待检测样品和 0.05μg/mL抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液，孵育；

孵育后，加入经过羊抗鼠抗体修饰后的金核铂壳纳米粒子溶液；孵育；再次孵育后，完全弃去上清并加入过氧化氢溶液，保持一段时间，待过氧化氢反应产气并测量其气压值，基于气压值与二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量关系，即可分析获得二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量。

＜110＞中国农业科学院油料作物研究所

＜120＞二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法

＜160＞ 4

＜210＞ 1

＜211＞ 351bp

＜212＞ DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 1

gaagtgcaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgttcag cctccggatt cactttcaat tactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagacaacc tcctggagtg ggtcgcaggc attagtagtg gtggttctta cacctattat 180

tctgacagtg tgaagggacg attcaccatc tccagagaca gtgccacgaa caccctgtac 240

ctgcaaatga ccagtctgaa gtctcaagac acagccatgt attattgtat tagactcccg 300

tttgggtcta tggactattg gggtcaagga accgcagtca ccgtctcctc a 351

＜210＞ 1

＜211＞ 324bp

＜212＞ DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 2

caggctgttg tgactcagga acctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60

acttgtcgct caagtactgg ggctgtaaca actggtaatt atgtcaactg ggtccaagag 120

aaaccagatc atttattcag tggtctaata ggtaatacca ataaccgagc tccaggtgtt 180

cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacagggaca 240

cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acaccgacca tttggtgttc 300

ggtggaggaa ccaaattgac tgtc 324

＜210＞ 1

＜211＞ 117

＜212＞ PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Asn Leu Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Thr Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Gln Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ile Arg Leu Pro Phe Gly Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

＜210＞ 1

＜211＞ 108

＜212＞ PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 4

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ala Thr Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Gly

20 25 30

Asn Tyr Val Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Ser Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Asn Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Thr

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Thr Asp

85 90 95

His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

100 105

Claims

1.一种二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：包括单独存放的抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体、酶标条、包被酶标条用二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物、过氧化氢溶液、表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子和用于检测气压的气压检测传感器；所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201881的杂交瘤细胞菌株DAS5G11E7产生。

2.根据权利要求1所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：其特征在于：所述的金核铂壳纳米粒子粒径在10-150 nm。

3.根据权利要求1所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：还包括橡胶条和放置酶标条的金属容器，金属容器上设有气压检测孔，酶标条放置于金属容器中，然后用橡胶条密封后，利用气压检测传感器检测体系压力。

4.根据权利要求1所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：所述修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子的制备方法：将抗小鼠二抗添加到铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子中混匀，孵育一段时间后，加入封闭液封闭，获得表面修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子。

5.根据权利要求4所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器，其特征在于：羊抗鼠抗体修饰金核铂壳纳米粒子的时间为6-12 h；羊抗鼠抗体的浓度范围为1-32 μg/mL。

6.一种利用权利要求1所述的二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器检测抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

加入修饰羊抗鼠抗体的铂纳米粒子或金核铂壳纳米粒子溶液，孵育，后处理；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的孵育条件为25-40℃孵育30min-2h；产气反应时间范围为5-20min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述抗二乙酸镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体溶液的浓度 0.25-0.8ug/mL；待测样品加样量范围为20-100 μL。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的后处理为孵育完成后，弃去包被液，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在酶标条上包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的方法为：将酶标条加入到含有二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的包被缓冲液中，25-40℃孵育1-4 h，接着弃去包被液后，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗酶标条并甩干残余液体，得到包被二乙酸镳草镰刀菌烯醇-半谷氨酸-乳清蛋白偶联物的酶标条。