CN102702357B

CN102702357B - 重组人亲环素a抗体、其制备方法及elisa试剂盒以及细胞株

Info

Publication number: CN102702357B
Application number: CN 201210151453
Authority: CN
Inventors: 费小战; 李学斌; 杜蓉; 万慧丹; 陈琰; 代腾飞
Original assignee: WUHAN EIAAB SCIENCE CO Ltd
Current assignee: WUHAN EIAAB SCIENCE CO Ltd
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: CN102702357A

Abstract

本发明涉及一种重组人亲环素A抗体、其制备方法及ELISA试剂盒以及细胞株，解决了现有重组人亲环素A抗体制备过程中工艺条件复杂、特异性差、蛋白免疫学活性损失大的问题。通过将得到的诱导后菌体经或不经预纯化直接免疫实验动物，再经过筛选、纯化得到重组人亲环素A的特异性多克隆抗体或特异性单克隆抗体。本发明重组人亲环素A抗体由上述方法制得，本发明ELISA试剂盒中的固相载体和检测抗体含有上述抗体。本发明具有工艺条件简单、特异性好、纯化简单、蛋白免疫学活性损失少、操作简便的优点。

Description

重组人亲环素A抗体、其制备方法及ELISA试剂盒以及细胞株

技术领域

本发明涉及一种分子生物学与免疫学领域，具体的是说一种重组人亲环素A抗体、其制备方法及ELISA试剂盒以及细胞株。

背景技术

目前已发现和克隆的亲环素有130多种异构体，它们构成了Cyclophilins家族，广泛分布于细菌、真菌、植物和哺乳动物中，在进化的过程中比较保守。亲环素最初是作为环孢菌素A(CyclosporinA，CsA)的蛋白受体被发现的，环孢菌素A是一种免疫抑制剂，临床上用于治疗器官移植产生的排斥反应及自身免疫系统疾病，所以亲环素被认为参与了免疫抑制过程。后来大量的研究表明，亲环素还具有其它许多重要的生物学功能，CyPs具有肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性，催化蛋白质折叠过程，尤其是富含脯氨酸的蛋白质折叠，同时还介导细胞间信号转导和细胞凋亡、参与HIV-1病毒蛋白组装,参与炎症反应等。

人类亲环素A(Cyclophilin A，CypA)基因位于7p13，编码的蛋白质含165个氨基酸，相对分子质量为18×10⁶，主要存在胞质内。CyPA含一个由8条反平行β链构成的桶状结构，7个芳香族及其他疏水残基在桶内形成了一个紧凑的疏水核心，该区域正是环孢素的结合部位。

鉴于以上所述的亲环素生物学功能，近年来，大量的研究表明，CypA与风湿性疾病（如风湿病）、肿瘤（如胰腺癌非小细胞癌）、炎症（如皮肤银屑病，结肠炎、胰腺炎），免疫性疾病（如红斑狼疮）及病毒感染（如乙肝病毒感染）有密切的关系。

对于CypA蛋白的检测，免疫学方法无疑是最为方便的一种，如果用免疫学方法检测需要首先建立检测的方法，并制备试剂盒，试剂盒的核心组分-抗体的制备传统的方法是：用重组蛋白生产抗体，一般的流程是：先培养并诱导表达菌,收集并裂解诱导后的表达菌,带标签的重组蛋白通过标签纯化之后需要使用蛋白酶切除载体融合标签蛋白，不带标签的重组蛋白根据蛋白质特性进行纯化，如果表达蛋白在包涵体里面则包涵体纯化的方法进行,蛋白纯化在目前还是生物学领域的一打难题，需要借助很多手段综合运用，不但如此，往往蛋白的纯度和可溶性都不高,生物活性更难以保证；如果制备抗体，需要用以上纯化的蛋白免疫动物实验，最后再用这纯化的蛋白作为亲和配体来纯化抗体。这样做的程序繁琐，蛋白酶的成本高，不适合大规模工业生产，并且每多一步操作，不但蛋白量损失至少20%（表2），蛋白免疫学活性损失 30%左右（表3）；如果重组蛋白在包涵体中表达，重组蛋白的纯化就更加困难；由于菌体中有很多种蛋白存在，使用任何方法纯化，过程中都难免遇到结构或者性质与目标蛋白类似的菌体蛋白，这类蛋白在纯化过程中很难清除，造成纯化的蛋白纯度不高，有时候通过跑SDS-PAGE胶也很难看清楚，以此蛋白（作为抗原）来免疫动物并以此作为亲和纯化抗原配体纯化得到的抗体或者筛选单克隆抗体细胞株来生产的抗体中必然有一部分是针对残留在纯化蛋白（抗原）中大肠杆菌菌体蛋白的，而人在生活中每天都会接触大肠杆菌，体内也有一些抗大肠杆菌菌体蛋白的抗体，如果以上述方法生产的实际盒来检测人体标本，毫无疑问肯定会对真实的结果引起干扰，造成试剂盒性能下降甚至是无效。

发明内容

本发明目的是为了解决上述抗体生产中存在的技术问题，提供一种工艺条件简单、特异性好、纯化简单、蛋白免疫学活性损失少、操作简便的重组人亲环素A抗体的制备方法。

本发明还提供一种由上述方法制得的重组人亲环素A抗体。

本发明还提供一种含有上述重组人亲环素A抗体的重组人亲环素A 的ELISA试剂盒。

本发明还提供一种只分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株，为一种杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株12C28，其来源种属的拉丁文学名Mus musculus，保藏该细胞株的单名称为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址是：中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年5月7日，保藏编号为CCTCC C201259。

本发明重组人CypA抗体的制备方法包括以下步骤：

（1）扩增人CypA编码区基因，通过酶切位点装入原核表达载体pET-28a，得到重组表达质粒p28a-CypA;

（2）将重组表达质粒p28a-CypA转化至大肠杆菌BL21，加入诱导剂诱导CypA蛋白的表达，得到诱导后菌体；

（3）收集并破碎诱导后菌体，再通过免疫实验动物制备多克隆抗体血清，然后再通过差异性中和法去除多克隆抗体血清中的非针对CypA蛋白的非特异性蛋白抗体，得到含有只针对CypA蛋白的多克隆特异性蛋白抗体的血清；

或者收集并破碎诱导后菌体，再通过免疫实验动物、免疫后动物脾脏细胞与骨髓瘤融合，得到杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株通过差异性ELISA筛选法得到只分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株（即杂交瘤细胞株12C28，保藏编号为CCTCC C201259），阳性细胞株通过普通培养法得到含有只针对CypA蛋白的单克隆特异性蛋白抗体细胞上清液，或者将细胞株注入实验动物体内得到含有针对CypA蛋白的单克隆特异性蛋白抗体的腹水。

（4）对步骤（3）中得到的含有多克隆特异性蛋白抗体的血清或单克隆特异性蛋白抗体的细胞培养上清液或腹水进行纯化得到纯化后的重组人亲环素A的特异性多克隆抗体或特异性单克隆抗体。

本发明中采用了差异性中和法纯化得到多克隆特异性抗体，采用差异性ELISA筛选法筛选只分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株，通过普通细胞培养法得到细胞培养上清液或者经细胞株注入实验动物体内得到腹水，细胞培养上清液或腹水中含有只针对CypA蛋白蛋白的特异性抗体，经过纯化得到单克隆特异性抗体；其基本原理如下：含空表达载体质粒pET-28a和重组表达质粒p28a-CypA的表达菌经过培养诱导表达后，他们的蛋白表达谱的唯一差别就是重组表达质粒的表达菌多了外源重组CypA蛋白片断，所以只要是含有重组蛋白的物质（不管是纯化的还是非纯化，不管是切了标签的还是未纯化的在菌体中的重组蛋白），都可以拿来免疫动物，只要后期可以有效地中和去除所有针对表达菌菌体蛋白的抗体就可以得到高品质、特异性好的多克隆特异性抗体，或者通过有效筛选到只分泌针对CypA蛋白而非菌体蛋白的细胞株就可以生产单克隆特异性抗体。本发明的核心正是基于此原理建立起来的。

所述步骤（1）中，CypA蛋白编码区基因装入原核表达载体pET-28a的具体方法：先设计针对人CypA特异性引物并加装酶切位点（上游EcoRI,下游XhoI），从人肺cDNA文库用PCR技术扩增人CypA编码区基因，回收得到特异性扩增产物片段（回收产物）后，同时用EcoRI和XhoI双酶切消化载体pET-28a和回收产物，将消化后的载体pET-28a和回收产物混合后用T4连接酶连接（连接产物），转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落培养，提取质粒并通过EcoRI和XhoI双酶切鉴定重组质粒，得到重组表达质粒p28a-CypA。

所述步骤（3）中，收集并破碎诱导后菌体，利用载体上的融合6His标签，通过镍亲和层析柱对破碎诱导后菌体进行初纯化，得到初纯化的CypA蛋白，然后再将初纯化的CypA蛋白进行后续的实验动物免疫。初纯化的目的是为了初步纯化CypA蛋白，提高免疫抗原中CypA蛋白含量，进而在免疫实验动物后能够得到含量较高的针对CypA蛋白的抗体血清，提高多克隆抗体的产量或降低后续单克隆抗体筛选的难度；无论免疫实验动物的抗原（CypA蛋白）是否进行过初纯化，在筛选步骤中都可以同时去除所有多克隆抗体血清中的非针对CypA蛋白的非特异性蛋白抗体（包括免疫实验动物后自身产生的非特异性菌体蛋白抗体以及预纯化过程中产的多克隆抗体血清中载体上的34氨基酸残基融合蛋白体抗等各种非针对CypA蛋白的非特异性蛋白抗体），得到只针对CypA蛋白的多克隆特异性蛋白抗体。

或者通过差异性ELISA筛选得到只分泌针对CypA蛋白而非菌体蛋白抗体的细胞株，通过细胞培养得到细胞上清液或者注入动物体内产生的腹水中纯化出单克隆特异性抗体。

步骤（2）中，所述诱导的方法为：将重组表达质粒p28a-CypA转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落到5毫升含有100ug/mL浓度的卡那霉素的LB培养基中，37℃、200转/分培养至OD₆₀₀达到0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导7－8小时后，10000g离心收集菌体，用50mmol/L, Tris-Cl,200mmol NaCl,200mg/L溶菌酶作为菌体用裂解液重悬，室温反应0.5小时，超声波破碎至菌液清亮，10000g离心20分钟，保留上清液得到诱导菌体裂解物。

步骤（3）中，所述差异性中和法为用含空表达载体pET-28a的诱导菌裂解物中和多克隆抗体血清中非针对CypA蛋白的非特异性蛋白抗体，优选加入量为血清中抗体质量的5-10倍。

这里使用差异性中和法的原理为：pET-28a与p28a-CypA细菌诱导后裂解物中蛋白谱中唯一差异就是重组CypA蛋白片段（不包括载体上的34氨基酸残基载体融合蛋白），而纯化工艺过程中不可避免的含有微量的未知菌体蛋白，因此在下游免疫动物制备抗体中不可以避免的含有一些针对菌体未知蛋白的抗体，所以通过pET-28a细菌诱导后裂解物的抗体中和就可以有效去除这些相对于CypA蛋白的非特异性抗体（包括针对融合在CypA蛋白上的载体的34氨基酸残基的抗体），然后再通过简单纯化就可得到纯化后的针对CypA蛋白的重组人亲环素A的多克隆特异性抗体；

步骤（3）中，所述差异性ELISA筛选法为将含重组质粒p28a-CypA和空载体质粒pET-28a的诱导菌体裂解物包被固相载体，分别与待筛选的单克隆抗体细胞株所分泌的抗体反应，只与含重组质粒p28a-CypA的诱导裂菌体解物反应，而不与空载体质粒pET-28a的诱导裂解物反应的细胞株确定为阳性，从而筛选得到只分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株,细胞株培养或者注入实验动物体内得到含有特异性针对CypA蛋白抗体的细胞上清液或者腹水。

使用差异性ELISA筛选法的原理是：pET-28a与p28a-CypA细菌诱导后裂解物唯一不同的是其蛋白表达谱中多了一个蛋白序列，pET-28a与p28a-CypA细菌诱导后裂解物包被酶标板，待筛选的细胞孔上清液同时分别与其反应，只与p28a-CypA细菌诱导后裂解物包被孔反应的，也就是与CypA蛋白序列特异性反应。通过此原理特异性筛选可以得到只针对CypA蛋白抗体的细胞株，从而可以得到细胞培养上清液或者腹水。

步骤（4）中，所述多克隆抗体的纯化方法为以CypA蛋白作为亲和纯化的配体，通过亲和层析的方法纯化含有多克隆特异性蛋白抗体的血清，得到重组CypA蛋白的特异性多克隆抗体。

步骤（4）中，所述单克隆抗体的纯化方法为将腹水经二氧化硅吸附脱脂、硫酸铵沉淀后通过葡聚糖凝胶G₂₀₀进一步分离得到重组人CypA蛋白的特异性单克隆抗体；或者将细胞培养上清液经硫酸铵沉淀后通过葡聚糖凝胶G₂₀₀进一步分离得到重组人亲环素A的特异性单克隆抗体。

所述免疫实验动物的方法可以为常规的家兔或者Balb/C小鼠的免疫，具体免疫实验方法为现有的常规方法。

本发明重组人亲环素A抗体由上述方法制得的重组人亲环素A的多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明重组人亲环素A 的ELISA试剂盒，包括固相载体和检测抗体，其特征在于，所述固相载体或者检测抗体中所使用的抗体为由上述方法制得的重组人亲环素A的特异性多克隆抗体或特异性单克隆抗体。

所述重组人亲环素A 的ELISA试剂盒可以为双抗体夹心法人亲环素AELISA试剂盒或竞争法人亲环素A ELISA试剂盒的制备，试剂盒内主要包括固相载体（包被有重组人亲环素A的多克隆抗体或单克隆抗体）、标准品（纯化的重组人亲环素A蛋白）、检测抗体（或竞争标记物）等，本领域技术人员可根据ELISA试剂盒的具体需要合理配制。

作为试剂盒的制备，以上所制备的单克隆抗体和多克隆抗体可以作为如下例举的组合在双抗体夹心法人亲环素A ELISA试剂盒中使用：（1）多克隆抗体（包被抗体）对应多克隆抗体（包被抗体）；（2）单克隆抗体（包被抗体）对应（多克隆抗体）；（3）单克隆抗体（包被抗体）对应单克隆抗体（检测抗体）；在竞争法人亲环素A ELISA试剂盒中没有检测抗体，包被抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体都可以，竞争ELISA试剂盒中的竞争标记物为纯化的人亲环素A蛋白经过生物素标记制备而成，其余组分竞争法与双抗体夹心法ELISA试剂盒相同。

进一步的，制得的重组人亲环素A的多克隆抗体或单克隆抗体还可以应用于制备胶体金试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式的产品。

有益效果：

1.本发明方法中采用经（或未经）初步纯化的重组CypA蛋白（不需要要求太高纯度也不需要切载体蛋白34氨基酸残基）直接免疫动物而不用p28a-CypA细菌诱导后裂解物可以提高免疫原中有效成分的含量，激发尽可能多的B淋巴细胞，产生更多的抗体，从而提高后期抗体制备的产量或者单抗阳性细胞株筛选的几率，同时降低了工艺难度和生产成本。

2.所用的纯化的重组CypA蛋白初步纯化比较容易，作为免疫原也不需要苛刻的纯度，比较容易实现，蛋白量及蛋白免疫学活性损失少，后期纯化后蛋白纯度高，回收率高（见表1）。

3.本发明中生产的单克隆抗体或者多克隆抗体特异性好，试剂盒也具有特异性好、抗干扰性强、成本低、应用广泛的优点。

附图说明

图1为本发明使用的蛋白表达载体pET-28a图谱。

图2为构建的重组表达质粒p28a-CypA示意图。

图3为从人肺cDNA文库中通过PCR扩增出的CypA基因编码区片段（质量百分比1%琼脂糖凝胶电泳图）。

图4为含重组表达质粒p28a-CypA的大肠杆菌BL21(DE3)经1Mm IPTG不同诱导时长目的蛋白表达量对比SDS-PAGE电泳图，

注：M为蛋白质MARKER,从上到下依次分别为97kD,66kD,43kD,31kD,20kD,14.4kD,泳道1,2,3,4,5,6,7,8,9分别代表诱导前，诱导1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时。SDS-PAGE胶浓度为10%。

图5为纯化后的CypA蛋白电泳图，

注：M为蛋白质MARKER,从上到下依次分别为97kD,66kD,43kD,31kD,20kD, SDS-PAGE胶浓度为10%。

图6为双抗体夹心法ELISA与竞争法ELISA检测CypA蛋白的标准曲线图（图6A为双抗体夹心ELISA试验盒的标准曲线图,图6B为竞争法ELISA试验盒的标准曲线图）。

本发明只分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株，为一种杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株12C28，其来源种属的拉丁文学名Mus musculus，保藏该细胞株的单名称为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2012年5月7日，保藏编号为CCTCC C201259。

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步的阐述，但是不作为本发明内容的限制。

实施例1 重组人亲环素A蛋白重组表达、纯化

1.CypA基因的获取

根据Genbank已经收录的基因（NCBI 收录号：NM_021130.3），应用Primer premier5.0软件设计一对引物，并在上游和下游引物5’端分别设计EcoRI和XhoI限制酶切位点，CypA基因通过酶切位点插入表达载体pET-28a(图1)，并且表达的融合蛋白上含有载体上的6HIS标签蛋白，便于后续纯化（构建后的重组质粒示意图如图2），设计引物如下：

上游引物（P1）：5’ GCGAATCCatggtcaaccccaccgt 3’

下游引物（P2）：5’ GCGCTCGAGttattcgagttgtccacag 3’

以人肺cDNA文库为模版，进行PCR扩增，以获取目的基因，反应体系如下：

加入各组分后混合均匀，PCR反应按以下反应条件进行：94℃预变性2 min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环后，72℃再延伸10min，4℃保存。反应结束后取3μLPCR产物进行质量百分比1.0%琼脂糖凝胶电泳检测（图3）。

利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Axygen,AP-GX-50）从凝胶中回收目的DNA片段(操作参照产品说明书进行)。

2. 大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态的制备

在构建p28a-CypA和进行诱导表达CypA的过程中需要用到大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）。

大肠杆菌DH5α感受态（氯化钙法）制备具体方法如下：挑取DH5α菌株在LB平板上划线，37℃培养后，挑取单菌落转到10mL LB液体培养基中，37℃200r/min培养过夜；将上述培养液按2%接种量接种到50mLLB液体培养基中37℃200r/min振荡培养2-3小时；将培养后的菌液置冰浴中10min后转移到无菌的50mL离心管中，4℃4000r/min离心10min，去掉上清液，向管中加入20mL无菌的预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重新悬浮菌体，4℃4000r/min离心10 min，去掉上清液；向管中加入2mL无菌的预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重新悬浮菌体,即为感受态细胞；刚做的感受态细胞可直接用于转化试验，也可将剩余的感受态细胞加入终浓度为30%(体积比)的甘油分装于1.5mL离心管（100μL/管）置-70℃保存备用。

大肠杆菌BL21（DE3）的制备方法同大肠杆菌DH5α。

3．重组质粒p28a-CypA的构建

将回收的DNA片断与原核表达载体pET-28a分别用EcoRI和XhoI限制酶进行酶切，酶切后分别回收DNA片断，按照pET-28a载体：CypA DNA片断数量=1：5-10的比例混合，加入T4 连接酶，16℃连接过夜，连接产物用于转化大肠杆菌DH5α感受态，转化后涂布于LB半固体平板，37℃培养过夜。

挑取平板上的单菌落扩大培养至3毫升培养瓶中，收集菌液提取质粒，通过双酶切进行鉴定（鉴定标准：酶切之后电泳显示为两条清晰的条带，大小分别为约5kb和500bp），鉴定正确的质粒即为重组表达质粒p28a-CypA。

4.重组质粒p28a-CypA的转化诱导表达及重组质粒p28a-CypA表达条件的优化。

重组表达质粒p28a-CypA转化表达菌BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落，接种于100毫升LB（含50ug/mL卡那霉素），37℃ 200rpm培养之OD600为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM诱导目的蛋白的表达,每隔1小时取样，将以上每次所取样品连同诱导前的样品，10,000g离心收集菌体即为诱导后菌体，采用裂解液（50mmol/L Tris-Cl,200mmol/L NaCl,200mg/L溶菌酶）重悬，室温反应0.5小时，超声波破碎至菌液清亮，得到诱导后菌体裂解物，菌体裂解物10000转/分离心20分钟，取上清液进行10% SDS-PAGE电泳，通过不同诱导时间的CypA表达量比对，得到CypA蛋白最佳诱导时间为7－8小时（图4）。

重组CypA蛋白的初纯化

按照以上已优化的条件大量培养诱导重组质粒p28a-CypA菌的表达，收集菌体并通过超声波破碎，离心后上清液通过镍亲和层析琼脂糖凝胶（GE healthcare, 17-5318-01）进行纯化(操作方法参照产品使用手册)，如果沉淀过多，则用尿素溶解沉淀后取上清通过镍亲和层析琼脂糖凝胶纯化目的蛋白，得到初纯化的CypA蛋白，所有步骤参照产品使用手册严格执行，纯化后得到的蛋白经10% SDS-PAGE分析纯度（如图5）, 从SDS-PAGE胶上有很少量的菌体蛋白杂带。

实施例2. 重组人亲环素A蛋白抗体（单克隆或多克隆特异性蛋白抗体）的制备

将初纯化的CypA蛋白进行动物免疫及免疫效果检测，方法如下：

动物免疫

选择适龄的健康雄性动物进行免疫，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/ 次，采用多点皮下注射方法，每间隔3周，进行加强免疫，剂量为首免的一半，每次免疫前耳静脉取血监测抗体效价，直到血清抗体ELISA效价达到1：1,000,000以上。免疫佐剂为佛氏佐剂，首免用佛氏完全佐剂，以后用佛氏不完全佐剂，每次免疫前将完全抗原与佐剂按照同体积混合后通过超声波乳化。本实施例以家兔为免疫动物制备多克隆抗体，以BalB/C小鼠为例制备单克隆抗体。

（1）多克隆抗体的制备（差异性中和法）

家兔的免疫按上述动物免疫方法进行，得到满足效价要求的血清抗体（重组人亲环素A蛋白）用包被稀释液稀释到1μg/mL，100μL/孔，包被于96孔酶标板中，4 ℃过夜；拍干板孔中的液体，封闭液（含1%羊血清的0.01mol/L TBS（pH8.5），150μL/孔，室温封闭4小时；用TBS/Tween-20（含体积比0.05% Tween-20）洗板后，待检血清与未免疫动物空白血清平行从1：1,000倍比稀释后，100μL/孔，37℃ 孵育60分钟；用TBS/Tween-20（0.05%）洗板后，将HRP标记羊抗兔（1：1,000稀释，武汉伊艾博科技有限公司生产），100μL/孔加入，37℃孵育45分钟后，TBS/Tween-20（含体积比0.05% Tween-20）洗板3次后，加入即用型3,3’,5,5’-四甲基联苯胺 (TMB) 显色液 (武汉伊艾博科技有限公司生产)，室温反应10分钟，每孔加100μL显色终止液（2mol/L H₂SO₄）终止反应，通过酶标仪读取450 nm吸光值（OD₄₅₀）。待检血清某个稀释度的450 nm吸光值是空白血清的3倍时，该稀释度定义为该抗体的ELISA效价。

当完全抗原免疫的动物血清效价达到实验要求后，分别采用颈动物放血，收集全血，37℃放置1小时后，4℃过夜，离心分离血清；血清中加入质量百分比0.01%叠氮化钠，-20℃保存备用，得到含有只针对CypA蛋白的多克隆特异性蛋白抗体的血清。

（2）单克隆抗体制备

BALB/c小鼠的免疫按上述动物免疫方法进行，首免和二免后一个星期分别用断尾抽真空法采血200μL进行抗体检测，二免采血后让小鼠休息两周进行加强免疫，三天后融合。注：免疫剂量以载体蛋白的质量计算，100ug/只/次。。

①瘤细胞的准备：融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞并培养(培养方法参照ATCC提供的方法),在融合前天将细胞调整到合适浓度,融合是细胞处于80%长满,大小均匀透亮为宜。

②饲养细胞的制备

制备饲养细胞，采用Balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞的混合细胞作为饲养细胞，其制备步骤如下：

脱颈椎处死空白Balb/c小鼠1只，用75%（体积比）的酒精浸泡5min。在无菌超净台上仰面固定好小鼠，剪开腹部皮毛并撕分开固定至两侧，露出胸腹；镊子提起腹膜，注射器针头刺破腹膜注入2.5mLRPMI－1640基础培养液，反复吹吸多次，最后将腹腔液体吸回注射器，4000rpm离心5分钟，RPMI－1640基础培养液重悬即为腹腔巨噬细胞。剪开腹膜，打开腹腔，取出脾脏，去除脂肪和筋膜，匀浆器加5 mLRPMI－1640基础培养液研磨脾脏至均匀糊状，稍微静置吸取上部细胞悬液装入离心管，加入10mLRPMI－1640基础培养液，4000rpm离心5分钟，如此重复洗涤3次。

③免疫脾细胞的制备

免疫脾细胞的制备与饲养细胞制备中的脾细胞制备完全相同。

④细胞融合

将免疫脾细胞和SP 2/0骨髓瘤细胞按照1:3-10的数量比混合摇匀，4000rpm离心5分钟，倒掉上清，细胞沉淀放在振荡器上震荡2分钟，细胞混合物变成粘稠糊状之后，缓慢均匀的加入1mL 的50%PEG1450融合剂,边加边搅动使细胞糊状始终保持均匀，无块状团状，1分钟内加完后静置90秒，立即用50mL RPMI－1640基础培养液均匀稀释，边加边搅动，始终保证细胞糊均匀，加完后离心再加入50mLRPMI－1640基础培养液离心洗涤两次。

融合后的细胞与适量的饲养细胞混合，用含质量体积比1%HAT的RPMI－1640完全培养液（含10%胎牛血清）将其分钟于96孔细胞培养板，没孔100uL, CO₂培养箱温度调到37℃，5%的CO₂浓度。4-7天后可以在培养板孔中看到细胞集落，第7天补加100uL含质量体积比1%HT的RPMI－1640完全培养液继续培养，细胞液变黄可以开始检测。

⑤筛选方法的建立

本发明采用差异性ELISA筛选方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选：含重组质粒p28a-CypA与空载体质粒pET-28a的诱导后菌体裂解物分别包被固相载体，通过间接ELISA法，筛选与含重组质粒p28a-CypA裂解物包被板孔，而不与空载体质粒pET-28a的诱导裂解物包被物板孔反应的细胞孔，确定为阳性孔，步骤如下：

A．包被：含重组质粒p28a-CypA与空载体质粒pET-28a的诱导裂解物分别作为包被物，以1mg/mL的浓度用碳酸盐（PH9.6）包被酶标板过夜（以下分别简称p28a-CypA孔和pET-28a孔）；

B．封闭：倒掉剩余包被物，拍干酶标板，向酶标板内加入封闭液（含质量体积比1% BSA的0.01mmol/L TBS pH8.5） ,室温封闭3小时；封闭完成后加入ELISA洗涤液，每孔200μL，3－5min后倒掉，拍干，如此重复三次。

C．加培养上清：仅对有集落的孔进行检测，每孔取样两次，每次50μL，分别加到p28a-CypaA孔和pET-28a孔内，加完后，在桌面上水平地轻轻晃动酶标板使之混匀，37℃温箱放置1h后，洗板三次。同时设阴性血清和阳性血清对照（1：5000加样）。

D．加HRP标记羊抗鼠IgG：工作浓度1：10000，每孔100μL，37℃温箱放置30min后，洗板四次。

E．洗板3次后，加入即用型3,3’,5,5’-四甲基联苯胺 (TMB) 显色液 (武汉伊艾博科技有限公司生产)，室温反应10分钟，每孔加100μL显色终止液（2mol/L H₂SO₄）终止反应，通过酶标仪读取450 nm吸光值（OD₄₅₀）。

F．结果判定：根据同一样品OD_p28a-CypA孔/OD_pET-28a孔来加以判断，选择OD_p28a-CypA孔/OD_pET-28a值最大的3-5孔通过有限稀释法再次克隆，选取只有单个克隆的细胞孔重复以上的ELISA筛选步骤，得到可稳定的分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株（即杂交瘤细胞株12C28，保藏编号为CCTCC C201259，保藏日期为2012年5月7日），采用间接ELISA法鉴定分泌的抗体亚型为IgG_2a型。抗体亚型的鉴定参照常规通用的间接ELISA法方法进行，本实施例不做赘述。

⑥小鼠腹水法生产单克隆抗体

本实施例采用灭菌液体石蜡预处理BALB/c小鼠后，再注射杂交瘤细胞的方法生产腹水，其具体过程如下：

用灭菌的液体石蜡处理小鼠，腹腔注射0.5mL/只，十天后即可注射杂交瘤细胞，用RPMI－1640基础培养液稀释成1－5×10⁶个/毫升，腹腔注射小鼠0.5mL/只，8天左右观察到小鼠腹部隆起，即可采集腹水（含有针对CypA蛋白的单克隆特异性蛋白抗体的腹水）。

⑦培养细胞法生产单克隆抗体

按照常规细胞培养法进行，本实施例不做赘述。

实施例3 抗体的纯化

1、多克隆抗体的纯化：

将亲和纯化的CypA蛋白过量藕联到琼脂糖凝胶4B（GE Healthcare,17-0430-01）上制备亲和层析介质，层析介质装配成层析柱，将上述实施例2中分离的多克隆抗体血清中通过亲和层析的方法提取针对该CypA蛋白抗原的特异性抗体，藕联方法与亲和层析纯化方法参照该琼脂糖凝胶4B的产品说明书进行，得到重组人亲环素A的特异性多克隆抗体。

2、单克隆抗体的纯化：

A.用二氧化硅吸附法对腹水进行预处理：取一定量的腹水，加等体积的巴比妥缓冲液，加适量二氧化硅粉末，室温下，搅拌30 min，1800 r/min，离心20 min，即得澄清的腹水。

B.用50%的饱和硫酸铵（按最终饱和度算）粗提一次，33%的饱和硫酸铵粗提两次，用1/2腹水体积的PBS将单抗溶解，装入透析袋，用PBS透析两天，用小青霉素瓶分装，每瓶2 mL，冻干，－20℃保存。使用时用2 mL蒸馏水溶解，再加等体积甘油，混匀后，－20℃保存。

C葡聚糖凝胶G₂₀₀纯化单抗：将葡聚糖凝胶G₂₀₀用PBS于4℃浸泡三天，装柱，将粗提的单抗取1mL上样，用PBS洗脱，20%磺基水杨酸检测，出现白色浑浊后开始收集，浑浊度较低时停止收集。用小青霉素瓶分装成每瓶2 mL，冻干，－20℃保存。使用时用1mL蒸馏水溶解，再加1mL甘油，混匀后，－20℃保存，得到重组人亲环素A的特异性多克隆抗体。

实施例4、人亲环素A ELISA试剂盒的制备

作为试剂盒的制备，以上所制备的单克隆抗体和多克隆抗体可以作为如下组合在双抗体夹心法人亲环素A ELISA试剂盒中使用：（1）多克隆抗体（包被抗体）对应多克隆抗体（包被抗体）；（2）单克隆抗体（包被抗体）对应（多克隆抗体）；（3）单克隆抗体（包被抗体）对应单克隆抗体（检测抗体）；在竞争法人亲环素A ELISA试剂盒中没有检测抗体，包被抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体都可以，竞争ELISA试剂盒中的竞争标记物为纯化的人亲环素A蛋白经过生物素标记制备而成，其余组分竞争法与双抗体夹心法ELISA试剂盒相同。

1．双抗体夹心法人亲环素A ELISA试剂盒的制备

本实施例采用单克隆抗体（包被抗体）对应（多克隆抗体）为例来进行说明双抗体夹心法人亲环素A ELISA试剂盒的制备。

固相载体制备：将纯化得到的单克隆特异性抗体包被固相载体（ELISA板），包被方法：抗体经碳酸盐缓冲液（PH9.6）稀释到1μg/mL，100μL/孔，包被于96孔酶标板中，4 ℃过夜；拍干板孔中的液体，封闭液（含质量体积比1% BSA的0.01mmol/L TBS pH8.5），150μL/孔，室温封闭4小时；排干后孔中液体，自然晾干，铝箔袋真空密封包装，-20℃保存，装盒备用。

标准品的制备：纯化的人CypA蛋白

测定浓度后分装成1ug/支，真空冻干，备用。

检测抗体的制备：将纯化得到的多克隆特异性抗体标记生物素，制备成检测抗体（标记方法参照Sigma B2643产品说明书）。

样品稀释液：含1%BSA（质量体积比）, 0.01mmol/L TBS pH8.5

检测抗体稀释液：含1%BSA（质量体积比）,1%PEG4000（质量体积比）0.01mmol/L TBS pH8.5

浓洗涤液：0.25mmol/L TBS pH8.5

试剂盒组装：本试剂盒包括固相载体（包被有抗体：单克隆特异性抗体的96孔酶标板）1块、标准品（纯化的人CypA蛋白的冻干品，1ug/支，临用前用去离子水稀释到1毫升，然后样品稀释液作连续倍比稀释）2支、检测抗体（生物素标记的多克隆特异性抗体120μL，临用前用检测抗体稀释液稀释100倍即为检测抗体工作液）1支，链霉亲和素酶标记复合物（120μL，武汉伊艾博科技有限公司生产，临用前用检测抗体稀释液稀释100倍即为链霉亲和素酶标记复合物工作液）1支，即用型3,3’,5,5’-四甲基联苯胺 (TMB) 显色液 (12mL，武汉伊艾博科技有限公司生产)1支，显色终止液（10 mL 2MH₂SO₄）1支，样品稀释液（20ml）1支，检测抗体稀释液（10ml）1支，浓洗涤液（30ml,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍）1瓶，酶标板覆膜5张，使用说明书 1份。

2．竞争法人亲环素A ELISA试剂盒的制备

本实施例采用单克隆抗体作为包被抗体进行说明。

竞争法人亲环素A ELISA试剂盒的制备方法与双抗体夹心法不同点就是：“检测抗体的制备”改为“竞争标记物的制备”，具体方法如下：将纯化得到的CypA蛋白通过生物素标记，制备成竞争标记物（标记方法参照Sigma B2643产品说明书），其余与夹心法人亲环素A ELISA试剂盒相同。

试剂盒组装：竞争法ELISA试剂盒中无生物素标记的检测抗体，将该对应的组分改为竞争标记物，其余同双抗体夹心法人亲环素A ELISA试剂盒的组装。

实施例5 人亲环素A的检测

将纯化的人亲环素A蛋白加入空白血清中，通过以上两种不同检测方法的试剂盒（竞争法ELISA试剂盒与双抗体夹心法ELISA试剂盒）检测含量，计算回收率（结果见表1）。

实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37℃溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

夹心法ELISA试剂盒操作按照如下程序进行：

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μL，标准孔加稀释好的标准品100μL/孔，待测样品孔加待测样品100μL/孔，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃温育2小时。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测抗体工作液 100μL（临用前配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

2、弃去液体，甩干，洗板 5次，每次浸泡1-2分钟。每孔加链霉亲和素酶标记复合物工作液100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3、弃去孔内液体，甩干，洗板 5次，每次浸泡1-2分钟，大约400μL /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4、每孔加3,3’, 5,5’-四甲基联苯胺 (TMB) 显色液90μL，酶标板加上覆膜37℃避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。

5、每孔加显色终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与显色液的加入顺序相同。

6、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值（OD₄₅₀值）。

7、得到的原始数据以浓度为横坐标，OD₄₅₀为纵坐标通过曲线专家1.4（curve expert 1.4）软件绘制标准曲线图（图6A为双抗体夹心法ELISA试剂盒的标准曲线，图6B为竞争法ELISA试剂盒的标准曲线）。

竞争法ELISA试剂盒第一步按如下程序进行，其余步骤同夹心法ELISA试剂盒：

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μL，标准孔加稀释好的标准品50μL/孔，待测样品孔加待测样品50μL/孔，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，立即分别在每空加入50μL稀释好的竞争标记物工作液，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃温育45分钟。

表1.利用ELISA试剂盒检测人空白血清中CypA蛋白的回收率

通过以上实验说明，两种方法制备的试剂盒在样品检测中具有较好的回收率。

实施例6 亲和层析纯化重组人亲环素A的检测蛋白收量的计算

按常规方法培养并诱导50毫升p28a-CypA表达菌，诱导后收集菌体，用于裂解后亲和纯化，洗脱后用凝血酶因子除载体上34氨基酸残基标签，再次通过镍亲和层析柱清除切割下来的标签蛋白，每步操作留样并记录总体积，用以上双抗体夹心法ELISA测量每步样品中蛋白含量，测量方法参照以上双抗体夹心法ELISA方法。直接裂解菌体液记作A液，亲和纯化洗脱下来的带标签的CypA蛋白液记作B液，切除载体标签蛋白后的CypA蛋白液记作C液，结果见表2。

表2 普通亲和层析过程蛋白质回收率表

（以上所测量出来的蛋白含量为有免疫学活性的CypA蛋白,带34氨基酸残基标签的质量并未计算在此之内）。

通过以上试剂盒检测菌体纯化过程中CypA蛋白总量的变化，以上数据证实，蛋白纯化的过程中每多一步就会有20%左右的损失。

实施例7 蛋白免疫学活性分析

将B液和C液通过分光光度仪测量CypA蛋白含量（包括有免疫学活性的和无免疫学活性的），C液调整到浓度为1mg/mL，B液调整到1.21mg/mL(B液中蛋白含有载体34氨基酸残基标签,因此在分光光度计测量时也被计算在内，实际CypA蛋白含量/带标签CypA蛋白含量=1.21)，稀释120000倍，通过双抗体夹心ELISA试剂盒测量CypA蛋白含量，结果如表3。

表3 双抗体夹心ELISA分析B液和C液中具有免疫学活性CypA蛋白含量

通过试剂盒检测的数据表明，在切标签过程中会有26.2%的CypA蛋白会失去免疫学活性。

本发明中未提及部分为本行业公知技术，在此不作过多说明。

Claims

1.一种只分泌针对CypA蛋白抗体的阳性细胞株，其特征在于，为一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC C201259。