CN103336125A - sH2a定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明免疫分析技术领域中一种定量检测sH2a蛋白的酶联免疫试剂盒及其检测方法。本发明所提供的sH2a定量检测试剂盒包括sH2a特异性抗体包被的微孔板、sH2a蛋白标准品、酶标记的抗人sH2a抗体。本发明的sH2a检测试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，具有高准确性、高特异性和高灵敏度等特点，并且能够同时检测大批样本，在肝病体外诊断中发挥重要作用。

Description

sH2a定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言，本发明涉及一种定量检测sH2a蛋白的免疫分析检测试剂盒。 

技术背景

sH2a是一种在肝脏特异性表达的可溶性分泌型蛋白，分子量约35KD。它与另一种也只在肝细胞表达的去唾液酸受体蛋白(ASGPR)的H2亚基同源，但研究表明，sH2a并不参与ASGRP H2亚基的组装。sH2a的前体蛋白在肝细胞表达出来后，在内质网被剪切去约5个氨基酸成sH2a后，即被释放到细胞外，进入血液循环。正常人外周血中sH2a蛋白保持较高水平，但在肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病患者中sH2a的蛋白含量显著下降，因此，通过检测患者血中sH2a含量可获得肝脏功能状况的信息，可作为临床肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病的辅助诊断。 

本发明是在发明号200480013005.2的发明基础上，对sH2a蛋白检测技术进行了优化，改变了原发明检测方法稳定性差，检测灵敏度低、特异性差、只能定性不能定量等问题，用更为稳定的双抗夹心法代替了原来的竞争性ELISA法，并且在包被、封闭、显色等环节进行了工艺改进，形成了成熟的可用于临床及实验室检测的sH2a定量检测试剂盒。本发明试剂盒具有定量、稳定性好、灵敏度高、特异性强、准确度高等优点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定性好、灵敏度高、特异性强、准确度高的定量检测sH2a的免疫分析检测试剂盒，具体来说是检测人sH2a的定量免疫分析检测试剂盒。 

本发明提供了一种检测sH2a定量检测试剂盒，其中包括：包被有sH2a特异性抗体的微孔板、sH2a蛋白标准品、酶标记抗人sH2a单抗、底物显色剂、洗涤液、反应终止液、样品稀释液。 

其中sH2a特异性抗体是指识别sH2a至少一个抗原表位的多克隆抗体，或者更优地，是指识别sH2a至少一个抗原表位的单克隆抗体。 

所述的sH2a酶标记抗人sH2a单克隆抗体是指由保藏号B904030801的B9杂交瘤细胞所产生。 

当包被的抗体是单克隆抗体时，其抗原表位与酶标记单克隆抗体的抗原表位不同。 

所述的sH2a酶标记抗人sH2a单克隆抗体是辣根过氧化物酶标记的抗体。 

所述的酶标记抗人IgG抗体采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述偶 联方法为改良过碘酸钠法。 

用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。 

所述的洗涤液为0.05％tween20的磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1∶1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的样品稀释液为含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，所述的抗体稀释也为含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液。 

本发明的另一方面，提供了一种定量检测血清或血浆中sH2a蛋白含量的方法，包括步骤： 

(1)用权利要求1-11任一所述的试剂盒进行检测，向sH2a特异性抗体C包被的微孔板中加入sH2a蛋白标准品或待测样品溶液，孵育后洗涤拍干，再加入酶标记的抗人sH2a单克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入显色剂、终止液，用酶标仪或化学发光仪测定吸光度值； 

(2)分析检测结果。 

本发明试剂盒的检测原理为： 

将抗sH2a的特异性抗体包被在固相载体上，加入待检测样品或sH2a标准蛋白，样品或标准品中的sH2a蛋白就跟固相载体上的抗sH2a特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，用洗涤液去除无关的成分，然后加入酶标记的抗人sH2a单克隆抗体，酶标抗体与微孔板上的抗原-抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，通过洗涤出去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与标准品中含sH2a蛋白的量呈正相关(图1)，用不同浓度梯度的标准品溶液制作标准曲线，即可计算出样品中sH2a的含量。 

附图说明

图1为sH2a标准品绘制的标准曲线. 

图2为实施例1中重组蛋白SDS-PAGE图。图2.重组蛋白SDS-PAGE M.蛋白标准分子量marker 1.空载体菌 2.裂解后的重组菌 3.纯化后的重组蛋白 

图3为实施例1中重组蛋白western blotting图。图3.重组蛋白western blot M.蛋白标准分子量marker 1.空载体菌 2.纯化后的重组蛋白 

图4为实施例5中样本检测结果。图4样本sH2a蛋白水平检测 

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地理解本发明，而不是对本发明的内容和保护范围构成任何限制。 

实施例1sH2a蛋白制备 

1.1试剂及仪器 

1)试剂 

大肠杆菌宿主菌DH5α、BL21(DE3)，克隆载体pCR2.1T-vector，表达质粒pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性内切酶BamH I、Hind III和EcoR I、BamH I，DL2000DNA Marker、T4DNA连接酶，低分子量标准蛋白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等。 

2)仪器 

普通摇床SCS-24；隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge5810R、台式离心机MiniSpin；高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统；PCR仪；转印仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。 

1.2载体构建 

设计引物GAACCATCAGGAGGATCCCAAAGTGAGGGTC和GGAA TTCTC AGGCC ACCT CGCC从模板DNA中PCR扩增出sH2a片段，胶回收试剂盒回收片段后连接到pCR2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中，酶切位点为EcoR I、BamH I，同时载体上有6×HIS标签，便于后续的蛋白纯化。 

1.3蛋白表达 

将重组质粒BL21(DE3)-pET28a-sH2a转化导入表达菌BL21(DE3)，挑取转化成功的克隆进行37℃培养，培养至OD600nm的值为0.6左右时，加入0.3mM的IPTG，32℃培养3h诱导目的蛋白表达。诱导结束后，超声裂解菌体，取裂解上清利用HIS蛋白纯化柱进行纯化后，测定蛋白浓度。 

1.4活性测定 

我们利用western blotting免疫学方法对目的蛋白的活性进行鉴定。 

首先将纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，同时设立未诱导的BL21(DE3)-pET28a空载体细菌裂解蛋白作对照。SDS-PAGE结果显示，目的蛋白大小为35KD(图2)，与理论值相符。然后将蛋白利用转印仪转印到NC膜上进行western blotting实验：首先将NC膜用1％BSA的磷酸盐缓冲液封闭4℃过夜后用0.5％Tween20的磷酸盐缓冲液洗膜，然后加入鼠抗人sH2a抗体37℃摇晃温育2h；洗膜后加入抗鼠IgG酶标二抗摇晃温育1h；洗膜、ECL显色。结果显示为目的蛋白处有明显的特异性条带(图3)，而空载体对照相应处则无条带，证明sH2a重组蛋白构建正确，且具有良好的生物学活性。 

实施例2兔抗人sH2a多克隆抗体制备 

2.1试剂及实验动物 

2-3公斤重的家兔，弗氏完全佐剂，弗式不完全佐剂，sH2a偶联KLH多肽，乳化器，2ml注射器等。 

2.2试验方法 

2.2.1抗原准备： 

1)首次免疫400ug/只，第2、3、4次200ug/只； 

2)首次免疫，将抗原与完全弗氏佐剂1∶1混合，用针管充分乳化。 

3)第2、3次，将抗原与不完全佐剂1∶1混合，充分乳化。 

4)末次加强免疫，注射抗原，不加佐剂。 

2.2.2免疫方法： 

1)用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精消毒皮肤； 

2)第一次免疫：用注射器吸取弗氏完全佐剂乳化的抗原液，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。 

3)第二次免疫：间隔14天后，于两侧肩后部及腹部皮下分点共注射2ml。 

4)第三次免疫：间隔7天后，于两侧肩后部及腹部皮下分点共注射2ml。 

5)末次加强免疫：间隔9天后。 

末次加强免疫后，10天采血。包被免疫抗原，经过ELISA实验效价达到1∶10000后(表1)，心脏放血取血清。 

表1兔抗血清效价测定 

实施例3酶标抗人sH2a抗体制备 

3.1细胞培养 

培养保藏号B904030801的B9杂交瘤细胞，并用G蛋白纯化柱纯化其培养上清，获得高纯度的B9单克隆抗体。 

3.2辣根过氧化物酶(HRP)标记 

将纯化好的B9抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)，采用改良过碘酸钠法，步骤如下： 

1)取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO₄水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO₄)0.5ml，混匀，置4℃，30min； 

2)取出后加入0.16mol/L乙二醇水溶液(10ml H₂O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min； 

3)加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h，使之结合； 

4)加入NaBH4溶液(5mg/m1)0.2ml，混匀，置4℃，2h； 

5)在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃，30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02mol/L pH7.4PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜； 

6)次日取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-B9)结合物，以0.02mol/LpH7.4PBS液加至5ml； 

7)效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。 

实施例4微孔板包被 

1)兔抗人sH2a多克隆抗体利用碳酸盐包被液稀释成5ug/ml，100ul/孔包被96孔酶标板，4℃包被过夜； 

2)拍干酶标板，用含0.05％Tween20的PBS溶液洗板2次后，加入含1％BSA的PBST，100ul/孔，37℃封闭酶标板2h； 

3)取出酶标板，PBST洗板2次，置于37℃烘箱烘干2h后4℃干燥真空密封保存。 

实施例5免疫分析检测方法建立 

5.1试验方法 

本实验主要采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，利用兔抗人sH2a多抗包被酶标板，HRP酶标鼠抗人sH2a单抗B9作为检测抗体。 

1)检测抗体的的最佳工作浓度 

①将包被兔抗人sH2a多抗的酶标板取出，室温平衡30min； 

②将sH2a重组蛋白利用PBS稀释至0.5ug/ml，100ul/孔加入96孔板中，37℃温育1h； 

③PBST洗涤，200ul/孔，洗涤3次，每次间隔3min； 

④梯度加入HRP标记的鼠抗人sH2a单抗B9(1∶400，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶5000，1∶8000，1∶10000)，100ul/孔，37℃温育1h； 

⑤PBST洗涤，200ul/孔，洗涤5次，每次间隔3min； 

⑥加入TMB显色液(AB液1∶1混合)，100ul/孔，37℃避光温育15min； 

⑦加入终止液100ul/孔，5min内读取OD450nm值。 

2)洗液的选择 

本实验选取了2种洗液配方进行了比较：PBS和0.05％Tween的PBS。通过实例5中1)所述的实验方法，比较两种洗液的效果(酶标二抗稀释度为1∶5000)。 

表2抗体工作浓度的确定 

表3最佳洗液的确定 

5.2结论 

通过5.1.1)的实验结果(表2)得出，酶标抗体的工作浓度为1∶5000稀释度时，OD450nm值在1.0左右，所以我们确定其最佳工作浓度为1∶5000。 

通过5.1.2)的实验结果(表3)，我们发现，使用含有0.05％Tween20的PBS洗液时，可以将背景值降低，并且不影响显色结果，所以选定其为本实验中的洗液成份。 

实施例6样品sH2a蛋白含量检测 

利用实施例5中确定的ELISA测定条件分析来自肝硬化病人的血清样品及正常人血清样品的sH2a水平。 

1)试验方法 

①将包被兔抗人sH2a多抗的酶标板取出，室温平衡30min； 

②将sH2a重组蛋白利用PBS稀释至2500ng/ml、1250ng/ml、625ng/ml、312ng/ml、156ng/ml、78ng/ml、19.5ng/ml、0ng/ml和血清样本100ul/孔加入96孔板中，37℃温育1h； 

③PBST洗涤，200ul/孔，洗涤3次，每次间隔3min； 

④1∶5000加入工作浓度的HRP标记的鼠抗人sH2a单抗B9，100ul/孔，37℃温育1h； 

⑤PBST洗涤，200ul/孔，洗涤5次，每次间隔3min； 

⑥加入TMB显色液(AB液1∶1混合)，100ul/孔，37℃避光温育15min； 

⑦加入终止液100ul/孔，5min内读取OD450nm值。 

⑧根据标准品绘制的标准曲线计算样本中sH2a蛋白的浓度。 

表4样本sH2a蛋白水平检测 

3)结果讨论 

研究资料证实，正常人血清中sH2a蛋白水平在300ng/ml左右，而肝纤维化病人则显著低于此水平。实验结果表明(图4)，肝纤维化病人血清样本中的sH2a蛋白浓度显著低于正常人，而上述ELISA测定法事实上准确地检测到了该差异。结果说明，开发的ELISA检测方法可以有效地诊断肝纤维化病人，该方法将来可以替代目前比较多使用的侵入性技术、肝活组织检查等。 

Claims (9)

1.sH2a定量检测试剂盒，其中包括：包被有sH2a特异性抗体的微孔板、sH2a蛋白标准品、酶标记抗人sH2a单抗、底物显色剂、洗涤液、反应终止液、样品稀释液。

2.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述sH2a特异性抗体是指识别sH2a至少一个抗原表位的多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的sH2a酶标记抗人sH2a单克隆抗体是指由保藏号B904030801的B9杂交瘤细胞所产生。

4.根据权利要求3-4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的sH2a特异性抗体与酶标记抗人sH2a单克隆抗体识别的抗原表位不同。

5.根据权利要求1、4、5所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的sH2a酶标记抗人sH2a单克隆抗体是辣根过氧化物酶标记的抗体。

6.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的sH2a蛋白标准品是通过基因工程方法获得的重组sH2a蛋白。

7.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的显色剂含过氧化氢或过氧化脲或类似物以及邻苯二胺或四甲基联苯胺。

8.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液为含0.05％-2％Tween20磷酸盐缓冲液。

9.一种检测样品中sH2a含量的方法，包括步骤：

(1)用权利要求1-8任一所述的试剂盒进行检测，向抗sH2a特异性抗体包被的微孔板孔中加入待测样品溶液或标准品，孵育后洗涤拍干，再加入酶标记的抗人sH2a单克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入显色剂、终止液，用酶标仪或化学发光仪测定吸光度值；

(2)分析检测结果。

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