CN104297488A - 一种抗CBir1抗体检测试纸的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗CBir1抗体层析试纸条、制备方法及应用。该试纸条包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1)，检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上。本发明用CBir1抗原蛋白，实现对样本中抗CBir1抗体的高灵敏度、高特异性快速检测，为临床克隆恩病等自体免疫性疾病的辅助诊断提供依据。

Description

一种抗CBir1抗体检测试纸的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测CBir1的免疫层析检测试纸的制备方法及应用。 

背景技术

IBD是北美和欧洲的常见病，近30年来日本IBD发病率亦呈逐步增高趋势，我国虽尚无普通人群的流行病学资料，但近10多年来本病就诊人数呈逐步增加趋势则非常明显。IBD的临床表现复杂多样，不仅有消化道症状，还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便血等非特异性肠炎表现，CD与UC，以及IBD与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊断。 

目前鉴别UC与CD的生物标志物主要集中在自身免疫抗体与抗微生物抗体，CBirl是从一种自发产生结直肠炎的C3H/HeJBir大鼠的血清学发现的细菌鞭毛蛋白。研究证明CBirl参与多种炎症反应，其机制与核因子NF-KB的激活有关。近来研究发现，CBirl与某些非典型克隆恩病的发病有关，是克隆恩病相关抗原。CBirl能分别与来自克隆恩病患者和结直肠炎大鼠的血清蛋白IgG发生反应，而与正常人IgG无反应。这些鞭毛蛋白的序列已被证明含有种族发育结构功能保守的氨基末端和羧基末端，而且还附有一个具预测功能的类似沙门氏菌fliC基因的三维结构，其上带有一个完整的TLR5结合位点。结合对鞭毛蛋白在大鼠和人体上激发的免疫应答有限性的研究，提示CBir1对宿主细菌在肠道内的慢性炎症的诱发和维持起了重要作用。通过对CBir1的血清反应来识别克隆恩病，发现其与复杂的克隆恩病患者的异常亚型有关；通过利用来自结肠炎大鼠的血清以及与来自大鼠盲肠细菌的DNA噬菌体基因库的血清学表达克隆分化，发现CBirl的血清学免疫应答的优势；当把表达CBirl的内源性细菌菌株转移入重度免疫缺陷大鼠体内时，CBirl激发的CD4+Thl细胞株能诱发结肠炎，提示CBirl在大鼠结肠炎中是免疫显性的。而在克隆恩病中，Thl细胞被过度激活，产生大量的Thl型细胞因子(如：TNF-a、IFN一7、IL-12等)，导致过度的炎症和肠道黏膜的损伤。所以，CBirl与肠道炎症，特别是与克隆恩病之间存在一定的相关性。克隆恩病是一种机体直接针对共生肠道菌群产生异常免疫应答的疾病，并且证明了共生肠道鞭毛蛋白是克隆恩病免疫应答相关的特殊抗原靶位点。因此提示CBirl不仅可通过激活TLR5表达而引起炎症，而且还可能在获得性免疫反应中起到一定的作用，从而维持克隆恩病的慢性炎症的特征。 

抗CBirl抗体是在IBD大鼠模型上被发现的引起结直肠炎的第1个细菌抗原抗体，可以导致IBD患者发生病理上的免疫应答。抗CBirl抗体检测的临床意义研究已发现针对CBirl的血清抗体的存在标记克隆恩病的一类亚群。 

免疫层析法(immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等，其中以纳米金应用最为广泛，纳米金也称为胶体金。 

以胶体金作为失踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique，GICT)。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 

表面带活性基团的彩色胶乳微球也可以作为免疫层析的示踪剂，与胶体金技术一样，彩色胶乳标记免疫层析技术也具有操作简便、试剂稳定、快速出结果、可室温保存等优点。彩色胶乳标记是将不同直径范围0.1um-1um彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯类或其他大分子物质共价结合，使这些大分子标记上颜色，当在检测线或质控线上富集停留后形成肉眼可见的彩色条带。 

与现有技术ELISA和化学发光法相比，免疫层析法检测的优点主要包括：(1)使用方便快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在20分钟内完成；(2)成本低，不需要特殊的仪器设备；(3)应用范围广，可适应多种检测条件；(4)可以进行多项检测，若阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；(5)标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年年以上，无信号衰减现象；(6)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。 

在IBD诊断方面，基于抗CBir1抗体检测的试剂已经用于商业用途的只有美国Promethues实验室的ELISA试剂，以及本公司开发的化学发光试剂，抗CBir1的免疫层析试纸在国内外市场上仍没有问世。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用到抗CBir1 抗体的检测中，通过把CBir1抗原蛋白包被在结合垫或分析膜的检测带上，实现对样品中抗CBir1抗体的高特异、高灵敏度、高准确性的检测，快速筛查抗CBir1抗体阳性标本，为临床UC等自体免疫性疾病提供快速的辅助诊断。 

本发明的目的之一在于提供一种快速、准确的抗CBir1抗体的免疫层析检测试纸条及制备方法，目的之二是提供一种基于免疫层析技术的抗CBir1抗体检测方法。 

作为本发明第一个方面的一种抗CBir1抗体的免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和底板，分析膜上设置检测带和质控带，所述底板的上部贴合有分析膜，分析膜上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫，结合垫上部的一端贴合有样品垫。 

所述的结合垫结合胶体金标记蛋白或彩色胶乳标记蛋白；所述的结合垫为1层(图1)或 

2层(图2)，其中2层时错落与分析膜搭接。 

所述抗CBir1抗体的免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1.CBir1抗原蛋白的制备 

步骤2.结合垫(2)制备 

(1)纳米金标记物的制备：用20～40nm粒径的纳米金溶液标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。 

(2)彩色胶乳标记物的制备：用带活性氨基或羧基基团的彩色胶乳标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。 

(3)结合垫(2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，先用含BSA和糖的缓冲液预处理并烘干，将步骤(1)制备的纳米金标记物或胶乳标记物，用喷涂仪喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。 

步骤3.分析膜(3)制备 

(1)检测带T线(4)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白，如结合垫上的结合蛋白含CBir1，检测带T线的包被蛋白是抗人IgG。如果结合垫上含有抗人IgG，检测带T线包被蛋白为CBir1。 

(2)质控带C线(5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如结合垫标记蛋白是单一的CBir1，质控带C线的包被蛋白为抗CBir1的抗体；如果结合垫标记蛋白是单一的抗人IgG抗体，质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体；或者其他结合垫标记蛋白形成免疫复合物的蛋白。 

步骤4.样品垫制备 

将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用，或者直接使用。 

步骤5.试纸条组装 

把步骤1～4所制作完成的材料，按图1或图2搭接，根据底板的规格切割成一定的长度和宽度，安装在底板和卡壳里。优选地，试纸条长度为6.5cm，宽度为3mm或4mm。 

所述的CBir1抗原蛋白是把全长CBir1基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表达载体里，表达纯化获得。 

所述的CBir1抗原蛋白是用多肽合成仪合成含有CBir1重要抗原表位的CBir1多肽，并偶联到载体蛋白上而获得。 

所述的抗人IgG抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。 

所述的抗CBir1的抗体是以CBir1为免疫源，鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。 

所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体，比如该抗人IgG抗体是鼠抗人IgG，它的抗体是羊抗鼠IgG的抗体或其他非鼠源的鼠IgG抗体。 

在本发明的另一方面，提供一种抗CBir1抗体检测方法，用本发明第一方面方法及步骤所制备的抗CBir1抗体免疫层析试纸条，对待检样品进行检测，具体步骤： 

(1)样本处理：取血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释0～100倍； 

(2)把上述处理过的样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5～20分钟，观察T线和C线； 

(3)结果判读：T线和C线均显现，结果为阳性；T线不显现，C线显现，结果为阴性；T线和C线均不显现，提示试纸失效。 

本发明的检测原理： 

选用金标/胶乳等标记CBir1抗原蛋白或其他能与待检样品中目的物结合的蛋白，喷涂在结合垫上，制成结合垫；在检测带上包被能与标记蛋白-目的物蛋白复合物发生免疫反应的蛋白，当把待检样本加样到样品垫上后，样本中的CBir1抗体与结合垫上的标记蛋白形成免疫复合物，由于毛细管效应，该复合物向吸水垫方向泳动，此复合物与包被于检测带T线上的抗原蛋白发生特异性免疫结合反应，形成金标/胶乳蛋白-抗CBir1抗体-CBir1抗原蛋白三联体复合物而被截留在检测线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带或胶乳颜色；由于毛细效应继续泳动向前，金标/胶乳兔IgG与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带或胶乳颜色，多余的未结合的物质继续层析到吸 水垫上，因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果；若血清样品中不含有抗CBir1抗体，标记蛋白到达检测线时，不与包被在检测线上的相应蛋白发生免疫反应，因此在检测线处没有出现显色带，而金标/胶乳兔IgG继续泳动向前与包被于质控线处的相应包被蛋白发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带或胶乳颜色，因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。 

本发明首次将免疫层析技术应用于抗CBir1抗体检测，实现了高特异性、高灵敏度的检测性能。与现有文献报道的ELISA和化学发光试剂盒相比，本发明的优点主要包括：检测时间短(5～20min)；不需要任何特殊仪器，可实现床边检测和门诊即时检测；操作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低；对温度无特殊要求，无需冷冻，储存运输方便，室温可保存24个月。 

附图说明

图1本发明的侧面结构示意图1。 

图2本发明的侧面结构示意图2。 

图3本发明检测带为1条时阳性和阴性结果示意图3。 

其中3a是条带示意图；3b为阳性结果；3c为阴性结果；3d和3e表示试纸条失效。 

具体实施方式

本发明所述的CBir1抗体检测免疫层析试纸，如图1所示，该试纸是在底板(7)上由一侧向另一侧顺次相互搭接地粘贴分析膜(3)、结合垫(2)、样品垫(1)、吸水垫(6)。 

结合垫(2)上喷涂有金标/胶乳标记蛋白，分析膜(3)上设置检测带(4)和质控带(5)，根据结合垫上标记蛋白的不同，选用相应的检测带包被蛋白和质控带包被蛋白。优选地，在结合垫上喷涂的标记蛋白为CBir1抗原蛋白和鼠IgG，则检测带上的包被蛋白为抗人IgG抗体，质控带上的包被蛋白为抗鼠IgG。另一优选，在结合垫上喷涂的标记蛋白为抗人IgG抗体，则检测带上的包被蛋白为CBir1抗原蛋白。 

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。 

实施例1.CBir1抗原蛋白制备 

抗原蛋白制备方法一：重组蛋白 

1)试剂 

大肠杆菌宿主菌DH5α、BL21(DE3)，克隆载体pCR2.1T-vector，表达质粒pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LA Taq以及限制性内切酶BamH I、Hind III和EcoR I、BamH I，DL2000DNA Marker、T4DNA连接酶，低分子量标准蛋白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等 

2)仪器 

普通摇床SCS-24；隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge 5810R、台式离心机MiniSpin；高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统；PCR仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。 

3)实验方法 

a.载体构建： 

设计引物GGA ATT CCA TAT GGG CAG TTG CAA TTT TCT AGAT和CGC GGA TCC CCC AAG TAG CTG GGA TTA CAGA从模板DNA中PCR扩增出CBir1片段，胶回收试剂盒回收片段后连接到pCR2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中，酶切位点为EcoR I、BamH I，同时载体上有6×HIS标签，便于后续的蛋白纯化。 

b.表达 

将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选出来的阳性菌液按1∶1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中，每个菌接种两管，一管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作对照。37℃过夜培养至OD600值约为0.4-0.6时，诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为1mmol/L，非诱导对照不加，最终选择表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-PAGE方法对表达产物进行鉴定。 

c.纯化 

将表达的产物用HIS蛋白纯化柱纯化蛋白，并透析脱盐，经测定纯化后的蛋白浓度为509mg/L。 

CBir1抗原蛋白制备方法2： 

筛选CBir1重要抗原表位多肽2-6个，用多肽合成仪进行从从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成，然后与载体蛋白偶联，使分子量增大，便于结合在结合垫和分析膜上。常用的载体蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。 

实施例2抗体制备 

结合垫及检测带包被抗体抗人IgG单克隆抗体和多克隆抗体，以及用于质控带和结合垫其他动物来源的单克隆抗体和多克隆抗体，可通过免疫动物获得。 

1、单克隆抗体制备的具体操作方法为： 

通过将0.05mg～5mg免疫制剂(分别针对山羊、小鼠、兔子、马和豚鼠)与1倍体积的弗氏完全佐剂混合得到注射溶液，将该注射溶液在动物皮内多部位注射； 

一个月后将弗氏完全佐剂混合液经多部位动物皮下注射而加强免疫。7～14天后将动物放血，测定抗血清滴度。 

对动物加强免疫直至滴度达到平台期。通过从被免疫的动物回收脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选后即可得到能稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞。 

体外培养的杂交瘤细胞，接种小鼠或大鼠腹腔，取腹水纯化获得单克隆抗体；或者从培养上清液中纯化获得单克隆抗体。 

2、多克隆抗体制备： 

同单克隆抗体步骤1)和2)，在获得抗血清后，纯化抗血清获得多克隆抗体。 

3、葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白制备 

根据葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白的基因序列，可通过大肠杆菌原核表达克隆化基因来制备，具体操作方法可参见(分子克隆实验指南)，或实施例1CBir1的步骤。 

实施例3金标试纸各组分制备 

1、胶体金液制备 

将0.01％(w/v)的HAuCl₄溶液加热至沸腾，迅速加入每100mL HAuCl₄溶液加入适量的还原剂溶液，颜色从蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。再用超滤或微孔滤膜(0.45μM)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物杂质时弃用。 

其中所使用的还原剂可以为柠檬酸三钠、鞣酸-柠檬酸三钠、白磷，优选使用柠檬酸三钠，更优选地使用1％(w/v)柠檬酸三钠。 

其中所用玻璃容器应绝对清洁，用前需经酸洗。其水应为去离子超纯水，电阻率达18.2MΩ。 

胶体金溶液制备过程中，各溶液的配制方法如下：HAuCl₄的配制：用超纯水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期三个月；1000mL 1％HAuCl₄溶液配方：10g HAuCl₄、超 纯水定容至1000mL；1％柠檬酸三钠(Sodium Citrate)的配制：用超纯水溶解Sodium Citrate，配成1％溶液，0.22μM膜滤过，现配现用。 

2、金标蛋白制备 

本发明待标记金标蛋白包括但不限于鼠抗人IgG、CBir1抗原蛋白、鼠IgG、羊IgA、SPA、羊抗人IgG、马抗人IgG、兔IgM、鼠IgA。 

用0.1M碳酸钠调节胶体金pH 7.0～8.5，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5～25μG待标记蛋白，混匀，静置10～30min，然后加入BSA至终浓度0.5～1％，混匀，静置5～10min，3000rpm离心5min，去沉淀，将上层溶液转至新管，9000rpm离心30min，去上清，加入重悬液至原量，将溶液移至新管，9000rpm再次离心30min，加入用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。 

3、分析膜制备 

分析膜选择：分析膜的材质可选硝酸纤维素膜(NC)或者醋酸纤维素膜，商品化的硝酸纤维素膜包括S&SAE99、whatman 8μm、millipore M135、sartorius CN140等。使用哪种规格的具体NC膜或醋酸纤维素膜不是本发明的关键，但是在每次测定中，上述几种NC膜可以作为优选。不同厂家使用的含不同表面活性剂的不同缓冲液处理的膜，与所用检测线抗体溶液亲和力有不同程度的差距，也会很大程度造成线条不均匀，拖带或是弥散的现象，因此运用组装试纸来选择优选的NC膜或醋酸纤维素膜。 

分析膜制备：用包被缓冲液稀释检测带包被蛋白至0.5～1.5mG/mL浓度，用划膜喷金仪HM3035，距离结合垫1cm处，以0.5～1.5μL/cm喷涂于膜上，构成检测带(4)，距离检测带约5mm处，以0.5～1.5μL/cm用划膜喷金仪仪器喷涂于同一张膜上，构成质控带(5)，质控带同时距离吸水垫约1cm。分析膜37℃烘干，封装备用。 

所使用的包被缓冲液可以是硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、Tris-HCl或Tris-磷酸盐等，缓冲液的作用是提供一定pH和离子强度使蛋白牢固包被于NC膜，缓冲液pH值一般约为6～9.5范围内，优选为6.5～7.5的中性缓冲范围内，且最优选缓冲液的pH值为7.0～7.4范围内。 

A.分析膜1 

检测带T线：用pH为7.1的10mM PB缓冲溶液配制豚鼠抗人IgG，浓度为0.3mg/mL，喷涂在硝酸纤维膜上，涂布量为1μL/cm。 

质控带C线：用pH为7.2的10mM PB缓冲溶液配制Protein G和鼠抗羊IgA，浓度分别为0.6mG/mL和0.8mG/mL，1∶1混合，喷涂在硝酸纤维膜上，涂布量为1μL/cm。 

B.分析膜2 

检测带T线：用pH为7.1的10mM PB缓冲溶液配制CBir1抗原蛋白，浓度为0.6mG/mL，喷 涂在醋酸纤维膜上，涂布量为1.0μL/cm。 

质控带C线：用pH为7.3的10mM PB缓冲溶液配制兔抗羊IgG，浓度为0.3mG/mL，喷涂在醋酸纤维膜上，涂布量为1.0μL/cm。 

C.分析膜3 

检测带T线：将兔抗人IgG与pH为7.2的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为0.4mG/mL的混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为1μL/cm。 

质控带C线：将羊抗鼠IgG与pH为7.5的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为0.2mG/mL混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为1μL/cm。 

D.分析膜4 

检测带T线：将羊抗人IgG与pH为7.3的10mM碳酸盐缓冲溶液混合配制成为浓度为0.2mG/mL的混合溶液，喷在醋酸纤维膜上，涂布量为1μL/cm。 

质控带C线：用pH为7.5的10mM碳酸盐缓冲溶液配制鼠抗CBir1单克隆抗体，浓度为0.3mG/mL，喷涂在醋酸纤维膜上，涂布量为1μL/cm。 

4、结合垫的制备 

结合垫的处理：结合垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的结合垫处理液浸泡结合垫，在37℃下1h烘干后，将抗体或者蛋白以4uL/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上，37℃干燥1h后得结合垫，结合垫置于2～8℃的环境下备用；结合垫处理液的组成为：pH为7.0～9.0的10mM PB缓冲溶液，含1％BSA，10～20％蔗糖，0.1％Tween-20。结合垫也可不做预处理，直接使用。 

A.结合垫1玻璃纤维膜，单层，CBir1和羊IgA等比例混合。 

B.结合垫2玻璃纤维膜，单层，羊抗人IgG。 

C.结合垫3玻璃纤维膜，双层，2a层为CBir1抗原蛋白，2b层为鼠IgG。 

D.结合垫4聚酯膜，单层，CBir1抗原蛋白。 

5、样品垫的制备 

样品垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，在37℃下1h烘干，样品垫缓冲液的组成为：pH为7.0～9.0的10Mm PB缓冲溶液，含1％BSA，10％蔗糖，0.1％Tween-20。样品垫也可不做预处理直接使用。 

实施例4胶体金标记抗CBir1抗体检测试纸1～4制备 

用裁切机将实施例3制备的并干燥的样品垫、结合垫、分析膜、吸水纸分别剪切1.7cm、0.8cm、2.5cm和1.5cm宽的窄条，按图1或图2方式搭接成大板，用切条机将大板切成单人份， 每人份宽度根据底板卡壳的不同而异，本发明优选3mm和4mm宽度。将单人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸的样品垫，结果显示窗对应检测区和质控区，组装时温度控制在25～37℃，湿度20～30％。 

金标试纸条1～4的各组分如下表： 

实施例5.彩色胶乳标记蛋白制备 

1、彩色胶乳标记液的制备 

胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒，调节胶乳微球体浓度为1.0×10¹²/mL，15000rpm离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水溶解，并用200W超声波分散30秒；先加入50μL的50mg/mL EDC，振荡混匀，再加入50μL的50mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺，振荡混匀，室温下平衡30分钟后在15000rpm离心10分钟，沉淀用50mM柠檬酸缓冲液溶解，静置于4℃冰箱。 

2、彩色胶乳标记蛋白的制备 

本发明待标记蛋白包括但不限于：马抗人IgG、SPA、CBir1抗原蛋白、鼠IgA。 

将活化后的胶乳于200W超声波处理30秒，按照100～150μG蛋白/100μL彩色胶乳的比例加入待标记的抗体或者蛋白，混匀室温搅拌反应1～2小时，离心洗涤，每次15000rpm下离心10分钟，共洗涤3次，沉淀用PBS-TBN溶解并100W超声波处理30秒，然后用PBS-TBN稀释至离心前体积，4℃保存备用。 

3、分析膜制备 

分析膜材质、包被缓冲液配方及包被方法同实施例3，本实施例优选以下4种分析膜： 

A.分析膜1醋酸纤维膜 

T线：CBir1抗原蛋白，包被缓冲液为pH7.010mM PB，蛋白浓度0.8mG/μL，涂布量1μL/cm。 

C线：用pH值7.2的10mM PB，稀释兔抗马IgG及Protein G，浓度分别为0.6mG/μL及1.0mG/μL，1∶1混匀涂布，涂布量为1μL/cm。 

B.分析膜2硝酸纤维膜 

T线：骆驼抗人IgG，包被缓冲液为pH7.8的10mM PB，蛋白浓度0.8mG/μL，涂布量1μL/cm。 

C线：用pH值7.6的10mM PB，稀释羊抗鼠IgA，浓度0.5mG/μL，涂布量为1μL/cm。 

C.分析膜3硝酸纤维膜 

T线：豚鼠抗人IgG，包被缓冲液为pH7.210mM PB，蛋白浓度0.4mG/μL，涂布量1μL/cm。 

C线：用pH值7.2的10mM PB，稀释鼠抗兔IgM，浓度0.4mG/μL，涂布量为0.8μL/cm。 

D.分析膜4醋酸纤维膜 

T线：CBir1抗原蛋白(多肽偶联BSA)，包被缓冲液为pH6.8的10mM PB，蛋白浓度0.5mG/μL，涂布量1μL/cm。 

C线：用pH值7.6的10mM PB，稀释鼠抗兔IgG，浓度0.3mG/μL，涂布量为1μL/cm。 

4、结合垫制备 

结合垫预处理：用结合垫缓冲液将聚脂膜或玻璃纤维膜浸泡30分钟，37℃烘干，把彩色胶乳标记的蛋白用划膜喷金仪，以2～6μL/cm的用量喷涂在预处理的膜上，37℃干燥，置2～8℃备用。结合垫缓冲液配方同实施例3，本实施例优选以下4种结合垫： 

A.结合垫1：聚酯膜，1层，红色胶乳标记的马抗人IgG与蓝色胶乳标记的SPA，1∶1混合，4μL/cm喷涂。 

B.结合垫2：玻璃纤维膜，1层，紫色胶乳标记CBir1(偶联KLH)与红色胶乳标记的鼠IgA按1∶1混合，3μL/cm喷涂。 

C.结合垫3：聚酯膜，2层，2a层为红色胶乳标记的CBir1重组蛋白，2b层为蓝色胶乳标记的兔IgM，分别3μL/cm和5μL/cm喷涂。 

D.结合垫4：玻璃纤维膜，2层，2a层为红色胶乳标记的鼠抗人IgG，2b层为蓝色胶乳标记的兔IgG。 

5、样品垫的制备 

样品垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，在37℃下1h烘干，样品垫缓冲液的组成为：pH为7.0～9.0的10Mm PB缓冲溶液，含1％BSA，10～20％蔗糖，0.1％Tween-20。样品垫也可不做预处理直接使用。 

实施例6彩色胶乳抗CBir1抗体检测试纸1～4组装 

用裁切机将实施例3制备的并干燥的样品垫、结合垫、分析膜、吸水纸分别剪切1.7cm、0.8cm、2.5cm和1.5cm宽的窄条，按图1或图2方式搭接成大板，用切条机将大板切成单人份，每人份宽度根据底板卡壳的不同而异，本实施例优选3mm和4mm宽度。将单人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸的样品垫，结果显示窗对应检测区和质控区，组装时温度控制在25～37℃，湿度20～30％。 

彩色胶乳试纸条1～4的各组分如下表： 

实施例7样本处理 

血清样本：取全血1～5mL于血清采集管中，静置30min～2h，3000～5000g离心5～10min，取上清即得。根据试纸条的检测精度，把样本用加样缓冲液稀释0-100倍，取50-100μL滴加到试纸条的加样孔中，静置5～20分钟后按图3提示观察结果。 

血浆样本：取全血1～5mL于枸橼酸钠或肝素钠抗凝管中混匀，1000～3000g离心5～10min，取上清即得到血浆样本。根据试纸条的检测精度，把样本用加样缓冲液稀释0-100倍，取50-100μL滴加到试纸条的加样孔中，静置5～20分钟后，按图3提示观察结果。 

全血标本：取指尖或耳垂新鲜血约50μL，滴加到加样孔中，马上用50μL加样缓冲液滴加到加样孔中稀释，静置5～20分钟后，按图3提示观察结果。 

实施例8试纸条性能评估 

本发明试剂条的性能包括稳定性、批内不精确度和批间不精确度评估。 

1、37℃加速老化试验 

将试纸条放置37℃，每日取出用质控品和阴阳性参考品各10份的阴阳性符合率的批内精 密度来判断试纸的稳定性。4个月后质控品以及各个阴阳性参考品的阴阳性符合率均为100％。推测试纸条的保质期在18个月以上。 

2、批内不精确度 

取各一个批次的金标试纸条和胶乳试纸条，分别用高、中、低三种阳性血清和阴性血清各一份，每份血清分别用金标试纸条和胶乳试纸条重复检测10次，所有阳性血清的检测结果均为阳性，所有阴性血清的检测结果均为阴性，提示本发明的胶体金试纸条和胶乳试纸条批内不精确度符合标准，结果见下表： 

3、批间不精确度 

试纸条1和试纸条5各三个批次，用高、中、低三种阳性血清和阴性血清检测，每份血清检测10条，10分钟后观察结果并填入下表。试纸条1和试纸条8各三个不同批次的检测结果一致，说明批间不精确度符合标本，结果见下表： 

实施例9试纸条检测及临床性能评估 

用实施例4制备的金标试纸条和实施例6制备胶乳试纸条检测确诊的CD患者血清200例，试纸条检测时样本稀释10～50倍，与苏州和锐的IgG-CBir1的ELISA试剂盒作平行对照，ELISA检测时稀释50～100倍，计算阳性符合率和阴性符合率，以及总符合率。检测结果下表： 

金标试纸条1的阳性符合率＝134/139＝96.4％，阴性符合率＝54/61＝88.54％，总符合率＝(134+54)/200＝94.0％。 

彩色胶乳试纸条3的阳性符合率＝128/132＝96.97％，阴性符合率＝66/68＝97.06％，总符合率＝(128+66)/200＝97.0％。 

根据以上结果，金标试剂条和彩色胶乳试剂条的临床性能符合预期，与现有产品的检测性能相当。以上实施例是对本发明的描述而非限定。 

Claims (10)

1.一种抗CBir1抗体免疫层析试纸条，包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，所述结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1)，所述检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上，其特征在于，CBir1抗原蛋白结合在结合垫(2)上或包被在检测带T线(4)上。

2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的结合垫(2)包被胶体金标记物或胶乳(乳胶)标记物。

3.根据权利要求1所述的CBir1抗体检测试纸条，其特征在于，所述的结合垫为1层(图1)或2层与分析膜错落搭接(图2)。

4.一种抗CBir1抗体免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤1.CBir1抗原蛋白的制备

步骤2.结合垫(2)制备

(1)胶体金标记物的制备：用纳米金溶液标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与检测带T线或质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。

(2)胶乳标记物的制备：用带活性基团的胶乳标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与检测带T线或质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。

(3)结合垫(2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，将步骤(1)制备的胶体金标记物或胶乳标记物，喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。

步骤3.分析膜(3)制备

A.检测带T线(4)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白，如结合垫上的结合蛋白含CBir1，检测带T线的包被蛋白是抗人IgG抗体。如果结合垫上含有抗人IgG抗体，检测带T线包被蛋白为CBir1抗原蛋白。

B.质控带C线(5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如结合垫标记蛋白是单一的CBir1，质控带C线的包被蛋白为抗CBir1的抗体；如果结合垫标记蛋白是单一的抗人IgG抗体，质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体；结合垫标记蛋白有2层时，质控带C线的包被蛋白是能与结合垫对应层结合蛋白形成免疫复合物的蛋白。

步骤4.样品垫制备

将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用，或者直接使用。

步骤5.试纸条组装

把步骤1～4所制作完成的材料，按图1或图2搭接，根据底板的规格切割成一定的长度和宽度，安装在底板和卡壳里。

5.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的CBir1抗原蛋白是把全长CBir1基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表达载体里，表达纯化获得。

6.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的CBir1抗原蛋白是用多肽合成仪合成含有CBir1重要抗原表位的CBir1多肽，并偶联到载体蛋白上而获得。牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。

7.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗人IgG抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。

8.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗CBir1的抗体是以CBir1为免疫源产生的抗体。

9.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体。

10.一种抗CBir1抗体的检测方法，其特征在于，用权利要求1～9所述的免疫层析试纸条，对待检样品进行检测，具体步骤包括：

(1)样本处理：取血清、血浆或全血样本；

(2)把样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5～30分钟，观察T线和C线；

(3)结果判读：T线和C线均显现，结果为阳性；T线不显现，C线显现，结果为阴性；其他情况提示试纸失效。