CN104198698A - 一种抗cuzd1抗体层析试纸条及其用途 - Google Patents
一种抗cuzd1抗体层析试纸条及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104198698A CN104198698A CN201410414639.4A CN201410414639A CN104198698A CN 104198698 A CN104198698 A CN 104198698A CN 201410414639 A CN201410414639 A CN 201410414639A CN 104198698 A CN104198698 A CN 104198698A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pad
- cuzd1
- line
- protein
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Abstract
本发明公开了一种抗CUZD1抗体层析试纸条、制备方法及应用。该试纸条包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5),所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3),所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6),结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1),检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上。本发明采用间接免疫检测法,用CUZD1抗原蛋白,实现对样本中抗CUZD1抗体的高灵敏度、高特异性快速检测,为临床炎症性肠病等自体免疫性疾病的辅助诊断提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言,本发明涉及一种检测人胰腺腺泡CUZD1的自身抗体的免疫层析检测试纸。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎性疾病,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn′s disease,CD)。克罗恩病于1932年由Crohn、Ginzterg和Oppenheime最早描述,故得此名。1973年,世界卫生组织医学科学国际组织委员会将本病定名为Crohn病。其特点为病因未明,多见于青年人,表现为肉芽肿性炎症病变,合并纤维化与溃疡。可侵及全胃肠道的任何部位,包括口腔、肛门,病变呈节段性或跳跃性分布,并可侵及肠道以外,特别是皮肤。临床表现因病变部位、范围及程度不同而多样化,病程缓慢,易复发。
IBD是北美和欧洲的常见病,近30年来日本IBD发病率亦呈逐步增高趋势,我国虽尚无普通人群的流行病学资料,但近10多年来本病就诊人数呈逐步增加趋势则非常明显。IBD的临床表现复杂多样,不仅有消化道症状,还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便血等非特异性肠炎表现,CD与UC、以及IBD与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊断,特别在缺乏组织学证据时,需有更多相对特异性的标志物为诊断提供帮助。研究发现,多种非侵入性的生物活性标志物对IBD的诊断及炎症活动性的评价具有重要意义。
CUB带状疮疹透明区样域蛋白1(The CUB,and zona pellucida-like domains-containing protein 1,CUZD1)是近期发现的存在于胰腺中的一种自身免疫性抗原,它的自体免疫性抗体以网状颗粒形式存在于IBD,尤其是CD患者体内。据临床研究分析,高于30%的CD患者体内能够用免疫荧光技术检测出CUZD1抗体的存在。大量研究反映出CUZD1自体免疫抗体与IBD尤其是CD具有高度的相关性。
目前CUZD1抗体的检测方法多为酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测技术。ELISA法检测可用于高通量标本测定,灵敏度也比较高,目前也被广泛认可,但其操作比较繁琐,需要多次加样洗涤及孵育步骤,完成整个实验过程需要3小时左右,需要酶标仪,对于实验人员专业技术要求比较高,同时受到各种环境条件的影响,对实验带来诸多不便。
间接免疫荧光检测技术是把抗原细胞固定在载玻片上,荧光染色用荧光显微镜进行观察,该技术具有高特异性,但由于显微镜观察需要主观判断,对检验人员的要求高,并且依赖于 荧光显微镜,使用不便。
免疫层析法(Immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术,其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,形成肉眼可见的检测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等,其中以纳米金应用最为广泛,纳米金也称为胶体金。
以胶体金作为失踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique,GICT)。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
表面带活性基团的彩色胶乳微球也可以作为免疫层析的示踪剂,与胶体金技术一样,彩色胶乳标记免疫层析技术也具有操作简便、试剂稳定、快速出结果、可室温保存等优点。彩色胶乳标记是将不同直径范围0.1μM~1μM彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯类或其他大分子物质共价结合,使这些大分子标记上颜色,当在检测线或质控线上富集停留后形成肉眼可见的彩色条带。
与现有技术ELISA和IFA相比,免疫层析法检测的优点主要包括:(1)使用方便快速,便于基层使用和现场使用,所有反应能在20分钟内完成;(2)成本低,不需要特殊的仪器设备;(3)应用范围广,可适应多种检测条件;(4)可以进行多项检测,若阳性样本比较难获得,多项检测可以节省样品,降低成本;(5)标记物稳定,标记样品在4℃贮存两年年以上,无信号衰减现象;(6)胶体金本身为红色,不需要加入发色试剂,省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤,对人体无毒害。
在自体免疫性疾病诊断方面,已出现较多的免疫层析试纸,但基于抗CUZD1抗体检测的免疫层析试纸在国内外市场上仍没有问世。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足,将免疫层析法应用到抗CUZD1 抗体的检测中,采用间接免疫法来实现对样品中的抗CUZD1抗体进行检测,通过把CUZD1抗原蛋白包被在结合垫或分析膜的检测带上,实现对样品中抗CUZD1抗体的高特异、高灵敏度、高准确性的检测,快速筛查抗CUZD1抗体阳性标本,为临床炎症性肠病等自体免疫性疾病提供快速的辅助诊断。
本发明的目的之一在于提供一种快速、准确的抗CUZD1抗体的免疫层析检测试纸条及制备方法,目的之二是提供一种基于免疫层析技术的抗CUZD1抗体检测方法。
作为本发明第一个方面的一种抗CUZD1抗体的免疫层析检测试纸条,包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和底板,分析膜上设置检测带和质控带,所述底板的上部贴合有分析膜,分析膜上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫,结合垫上部的一端贴合有样品垫。
所述的结合垫(2)包被胶体金标记物或彩色胶乳标记物。
所述的结合垫为1层(图1)或2层(图2),其中2层时错落与分析膜搭接。
所述抗CUZD1抗体的免疫层析检测试纸条的制备方法,包括以下步骤:
步骤1.CUZD1抗原蛋白的制备
步骤2.结合垫(2)制备
(1)纳米金标记物的制备:用20~40nm粒径的纳米金溶液标记CUZD1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G),以及其他与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。
(2)彩色胶乳标记物的制备:用带活性氨基或羧基基团的彩色胶乳标记CUZD1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G),以及其他与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。
(3)结合垫(2)制备:玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫,先用含BSA和糖的缓冲液预处理并烘干,将步骤(1)制备的纳米金标记物或胶乳标记物,用喷涂仪喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上,干燥备用。
步骤3.分析膜(3)制备
(1)检测带T线(4)制备:根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白,如结合垫上的结合蛋白含CUZD1,检测带T线的包被蛋白是抗人IgG。如果结合垫上含有抗人IgG,检测带T线包被蛋白为CUZD1。
(2)质控带C线(5)制备:根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白,如结合垫标记蛋白是单一的CUZD1,质控带C线的包被蛋白为抗CUZD1的抗体;如果结合垫标记蛋白是单一的抗人IgG抗体,质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体;或者其他结合垫标记蛋白形成免疫复合物的蛋白。
步骤4.样品垫制备
将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用,或者直接使用。
步骤5.试纸条组装
把步骤1~4所制作完成的材料,按图1或图2搭接,根据底板的规格切割成一定的长度和宽度,安装在底板和卡壳里。优选地,试纸条长度为6.5cm,宽度为3mm或4mm。
所述的CUZD1抗原蛋白是把全长CUZD1基因或者含有重要抗原表位的基因序列,克隆到原核或真核表达载体里,表达纯化获得。
所述的CUZD1抗原蛋白是用多肽合成仪合成含有CUZD1重要抗原表位的CUZD1多肽,并偶联到载体蛋白上而获得。
所述的抗人IgG抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
所述的抗CUZD1的抗体是以CUZD1为免疫源,鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体,比如该抗人IgG抗体是鼠抗人IgG,它的抗体是羊抗鼠IgG的抗体或其他非鼠源的鼠IgG抗体。
在本发明的另一方面,提供一种抗CUZD1抗体检测方法,用本发明第一方面方法及步骤所制备的抗CUZD1抗体免疫层析试纸条,对待检样品进行检测,具体步骤:
(1)样本处理:取血清、血浆或全血样本,用加样缓冲液稀释0~100倍;
(2)把上述处理过的样品滴加到试纸条的样品垫上,静置5~20分钟,观察T线和C线;
(3)结果判读:T线和C线均显现,结果为阳性;T线不显现,C线显现,结果为阴性;T线和C线均不显现,提示试纸失效。
本发明的检测原理:
选用金标/胶乳等标记CUZD1抗原蛋白或其他能与待检样品中目的物结合的蛋白,喷涂在结合垫上,制成结合垫;在检测带上包被能与标记蛋白-目的物蛋白复合物发生免疫反应的蛋白,当把待检样本加样到样品垫上后,样本中的CUZD1抗体与结合垫上的标记蛋白形成免疫复合物,由于毛细管效应,该复合物向吸水垫方向泳动,此复合物与包被于检测带T线上的抗原蛋白发生特异性免疫结合反应,形成金标/胶乳蛋白-抗CUZD1抗体-CUZD1抗原蛋白三联体复合物而被截留在检测线上,逐渐富集形成较深的紫红色条带或胶乳颜色;由于毛细效应继续泳动向前,金标/胶乳兔IgG与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的免疫反 应被截留,逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带或胶乳颜色,多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上,因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果;若血清样品中不含有抗CUZD1抗体,标记蛋白到达检测线时,不与包被在检测线上的相应蛋白发生免疫反应,因此在检测线处没有出现显色带,而金标/胶乳兔IgG继续泳动向前与包被于质控线处的相应包被蛋白发生特异的免疫反应而被截留,逐渐富集在质控线上形成紫红色条带或胶乳颜色,因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。
本发明首次将免疫层析技术应用于抗CUZD1抗体检测,实现了高特异性、高灵敏度的检测性能。与现有文献报道的ELISA和化学发光试剂盒相比,本发明的优点主要包括:检测时间短(5~20min);不需要任何特殊仪器,可实现床边检测和门诊即时检测;操作简便,只需一步反应,操作人员无需培训,检测成本低;对温度无特殊要求,无需冷冻,储存运输方便,室温可保存24个月。
附图说明
图1本发明的侧面结构示意图1。
图2本发明的侧面结构示意图2。
图3本发明检测带为1条时阳性和阴性结果示意图3。
其中3a是条带示意图;3b为阳性结果;3c为阴性结果;3d和3e表示试纸条失效。
具体实施方式
本发明所述的CUZD1抗体检测免疫层析试纸,如图1所示,该试纸是在底板(7)上由一侧向另一侧顺次相互搭接地粘贴分析膜(3)、结合垫(2)、样品垫(1)、吸水垫(6)。
结合垫(2)上喷涂有金标/胶乳标记蛋白,分析膜(3)上设置检测带(4)和质控带(5),根据结合垫上标记蛋白的不同,选用相应的检测带包被蛋白和质控带包被蛋白。优选地,在结合垫上喷涂的标记蛋白为CUZD1抗原蛋白和鼠IgG,则检测带上的包被蛋白为抗人IgG抗体,质控带上的包被蛋白为抗鼠IgG。另一优选,在结合垫上喷涂的标记蛋白为抗人IgG抗体,则检测带上的包被蛋白为CUZD1抗原蛋白。
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。
实施例1.CUZD1抗原蛋白制备
1)试剂
大肠杆菌宿主菌DH5α、BL21(DE3),克隆载体pCR2.1T-vector,表达质粒pET28a(+),DNA聚合酶rTaq,T4 DNA连接酶,DNA聚合酶rTaq、LA Taq以及限制性内切酶BamH I、Hind III和EcoR I、BamH I,DL2000 DNA Marker、T4 DNA连接酶,低分子量标准蛋白, DNA胶回收试剂盒,IPTG等
2)仪器
普通摇床SCS-24;隔水式恒温电热培养箱;Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge 5810R、台式离心机MiniSpin;高速冷冻离心机;蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统;PCR仪;超声裂解仪;恒温金属浴;HIS蛋白纯化柱等。
3)实验方法
a.载体构建:
设计引物CGC CAT ATG ATG GAG CTT GTA AGA AGG CTC和CGC GGA TCC TTA ATA GTT CTG CAG CTT CTGG从模板DNA中PCR扩增出CUZD1片段,胶回收试剂盒回收片段后连接到pCR2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中,酶切位点为EcoR I、BamH I,同时载体上有6×HIS标签,便于后续的蛋白纯化。
b.表达
将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选出来的阳性菌液按1∶1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中,每个菌接种两管,一管用于诱导,另一管用于非诱导对照,同时要接种一管空质粒菌作对照。37℃过夜培养至OD600值约为0.4-0.6时,诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为1mmol/L,非诱导对照不加,最终选择表达能力高的两个菌,用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-PAGE方法对表达产物进行鉴定。
c.纯化
将表达的产物用HIS蛋白纯化柱纯化蛋白,并透析脱盐,经测定纯化后的蛋白浓度为509mg/L。
CUZD1抗原蛋白制备方法2:筛选CUZD1重要抗原表位多肽2-5个,用多肽合成仪进行从从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成,然后与载体蛋白偶联,使分子量增大,便于结合在结合垫和分析膜上。常用的载体蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。
实施例2抗体制备
结合垫及检测带包被抗体抗人IgG单克隆抗体和多克隆抗体,以及用于质控带和结合垫其他动物来源的单克隆抗体和多克隆抗体,可通过免疫动物获得。
1、单克隆抗体制备的具体操作方法为:
1)通过将0.05mg~1mg免疫制剂(分别针对山羊或小鼠或兔子)与1倍体积的弗氏完全佐剂混合得到注射溶液,将该注射溶液在动物皮内多部位注射;
2)一个月后将动物用的人IgG的弗氏完全佐剂混合液经多部位动物皮下注射而加强免疫。7~14天后将动物放血,测定抗血清滴度。
3)对动物加强免疫直至滴度达到平台期。通过从被免疫的动物回收脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选后即可得到能稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞。
4)体外培养的杂交瘤细胞,接种小鼠或大鼠腹腔,取腹水纯化获得单克隆抗体;或者从培养上清液中纯化获得单克隆抗体。
2、多克隆抗体制备:
同单克隆抗体步骤1)和2),在获得抗血清后,纯化抗血清获得多克隆抗体。
3、葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白制备
根据葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白的基因序列,可通过大肠杆菌原核表达克隆化基因来制备,具体操作方法可参见(分子克隆实验指南),或实施例1CUZD1的步骤。
实施例3胶体金液制备
1)将0.01%(w/v)的HAuCl4溶液加热至沸腾,迅速加入每100mL HAuCl4溶液加入适量的还原剂溶液,颜色从蓝色,然后浅蓝、蓝色,再加热出现红色,煮沸7~10min出现透明的橙红色。再用超滤或微孔滤膜(0.45μM)过滤,以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物,液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物杂质时弃用。
2)其中所使用的还原剂可以为柠檬酸三钠、鞣酸-柠檬酸三钠、白磷,优选使用柠檬酸三钠,更优选地使用1%(w/v)柠檬酸三钠。
3)其中所用玻璃容器应绝对清洁,用前需经酸洗。其水应为去离子超纯水,电阻率达18.2MΩ。
4)胶体金溶液制备过程中,各溶液的配制方法如下:HAuCl4的配制:用超纯水溶解氯金酸,配成1%溶液,置4℃备用,有效期三个月;1000mL1%HAuCl4溶液配方:10g HAuCl4、超纯水定容至1000mL;1%柠檬酸三钠(Sodium Citrate)的配制:用超纯水溶解Sodium Citrate,配成1%溶液,0.22μM膜滤过,现配现用。
实施例4金标蛋白制备
1、金标鼠或兔抗人IgG制备:用0.1M碳酸钠调节胶体金pH 7.3~7.5,按每毫升胶体金溶液缓慢加入5~25μG鼠/兔抗人IgG,混匀,静置10min,然后加入BSA至终浓度1%,混匀,静置5min,3000rpm离心5min,去沉淀,将上层溶液转至新管,9000rpm离心30min,去上清,加入重悬液至原量,将溶液移至新管,9000rpm再次离心30min,加入用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬,置4℃备用。
2、金标羊/兔IgA及IgM制备:用0.1M碳酸钠调节胶体金pH 7.5~8.0,按每毫升胶体金溶液缓慢加入8~25μG羊/兔IgA或IgM,混匀,静置10min,然后加入BSA至终浓度1%,混匀,静置5min,3000rpm离心5min,去沉淀,将上层溶液转至新管,9000rpm离心30min,去上清,加入重悬液至原量,将溶液移至新管,9000rpm再次离心30min,加入用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬,置4℃备用。
3、金标CUZD1抗原蛋白制备:用0.1M碳酸钾调节制备的胶体金pH 7.5,按每毫升胶体金溶液缓慢加入10μG CUZD1抗原蛋白,搅拌20min,然后加入BSA至终浓度1%,搅拌20min,离心,弃上清,将沉淀用洗涤液洗涤3次,末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬,置4℃备用。
4、金标SPA和Protein G制备:用0.1M碳酸钾调节制备的胶体金pH 8.0~9.0,按每毫升胶体金溶液缓慢加入5~20μG SPA或Protein G,搅拌10~30min,然后加入BSA至终浓度0.5~1%,搅拌10~30min,离心,弃上清,将沉淀用洗涤液洗涤3次,末次用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬,置4℃备用。
实施例5胶体金标记抗CUZD1抗体检测试纸1制备
试纸条1的结合垫结合蛋白为金标鼠抗人IgG,检测带包被CUZD1抗原蛋白,质控带包被羊抗鼠IgG,试纸条长度约6.5cm,宽4mm。结合垫材质为玻璃纤维膜,分析膜材质为硝酸纤维素膜(NC)。制备步骤如下:
1)分析膜制备:
用包被缓冲液稀释CUZD1抗原蛋白至浓度为0.8mG/mL,用划膜喷金仪HM3035,距离结合垫1cm处,以1μL/cm喷涂于NC上,构成检测带(4)。用包被缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到0.5mG/mL,距离检测带约5mm处,以1μL/cm用划膜喷金仪仪器喷涂于同一张NC膜上,构成质控带,质控带同时距离吸水垫约1cm。分析膜37℃烘干,封装备用。
所使用的包被缓冲液可以是硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、Tris-HCl或Tris-磷酸盐等,缓冲液的作用是提供一定pH和离子强度使蛋白牢固包被于NC膜,缓冲液pH值一般约为6~9.5范围内,优选为6.5~7.5的中性缓冲范围内,且最优选缓冲液的pH值为7.0~7.4范围内。
本实施例所用缓冲液pH值7.2的0.01M磷酸盐缓冲液。
分析膜的材质可选硝酸纤维素膜(NC)或者醋酸纤维素膜,商品化的硝酸纤维素膜包括S&SAE99、whatman 8μm、millipore M135、sartorius CN140等。使用哪种规格的具体NC膜或醋酸纤维素膜不是本发明的关键,但是在每次测定中,上述几种NC膜可以作为优选。不同厂家使用的含不同表面活性剂的不同缓冲液处理的膜,与所用检测线抗体溶液亲和力有不同程度的差距,也会很大程度造成线条不均匀,拖带或是弥散的现象,因此运用组装试纸来 选择优选的NC膜或醋酸纤维素膜。
2)结合垫制备
用结合垫缓冲液浸泡玻璃纤维膜约30分钟,37℃烘干,将实施例4中制备的鼠抗人IgG金标抗体用划膜喷金仪仪器,以3μL/cm的用量喷涂在预处理的玻璃纤维膜上,37℃烘干即构成结合垫,置2~8℃备用。
结合垫缓冲液配方:0.01M PB、1%BSA、0.05%NaN3、0.1%TritonX、10%蔗糖。
3)样品垫制备
用样品垫处理液浸泡样品垫,然后在37℃下1h烘干,备用。
样品垫缓冲液的组成为:pH为7.2的0.01M PB缓冲溶液,含1%BSA,10%蔗糖,0.1%Tween-20。
4)试纸裁剪及装配
用裁切机将上述步骤制备并干燥的样品垫、结合垫、分析膜、吸水纸分别剪切1.7cm、0.8cm、2.5cm和1.5cm宽的窄条,按图1方式搭接成大板,用切条机将大板切成单人份,每人份宽度根据底板卡壳的不同而异,本实施例选用4mm宽度。将单人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里,使加样窗对应试纸的样品垫,结果显示窗对应检测区和质控区,组装温度应控制在25~37℃,湿度20%~30%。
实施例6胶体金标记抗CUZD1抗体检测试纸2制备
试纸条2的结合垫结合蛋白为金标羊抗人IgG多克隆抗体和兔IgM,检测带包被CUZD1抗原蛋白,质控带包被鼠抗兔IgM单克隆抗体,试纸条长度约6.5cm,宽3mm。结合垫材质为聚酯膜,分析膜材质为硝酸纤维素。制备步骤如下:
1)分析膜的制备
检测带制备:同实施例4方法把CUZD1抗原蛋白包被在分析膜的检测带上。
质控带制备:用包被缓冲液将鼠抗兔IgM稀释到0.5~1.0mG/mL,以1μL/cm用划膜喷金仪仪器喷涂于醋酸纤维素膜上,距吸水垫1cm,与检测带距离5mm。
分析膜37℃烘干,封装备用。
2)结合垫的制备
结合垫选用聚酯膜,先用结合垫缓冲液浸泡聚酯膜约30分钟,然后37℃烘干。用划膜喷金仪把实施例4制备的金标羊抗人IgG多克隆抗体和兔IgA分别涂布2层聚酯膜上,涂布量为4mm/cm。
结合垫缓冲液配方:Ph值7.5磷酸盐缓冲液,含1%BSA、0.05%NaN3、0.1%Tween-20和15%蔗糖。
3)试纸裁剪及装配
用裁切机将上述步骤制备并干燥的样品垫、结合垫、分析膜、吸水纸分别剪切1.7cm、0.8cm、2.5cm和1.5em宽的窄条,按图2方式搭接成大板,用切条机将大板切成单人份,每人份宽度根据底板卡壳的不同而异,本实施例选用3mm宽度。将单人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里,使加样窗对应试纸的样品垫,结果显示窗对应检测区和质控区,组装温度应控制在25~37℃,湿度20%~30%。
实施例7.胶体金标记抗CUZD1抗体检测试纸3制备
试纸条3的结合垫结合蛋白为金标CUZD1抗原蛋白和兔IgG,检测带包被兔抗人IgG多克隆抗体,质控带包被羊抗兔IgG单克隆抗体,试纸条长度约6.5cm,宽3mm。结合垫材质为玻璃纤维膜,分析膜材质为醋酸纤维素膜。制备步骤如下:
1)分析膜的制备
检测带制备:用包被缓冲液将鼠抗人IgG稀释到1.0mG/mL,以1μL/cm用划膜喷金仪喷涂于醋酸纤维素膜上,距结合垫1cm。
质控带制备:用包被缓冲液将羊抗兔IgG稀释到0.8mG/mL,以1μL/cm用划膜喷金仪喷涂于醋酸纤维素膜上,距吸水垫1cm,与检测带距离5mm。
分析膜37℃烘干,封装备用。
2)结合垫的制备
结合垫选用玻璃纤维膜,先用结合垫缓冲液浸泡约30分钟,然后37℃烘干。用划膜喷金仪,把实施例4制备的金标CUZD1抗原蛋白和兔IgG分别涂布2层玻璃纤维膜上,涂布量为3.5μL/cm。
3)试纸裁剪及装配
同实施例6。
实施例8.胶体金标记抗CUZD1抗体检测试纸4制备
试纸条4的结合垫结合蛋白为金标CUZD1抗原蛋白,检测带包被豚鼠抗人IgG多克隆抗体,质控带包被鼠抗CUZD1单克隆抗体IgM,试纸条长度约6.5cm,宽4mm。结合垫材质为玻璃纤维膜,分析膜材质为硝酸纤维素膜(NC)。制备步骤如下:
2)分析膜制备:
检测带制备:用包被缓冲液稀释豚鼠抗人IgG单克隆抗体至浓度约为1.2mG/mL,用划膜喷金仪HM3035,距离结合垫1cm处,以0.8μL/cm喷涂于NC上,构成检测带(4)。
质控带制备:用包被缓冲液将鼠抗CUZD1单克隆抗体IgM稀释至约0.8mG/mL,距离检测带约5mm处,以0.8μL/cm用划膜喷金仪喷涂于同一张NC膜上,构成质控带,质控带同 时距离吸水垫约1cm。
分析膜37℃烘干,封装备用。
2)结合垫制备
用结合垫缓冲液浸泡玻璃纤维膜约30分钟,37℃烘干,将实施例4中制备的金标CUZD1抗原蛋白用划膜喷金仪,以5μL/cm的用量喷涂在预处理的玻璃纤维膜上,37℃烘干即构成结合垫,置2~8℃备用。
3)样品垫制备
用样品垫处理液浸泡样品垫,然后在37℃下1h烘干,备用。样品垫缓冲液的组成为:pH为7.2的10mM PB缓冲溶液,含1%BSA,10%蔗糖,0.1%Tween-20。
4)试纸裁剪及装配
同实施例5。
实施例9.彩色胶乳标记蛋白制备
1)彩色胶乳标记液的制备
胶乳的共价活化:超声波处理胶乳微球体30秒,调节胶乳微球体浓度为1.0×1012/mL,15000rpm离心10分钟,离心后收集沉淀物用蒸馏水溶解,并用200W超声波分散30秒;先加入50μL的50mg/mL EDC,振荡混匀,再加入50μL的50mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺,振荡混匀,室温下平衡30分钟后在15000rpm离心10分钟,沉淀用50mM柠檬酸缓冲液溶解,静置于4℃冰箱。
2)彩色胶乳标记蛋白的制备
将活化后的胶乳于200W超声波处理30秒,按照120μG蛋白/100μL彩色胶乳的比例加入待标记的抗体或者蛋白,混匀室温搅拌反应2小时,离心洗涤,每次15000rpm下离心10分钟,共洗涤3次,沉淀用PBS-TBN溶解并100W超声波处理30秒,然后用PBS-TBN稀释至离心前体积,4℃保存备用。
实施例10.彩色胶乳标记抗CUZD1抗体检测试纸5制备
试纸条5的结合垫结合蛋白为红色胶乳标记的鼠抗人IgG,检测带包被CUZD1抗原蛋白,质控带包被羊抗鼠IgG的IgA单克隆抗体和SPA。试纸条长度约6.5cm,宽4mm。结合垫材质为聚酯膜,分析膜材质为硝酸纤维素膜(NC)。制备步骤如下:
1)分析膜的制备
检测带制备:同实施例5。
质控带制备:用包被缓冲液将SPA和羊抗鼠IgA分别稀释至到0.8mg/mL,1∶1混匀,以1μL/cm用划膜喷金仪喷涂于NC上靠近吸水垫(6)的质控线(5)处,距吸水垫(6)约1cm, 距离检测线(4)5mm,喷线应粗细均匀。
分析膜37℃烘干,封装备用。
2)结合垫的制备
用结合垫缓冲液将聚脂膜浸泡30分钟,37℃烘干,把实施例9中红色胶乳标记的CUZD1抗原蛋白用划膜喷金仪,以3μL/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜上,37℃干燥,置2~8℃备用。
3)样品垫制备
用样品垫处理液浸泡样品垫,然后在37℃下1h烘干,备用。
4)试纸裁剪及装配
同实施例5。
实施例11彩色胶乳标记抗CUZD1抗体检测试纸6制备
试纸条6的结合垫结合蛋白为紫色胶乳标记的CUZD1抗原蛋白和兰色胶乳标记的兔IgM,检测带包被兔抗人IgG单克隆抗体,质控带包被鼠抗兔IgM和Protein G,试纸条长度约6.5cm,宽4mm。结合垫材质为玻璃纤维膜,分析膜材质为硝酸纤维素膜。制备步骤如下:
3)分析膜制备:
检测带制备:用包被缓冲液分别稀释兔抗人IgG单克隆抗体至浓度约为1.0mG/mL,用划膜喷金仪HM3035,距离结合垫1em处,以1μL/em喷涂于NC上,构成检测带(4)。
质控带制备:用包被缓冲液分别将鼠抗兔IgA和Protein G稀释至约2.0mG/mL,1∶1混合,把混合液距离检测带约5mm处,以1μL/em用划膜喷金仪喷涂于同一张NC膜上,构成质控带(5),质控带同时距离吸水垫(6)约1cm。
分析膜37℃烘干,封装备用。
2)结合垫制备
用结合垫缓冲液浸泡玻璃纤维膜约30分钟,37℃烘干,将实施例9中制备的紫色胶乳标记的CUZD1抗原蛋白和蓝色胶乳标记的兔IgM分别用划膜喷金仪,以3.5μL/em和3.0μL/em的用量喷涂在预处理的玻璃纤维膜上,37℃烘干即构成结合垫,置2~8℃备用。
3)样品垫制备
用样品垫处理液浸泡样品垫,在37℃下烘干1~2h,备用。
4)试纸裁剪及装配
同实施例6。
实施例12彩色胶乳标记抗CUZD1抗体检测试纸6制备
试纸条7的结合垫结合蛋白为紫色胶乳标记的CUZD1抗原蛋白和兰色胶乳标记的羊抗 鼠IgG,检测带包被骆驼抗人IgG单克隆抗体,质控带包被SPA,试纸条长度约6.5cm,宽4mm。结合垫材质为聚酯膜,分析膜材质为醋硝酸纤维素膜。制备步骤如下:
4)分析膜制备:
检测带制备:同实施例11。
质控带制备:用包被缓冲液分别将SPA稀释至约1.5mG/mL,距离检测带约5mm处,以1μL/cm用划膜喷金仪喷涂于同一张NC膜上,构成质控带(5),质控带同时距离吸水垫(6)约1cm。
分析膜37℃烘干,封装备用。
2)结合垫制备
用结合垫缓冲液浸泡聚酯膜约30分钟,37℃烘干,将实施例9中制备的紫色胶乳标记的CUZD1抗原蛋白和蓝色胶乳标记的鼠IgG按1∶1混匀,用划膜喷金仪以5μL/cm的用量喷涂在预处理的玻璃纤维膜上,37℃烘干即构成结合垫,置2~8℃备用。
3)样品垫制备
用样品垫处理液浸泡样品垫,然后在37℃下1h烘干,备用。
4)试纸裁剪及装配
同实施例5。
实施例13样本处理
血清样本:取全血1~5mL于血清采集管中,静置30min~2h,3000~5000g离心5~10min,取上清即得。根据试纸条的检测精度,把样本用加样缓冲液稀释0-100倍,取50-100μL滴加到试纸条的加样孔中,静置5~20分钟后观察结果。
血浆样本:取全血1~5mL于枸橼酸钠或肝素钠抗凝管中混匀,1000~3000g离心5~10min,取上清即得到血浆样本。根据试纸条的检测精度,把样本用加样缓冲液稀释0-100倍,取50-100μL滴加到试纸条的加样孔中,静置5~20分钟后观察结果。
全血标本:取指尖或耳垂新鲜血约50μL,滴加到加样孔中,马上用50μL加样缓冲液滴加到加样孔中稀释,静置5~20分钟后观察结果。
实施例14试纸条性能评估
本发明试剂条的性能包括稳定性、批内不精确度和批间不精确度评估。
1、4℃稳定性试验
将试纸条放置2~8℃冷库,每月取出用质控品和阴阳性参考品各10份的阴阳性符合率的批内精密度来判断试纸的稳定性。12个月后结果显示,质控品检测结果符合预期,各个阴阳性参考品的阴阳性符合率为100%。18个月后结果显示,各个阴阳性参考品的阴阳性符合率仍 为100%。24个月后检测结果显示,未出现假阴性。综合以上结果说明试纸在2~8℃贮存,2年内是稳定的。
2、批内不精确度
取实施例5~8各一个批次的金标试纸条,和实施例10~12各一个批次的胶乳试纸条,分别用高、中、低三种阳性血清和阴性血清各一份,每份血清分别用金标试纸条和胶乳试纸条重复检测10次,结果如下表所示,所有阳性血清的检测结果均为阳性,所有阴性血清的检测结果均为阴性,提示本发明的胶体金试纸条和胶乳试纸条批内不精确度符合标准。
3、批间不精确度
试纸条1和试纸条6各三个批次,用高、中、低三种阳性血清和阴性血清检测,每份血清检测10条,10分钟后观察结果,如下表所示,试纸条1和试纸条6各三个不同批次的检测结果一致,说明批间不精确度符合标本。
实施例15试纸条检测及临床性能评估
用实施例5~8制备的金标试纸条和实施例10和11制备胶乳试纸条检测确诊的CD患者和正常人血清或血浆各100例。检测结果如表3所示,其中检测灵敏度为在所有临床阳性病例数中,试纸条检测阳性数所占的百分比,检测特异性为在所有临床阴性病例数中试纸条检测阴性数所占的百分比,检测准确性为临床阳性病例中检测的阳性数与临床阴性病例中的阴性数之和占总数的百分比。
从表3的结果可以看出,本发明制备的CUZD1抗体检测金标试纸条和胶乳试纸条用于CD患者诊断的灵敏度均大于35%,文献报道用CUZD1间接免疫荧光检测,CD患者中大约有30%的阳性率,可见本发明制备的CUZD1免疫层析试纸条比间接免疫荧光法试剂灵敏度更高,而且简便,适合室温保存等优势。
表3.试纸条临床性能检测
Claims (10)
1.一种抗CUZD1抗体免疫层析试纸条,包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5),所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3),所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6),所述结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1),所述检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上,其特征在于,CUZD1抗原蛋白结合在结合垫(2)上或包被在检测带T线(4)上。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于:所述的结合垫(2)包被胶体金标记物或胶乳(乳胶)标记物。
3.根据权利要求1所述的CUZD1抗体检测试纸条,其特征在于,所述的结合垫为1层(图1)或分上(2a)、下(2b)两层与分析膜错落搭接(图2)。
4.一种抗CUZD1抗体免疫层析试纸条的制备方法,包括如下步骤:
步骤1.CUZD1抗原蛋白的制备
步骤2.结合垫(2)制备
(1)胶体金标记物的制备:用纳米金溶液标记CUZD1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G),以及其他与检测带T线和质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。
(2)胶乳标记物的制备:用带活性基团的胶乳微球标记CUZD1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G),以及其他检测带T线与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。
(3)结合垫(2)制备:玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫,将步骤(1)制备的纳米金标记物或胶乳标记物,喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上,干燥备用。
步骤3.分析膜(3)制备
A.检测带T线(4)制备:根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白,如结合垫上的结合蛋白含CUZD1,检测带T线的包被蛋白是抗人IgG抗体。如果结合垫上含有抗人IgG抗体,检测带T线包被蛋白为CUZD1。
B.质控带C线(5)制备:根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白,如结合垫标记蛋白是单一的CUZD1,质控带C线的包被蛋白为抗CUZD1的抗体;如果结合垫标记蛋白是单一的抗人IgG抗体,质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体;结合垫标记蛋白有2层时,质控带C线的包被蛋白是能与结合垫对应层结合蛋白形成免疫复合物的蛋白。
步骤4.样品垫制备
将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用,或者直接使用。
步骤5.试纸条组装
把步骤1~4所制作完成的材料,按图1或图2搭接,根据底板的规格切割成一定的长度和宽度,安装在底板和卡壳里。
5.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条,其特征在于:所述的CUZD1抗原蛋白是把全长CUZD1基因或者含有重要抗原表位的基因序列,克隆到原核或真核表达载体里,表达纯化获得。
6.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条,其特征在于:所述的CUZD1抗原蛋白是用多肽合成仪合成含有CUZD1重要抗原表位的CUZD1多肽,并偶联到载体蛋白上而获得。载体蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。
7.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述的抗人IgG抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
8.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述的抗CUZD1的抗体是以CUZD1为免疫源产生的单克隆或多克隆抗体。
9.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的蛋白。
10.一种抗CUZD1抗体检测方法,其特征在于,用权利要求1~9所述的免疫层析试纸条,对待检样品进行检测,具体步骤包括:
(1)样本处理:取血清、血浆或全血样本;
(2)把样品滴加到试纸条的样品垫上,静置5~30分钟,观察T线和C线;
(3)结果判读:T线和C线均显现,结果为阳性;T线不显现,C线显现,结果为阴性;T线和C线均不显现或其他现象,提示试纸失效。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410414639.4A CN104198698A (zh) | 2014-08-21 | 2014-08-21 | 一种抗cuzd1抗体层析试纸条及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410414639.4A CN104198698A (zh) | 2014-08-21 | 2014-08-21 | 一种抗cuzd1抗体层析试纸条及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104198698A true CN104198698A (zh) | 2014-12-10 |
Family
ID=52084021
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410414639.4A Pending CN104198698A (zh) | 2014-08-21 | 2014-08-21 | 一种抗cuzd1抗体层析试纸条及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104198698A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109085358A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-12-25 | 威海纽普生物技术有限公司 | 血清淀粉样蛋白a测定试剂盒及制作方法 |
CN114217079A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-03-22 | 苏州和锐生物科技有限公司 | 一种用于抗胰腺腺泡抗体检测的捕获抗原以及检测方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1840573A1 (en) * | 2006-03-27 | 2007-10-03 | Institut Pasteur | Secreted proteins as early markers and drug targets for autoimmunity, tumorigenesis and infections |
CN102062777A (zh) * | 2009-11-12 | 2011-05-18 | 上海科新生物技术股份有限公司 | 胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法 |
-
2014
- 2014-08-21 CN CN201410414639.4A patent/CN104198698A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1840573A1 (en) * | 2006-03-27 | 2007-10-03 | Institut Pasteur | Secreted proteins as early markers and drug targets for autoimmunity, tumorigenesis and infections |
CN102062777A (zh) * | 2009-11-12 | 2011-05-18 | 上海科新生物技术股份有限公司 | 胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CHRISTOS LIASKOS 等: "CUZD1 and Anti-CUZD1 Antibodies as Markers of Cancer and Inflammatory Bowel Diseases", 《CLINICAL AND DEVELOPMENTAL IMMUNOLOGY》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109085358A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-12-25 | 威海纽普生物技术有限公司 | 血清淀粉样蛋白a测定试剂盒及制作方法 |
CN114217079A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-03-22 | 苏州和锐生物科技有限公司 | 一种用于抗胰腺腺泡抗体检测的捕获抗原以及检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Deshpande | Enzyme immunoassays: from concept to product development | |
CN102062777B (zh) | 胶体金层析法原发性胆汁肝硬化检测试纸及其制备方法 | |
CN101988924B (zh) | 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法 | |
CN104297465A (zh) | 一种抗OmpC抗体检测试纸的制备方法及用途 | |
CN104792997B (zh) | 一种人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
CN105717303A (zh) | 一种用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其试剂盒 | |
CN105628932A (zh) | 一种saa免疫层析试纸条及其制备方法和检测方法 | |
CN107144686B (zh) | 一种精确荧光定量检测方法 | |
CN103045541A (zh) | 杂交瘤细胞株及其产生的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体 | |
CN104297488A (zh) | 一种抗CBir1抗体检测试纸的制备方法及用途 | |
CN102914651A (zh) | 一种检测髓过氧化物酶的方法及试剂盒 | |
CN1880961B (zh) | 一种检测b型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸及其制备方法 | |
CN104764881A (zh) | 一种抗mpo-anca抗体免疫层析试纸的制备方法及应用 | |
CN101072796A (zh) | 马血红蛋白的单克隆和多克隆抗体以及采用这些抗体和/或过氧化物酶反应的用于鉴定和定位马溃疡的装置和方法 | |
CN104198698A (zh) | 一种抗cuzd1抗体层析试纸条及其用途 | |
CN104090109A (zh) | 快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸及其检测方法 | |
CN102621308A (zh) | 胶体金层析法抗Jo-1抗体检测试纸及其制备方法 | |
CN103336125A (zh) | sH2a定量检测试剂盒 | |
CN104764884A (zh) | 一种抗alpha-烯醇化酶抗体层析试纸条及其用途 | |
CN104297466A (zh) | 一种抗i2抗体层析试纸条及其用途 | |
Zhou et al. | Development of a novel antibody probe useful for domoic acid detection | |
CN104297489A (zh) | 一种抗pr3-anca抗体检测试纸的制备方法及用途 | |
CN102621311B (zh) | 胶体金层析法抗ssb抗体检测试纸及其制备方法 | |
CN102221615A (zh) | 一种基于Angiogenin检测的双抗夹心ELISA方法 | |
CN202083693U (zh) | 胶体金层析法抗核糖体p0抗体检测试纸 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: Xinghu Street Industrial Park of Suzhou city in Jiangsu province 215123 No. 218 building 313 room B2 Applicant after: Suzhou sharp Biotechnology Co., Ltd. Address before: Xinghu Street Industrial Park of Suzhou city in Jiangsu province 215123 No. 218 building 313 room B2 Applicant before: Suzhou Herui Medical Technology Co., Ltd. |
|
CB02 | Change of applicant information | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141210 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |