CN109085358A - 血清淀粉样蛋白a测定试剂盒及制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学免疫学中免疫层析技术领域，具体地说是一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒(免疫层析法)及制作方法，试剂盒包括免疫层析试纸条和塑料外壳，所述免疫层析试纸条是由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，所述试剂垫包被有鼠抗人SAA单克隆抗体标记的彩色荧光微球，硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗人SAA多克隆抗体，质控线包被有山羊抗鼠多克隆抗体，所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2‑6个不同的SAA抗原表位的单克隆抗体细胞株，采用彩色荧光微球可以快速得到定性结果并稍迟得到定量结果，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、可定性可定量等特点，有助于满足不同检验场景的需求。

Description

血清淀粉样蛋白A测定试剂盒及制作方法
技术领域
本发明涉及医学免疫学中免疫层析技术领域，具体地说是一种能够快速准确的对SAA进行同时定性和定量分析的一种测定SAA的免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SAA)是淀粉样变中主要组成成分淀粉样A蛋白的血清前体，是由肝细胞产生后被分泌到血清中的一种急性时相蛋白，虽然随处可见，但是在正常情况下，在人体中表达依然很低,然而机体一旦发生炎症、感染或组织损伤时，SAA水平可在5～6h内迅速升高约1000倍，研究显示，在细菌、真菌、病毒感染、动脉粥样硬化、心血管疾病、急性移植排斥反应等疾病中均可检测到血液中SAA升高，在疾病的恢复期迅速下降。血清淀粉样蛋白A(SAA)是一个高度异质性蛋白，代表一个相对分子质量为12000的家族。在某些方面SAA比其他常见急性蛋白更具灵敏性，如在病毒和细菌感染中，SAA的血清浓度均升高，而在病毒感染反应中，C-反应蛋白(CRP)的血清浓度几乎不升高或升高不明显。SAA能通过激活中性粒细胞和其他炎症细胞诱导等炎症介质以及金属蛋白酶的释放，从而增强机体的炎性反应,有免疫调节作用。因此，SAA被认为是一种炎性标志物的同时，也作为一种炎症信号的触发剂存在。SAA的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于炎症的辅助诊断、评估其活性、监控其活动及治疗。。
SAA检测方法主要有定量检测方法和定性检测方法，定量检测方法有双抗夹心法(ELISA)、荧光免疫层析法、胶乳颗粒增强免疫比浊法等，定性方法主要有胶体金免疫层析法。定量方法普遍需要昂贵的仪器，并且获得结果时间都偏长，只有荧光免疫层析法应用场景要求较低，但是也需要较长时间且必须需要仪器检测，虽然日常可以满足，但是在流感爆发或者救灾场所仍旧带来诸多不便；而胶体金层析法虽然可以用时较短，但是定性结果容易存在偏差，获得阳性结果的时候也无法获得病情的严重程度。如何能够应对流感爆发和现场救灾等需要尽快定性以及获得定量结果确定后期的针对性治疗，是目前临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。
发明内容：
本发明针对现有检测产品存在的缺点和不足，提出了一种结合了用彩色微球快速定性和荧光微球准确定量的优点，既能满足只需定性但是要求出结果尽可能快，或者缺乏仪器、没有电源等特殊检验场景的需求，又能结合荧光免疫层析分析仪实现需要灵敏度高、准确定量的测定SAA指标的测定SAA的荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
本发明可以通过以下措施达到：
一种血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒(免疫层析法)及制作方法，试剂盒包括免疫层析试纸条和塑料外壳，所述免疫层析试纸条是由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，其特征在于所述试剂垫包被有鼠抗人SAA单克隆抗体标记的彩色荧光微球，硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗人SAA多克隆抗体，质控线包被有山羊抗鼠多克隆抗体，所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的SAA抗原表位的单克隆抗体细胞株。
本发明所述试剂垫的彩色荧光微球的直径范围是180-220nm；所述彩色荧光微球掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)中的任意一种或几种的混合物；所述彩色荧光微球掺杂的彩色染料含有氨基或者羟基官能团，为酸性紫1、酸性紫7、酸性蓝25、分散红58中的任意一种或几种的混合物。
所述试剂垫上彩色微球标记的抗体来源于针对3-4个不同抗原表位的单克隆抗体细胞株。
本发明所述试剂垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含2.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.5的200mM Tris-HCL处理液中，4℃浸泡3小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将鼠抗人SAA单克隆抗体标记彩色荧光微球喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时。
本发明中试剂垫上的鼠抗人SAA单克隆抗体标记的彩色荧光微球采用如下步骤制得：
步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：用SAA纯品免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株制备的抗体与自行制备的兔抗人SAA多克隆抗体进行配对筛选，根据配对结果和亲和力数据优选出用于试剂盒的3株单抗细胞株；
步骤2：调整3株单抗细胞株制备的单克隆抗体的比例，优选出用于最终试剂盒制备的单抗混合物的比例；
步骤3：单克隆抗体的大量制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化SAA单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；
步骤4：彩色荧光微球的醛基化：取2mg彩色荧光微球，用50mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为15000rpm，时间为20分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；
步骤5：制备鼠抗人SAA单克隆抗体标记的彩色荧光微球，将1mg用于检测的鼠抗人SAA单克隆混合抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的彩色荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液(200mM Tris-HCL，pH7.5，含3％BSA，6％蔗糖)，4℃封闭过夜；然后用200mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的200mM Tris-HCL缓冲液中(含0.9％NaCL，1.5％BSA，0.5％Tween 20)，4℃避光保存备用。
本发明所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：
步骤1：采购SAA蛋白并按照常规兔多克隆抗体制备流程进行用于捕获的兔抗人SAA多克隆抗体的免疫，收集抗血清，采用蛋白亲和纯化的工艺对抗体进行亲和纯化，然后用包被稀释液作为透析液进行透析处理，保存于-20℃备用；
步骤2：分别用包被稀释液将兔抗人SAA多克隆抗体和山羊抗鼠多克隆抗体调整浓度到2-8mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。
本发明所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含有2.0％Triton X-100，2％BSA，0.2M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。
本发明在使用的过程中，首先将检测试剂盒及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；然后精确吸取25μl血清样本，样本为全血时吸取50μl样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μl样本稀释液，样本稀释液采用生理盐水或PBS；5-8分钟后，肉眼观察检测线和质控线颜色变化，即可获得定性结果；设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数，15-30分钟内，进行检测获得定量结果。
本发明提供一种使用彩色荧光微球，采用免疫层析技术制备的SAA定性和定量免疫层析检测试剂盒，对于同一个试剂盒，可以极短时间内获得定性结果并随后获得准确定量的结果，同时满足了先期获得初步结果和后面获得准确定量结果的需求，并且可以应用于条件比较差，没有仪器或者电源的检验场景，具有操作简便、结果快速、测量准确、适合不同检验场景等优点。
附图说明：
附图1是本发明中试纸条的结构示意图。
附图2是本发明中实施例1的单克隆抗体配对筛选结果示意图。
附图3是本发明中实施例2的定性检测分析结果示意图。
附图4是本发明中实施例2的定量检测准确度分析结果示意图。
附图标记：PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：
如附图1所示，本发明首先提出了一种定性和定量测定SAA的免疫层析检测试剂盒，该试剂盒包括免疫层析试纸条和塑料外壳，所述免疫层析试纸条是由底板1、样品垫2、试剂垫3、硝酸纤维素膜4和吸收垫5组成的试纸条，所述样品垫2、试剂垫3、硝酸纤维素膜4和吸收垫5依次交错固定于所述底板1上，所述试剂垫3包被有鼠抗人SAA单克隆抗体标记的彩色荧光微球，硝酸纤维素膜4上的检测线包被有兔抗人SAA多克隆抗体，质控线包被有山羊抗鼠多克隆抗体。
本发明所述试剂垫3的彩色荧光微球的直径优选是180-220nm；所述彩色荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述彩色荧光微球优选掺杂的彩色染料含有氨基或者羟基官能团，为酸性紫1、酸性紫7、酸性蓝25分散红58等任意一种或几种的混合物。
本发明所述的试剂盒制备方案参照前述发明内容并不仅仅限于上述具体方案，所有在此基础上进行的可以预见的微调都视同为与本发明内容相同。
实施例1：
本发明中试剂垫上的彩色荧光微球结合的鼠抗人SAA单克隆抗体通过以下措施制得：
1、单克隆抗体细胞株的获得：用SAA纯品免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备至少100株以上的特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株制备相应的抗单克隆体，采用ELISA的方法与自行制备的兔抗人SAA多克隆抗体进行配对初筛，优选出10株备选单克隆抗体细胞株，进一步用所制备的单克隆抗体参考试剂盒制备方案与自行制备的兔抗人SAA多克隆抗体进行配对筛选，根据显色时间、显色强度、背景噪音程度等配对结果对所筛选的单克隆抗体进行筛选，进一步的优选获得用于试剂盒制备的3株单抗细胞株(附图2)。
2、单抗混合物的确定：调整3株单抗细胞株制备的单克隆抗体的比例，最终优选出用于最终试剂盒制备的单抗混合物的比例。
3、单克隆抗体的大量制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化SAA单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用。
实施例2：彩色微球定性试验和荧光免疫测定准确度试验
选用上述试剂盒以及荧光免疫层析分析仪(型号：NEO-007)，
荧光免疫分析仪参数的设定：在荧光免疫分析仪上设定好试剂盒工艺参数后，取上述组装好的试剂盒，分别用2.5、5、10、25、100、200、400mg/l的SAA校准品，用试剂盒进行测定，得到各校准品的荧光强度值，将结果输入到分析仪的参数中，完成分析仪的参数的最终设定。
主要检测材料：200份临床样本由相关医院获得，采用西门子公司的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒(散射比浊法)进行定值，其中血清样本100份，全血样本100份，SAA含量分布区间为2-400mg/L之间。
检测方法：
步骤1：将检测试剂盒及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；
步骤2：精确吸取25μl血清样本，样本为全血时吸取50μl样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μl样本稀释液，样本稀释液采用生理盐水或PBS；
步骤3：8分钟后，肉眼观察检测线和质控线颜色变化，获得定性结果；
步骤4：设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数，15-30分钟内，进行检测获得定量结果。
试验结果分析：
临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。
试验结果：
1、如附图3所示，对定性结果进行分析，参照SAA的参考范围，拟定10mg/l以下为阴性，10mg/l以上为阳性。数据分析显示，试验系统确定阴性和阳性的样本数目与商业化试剂盒的检测结果一致性超过93.75％，表明所制备的检测试剂盒性能良好，能够满足快速检测的定性检测需求。
2、如附图4所示，对定量结果进行分析，以实验系统的检测值为Y轴，以对照系统的测验值为X轴，绘制散点图，并进行相关性分析。临床样本检测对200份临床定值样本检测，样本平均偏差值小于12％，最大偏差小于25％，R2>0.98，一致性系数>0.91。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，能够满足客户对准确定量检测的需求。
本发明提供一种使用彩色荧光微球，采用免疫层析技术制备的SAA定性和定量免疫层析检测试剂盒，该试剂盒定性测定分界线浓度为10mg/l，荧光免疫分析仪检测灵敏度为2mg/l，线性范围为1-400mg/l，采用彩色荧光微球可以快速得到定性结果并稍迟得到定量结果，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高等特点，有助于满足不同检验场景的需求。

Claims (4)

1.一种血清淀粉样蛋白A测定试剂盒，其特征在于试剂盒包括免疫层析试纸条和塑料外壳，所述免疫层析试纸条是由底板、样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成的试纸条，所述样品垫、试剂垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次交错固定于所述底板上，其特征在于所述试剂垫包被有鼠抗人SAA单克隆抗体标记的彩色荧光微球，硝酸纤维素膜上的检测线包被有兔抗人SAA多克隆抗体，质控线包被有山羊抗鼠多克隆抗体，所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的SAA抗原表位的单克隆抗体细胞株。
2.根据权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A测定试剂盒，其特征在于所述试剂垫的彩色荧光微球的直径范围是180-220nm；所述彩色荧光微球掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)中的任意一种或几种的混合物；所述彩色荧光微球掺杂的彩色染料含有氨基或者羟基官能团，为酸性紫1、酸性紫7、酸性蓝25、分散红58中的任意一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A测定试剂盒，其特征在于所述试剂垫上彩色微球标记的抗体来源于针对3-4个不同抗原表位的单克隆抗体细胞株。
4.一种如权利要求1-3所述的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒的制作方法，其特征在于在于3-4个针对不同抗原表位的细胞株采用如下步骤制得：
步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：用SAA纯品免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株制备的抗体与自行制备的兔抗人SAA多克隆抗体进行配对筛选，根据配对结果优选出用于试剂盒的3株单抗细胞株；
步骤2：单克隆抗体混合比例的确定：调整3株单抗细胞株制备的单克隆抗体的比例，优选出用于最终试剂盒制备的单抗混合物的比例；
步骤3：单克隆抗体的大量制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化SAA单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用。
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