CN106918693A

CN106918693A - 一种基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控检测技术

Info

Publication number: CN106918693A
Application number: CN201510979553.0A
Authority: CN
Inventors: 何元
Original assignee: SHANGHAI WAKELY POLYMER MATERIAL Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI WAKELY POLYMER MATERIAL Co Ltd
Priority date: 2015-12-24
Filing date: 2015-12-24
Publication date: 2017-07-04

Abstract

本发明涉及一种基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控检测技术。本发明提供了一种基于微球尺寸和塑料通道物理形状设计的检测装置，用于定性/量检测样品中单种或多种检测物。它使用大尺寸微球作为固定相微球，被通道物理尺寸的隔挡在检测区域内，小尺度微球作为检测相，可以自由流动于大微球之间、大微球与塑料通道之间的间隙内。作为固定相的大微球，通过染色，可得一灰度(或荧光)梯度组合，处于同一灰度(或荧光)梯度的微球可包被一种检测物抗体，通过读取灰度(或荧光)，就能区分不同的检测项目。小微球包被相应的二抗，可为检测提供信号。本发明通过使用微球和塑料通道，克服了纤维索膜固有的高变异系数缺陷，可通过注塑或压膜等常规塑料加工方式实施完成，与微流控芯片相比大大降低了成本。

Description

一种基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控检测技术

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用特定尺寸荧光微球、特定尺寸大微球、抗体——微球偶联技术、塑料基材综合应用的定量测定方法及其装置，更具体的涉及一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法。

背景技术

基于膜的侧向流动免疫测定已被商品化，用于对大量分析物的测定。基于该技术平台的医疗诊断产品，包括妊娠测试，药物滥用测试、某些疾病的标志物等。大多数使用该平台的现有商品可提供定性和半定量结果。但是该技术无法避免地需要使用硝酸纤维素膜这种基本材料，并把抗体(或抗原)固定到膜上，提供信号的微球(或染料)偶联了抗体并结合检测物在膜上做侧向扩撒运动。但是，硝酸纤维素膜本身的CV就超过8％，导致该技术产品检测的CV值居高不下，特别是临床上某些项目，例如CRP、PCT等，很难达到精确检测的要求，其结果与化学发光比较相去甚远。为了解决硝酸纤维素膜本身CV大的问题，人们想到了微流控技术。该技术是在聚合物，例如聚二甲基硅氧烷，上刻微米尺寸的孔道，并在上面集成阀、泵等微器件，其成本之高，已经超出了市场可接受的范围。而且，微流控技术还有一些问题亟待解决，例如微液滴的混匀问题等。

本方法放弃了硝酸纤维素的使用，用成本低廉的聚合物微球包被抗体(或抗原)替代传统侧向流层析中的检测线和控制线，避免了由于硝酸纤维素膜本身的高CV带来的检测结果的高CV。此外，本方法所使用的结合物基材是使用压模工艺制备，其成本之低，又是传统意义上的微流控无法比拟的，顺利解决了微流控高成本的问题。整个反应过程是在液体均相中进行，也大大降低了CV、提高了检测的灵敏度。因此，本方法避免了硝酸纤维素膜为基础的侧向流层析的高CV缺陷，还避免了传统微流控技术高成本短板，兼具了低CV、低成本、高灵敏度等特点。

发明内容

为了传统侧向流层析CV较大的缺点，本发明提出了一种基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控检测技术，使用它可以对样本中的特定分子进行定性/定量检测，且CV较低，满足临床检测的要求。

附图说明

图1是一种基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控检测技术所使用的芯片基片结构示意图。该图展示了样品槽、偶联抗体的荧光粒子、检测槽和吸水槽的位置。

图2是一种基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控检测技术的外观图。该图展示了基片加盖后的整体外观。

图3是根据实施例1中的CRP单重检测数据所描绘出来的“荧光——浓度”曲线图，反映了不同的CRP校准品浓度下对应的荧光强度关系。

图4是根据实施例2中的三重检测CRP数据所描绘出来的“荧光——浓度”曲线图，反映了不同的CRP校准品浓度下对应的荧光强度关系。

图5是根据实施例2中的三重检测PCT数据所描绘出来的“荧光——浓度”曲线图，反映了不同的PCT校准品浓度下对应的荧光强度关系。

图6是根据实施例2中的三重检测D-Dimer数据所描绘出来的“荧光——浓度”曲线图，反映了不同的D-Dimer校准品浓度下对应的荧光强度关系。

本发明的具体技术方案如下：

工程塑料基材：

以工程塑料为材料、通过注塑或压膜加工成型的基材，所述基材有添加样品区域，即样品槽；有荧光微球放置区域；有检测区域，即检测槽；有吸水区域，即吸水槽。沿所述液体流动方向还设置有检测槽与控制槽的物理性分离区域。基材底经亲水处理。

荧光微球放置区域，沉积有“荧光微球——一抗”结合物探针，其中所述结合物探针具有与被检测物形成特异蛋白结合的特点。

检测槽区域，放置有白色微球；其中所述白色微球表面偶联二抗(双抗体夹心法)，或所述白色微球表面偶联检测物(竞争法)。

吸水槽区域，放置有吸水性材料。

整个基材结构为压片结构，即基材底加基材盖。基材盖为弧形凸面结构，使流道密封性完好。

固定相微球：

固定相微球微球，其微球的粒径范围为100～1000μm不等。

其材质为苯乙烯、乙烯基甲苯、甲基丙烯酸甲酯、羟乙基丙烯酸甲酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯、丙烯醛、氯甲基苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯等材质的聚合物或共聚物。

其表面基团为氨基、羧基、醛基、磺酸基、硫酸基、环氧基、氯甲基、链霉亲和素不等。

其内部可封装不同的量的彩色染料、荧光、时间分辨荧光、或量子点等材料。

检测相微球：

检测相微球微球，其微球的粒径范围为50～1000nm不等。

其封装的荧光物质为彩色染料、荧光、时间分辨荧光、或量子点等材料。

实施例1：CRP单重检测

微球微流控测定装置，其样品槽深度范围为500μm，检测槽深度范围为500μm，控制槽深度范围为500μm，吸水槽深度范围为500μm。

固定相微球粒径为450μm，便于物理固定在检测槽内，选取灰度值为3000左右的微球，表面包被“抗-CRP第一抗体”，制成“固定相微球-抗-CRP第一抗体”复合物，与其它灰度固定相微球混合，滴加在检测槽内。

检测相微球粒径为200nm，选取488nm激发、535nm发射的荧光染料封装在微球内部。然后在微球表面包被“抗-CRP第二抗体”，制成“检测相微球-抗-CRP第二抗体”复合物，固定在检测槽上游的通道上。

分别使用0.5μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、300μg/mL的校准品5μL和45μL缓冲液混合，得50μL液，滴加在样品槽中，5min后用100μL缓冲液滴加在样品槽中冲洗后读数。选取灰度为3000左右的固定相区域，读取荧光值，其结果如下。

实施例2：CRP、PCT、D-Dimer三重检测

固定相微球粒径为450μm，便于物理固定在检测槽内。

选取灰度值为3000左右的微球，表面包被“抗-CRP第一抗体”，制成“固定相微球-抗-CRP第一抗体”复合物；选取灰度值为5700左右的微球，表面包被“抗-PCT第一抗体”，制成“固定相微球-抗-PCT第一抗体”复合物；选取灰度值为8900左右的微球，表面包被“抗-D-Dimar第一抗体”，制成“固定相微球-抗-D-Dimer第一抗体”复合物。

将3种固定相微球混合，滴加在检测槽内。

检测相微球粒径为200nm，选取488nm激发、535nm发射的荧光染料封装在微球内部。在微球表面包被“抗-CRP第二抗体”，制成“检测相微球-抗-CRP第二抗体”复合物；在微球表面包被“抗-PCT第二抗体”，制成“检测相微球-抗-PCT第二抗体”复合物；在微球表面包被“抗-D-Dimer第二抗体”，制成“检测相微球-抗-D-Dimer第二抗体”复合物。将3种检测相微球复合物混合，固定在检测槽上游的通道上。

分别使用0.5μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL、300μg/mL的CRP校准品5μL和45μL缓冲液混合，得50μL液，滴加在样品槽中，5min后用100μL缓冲液滴加在样品槽中冲洗后读数。选取灰度为3000左右的固定相区域，读取荧光值。

分别使用0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、50ng/mL的PCT校准品5μL和45μL缓冲液混合，得50μL液，滴加在样品槽中，5min后用100μL缓冲液滴加在样品槽中冲洗后读数。选取灰度为5700左右的固定相区域，读取荧光值。

分别使用1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL的D-Dimer校准品5μL和45μL缓冲液混合，得50μL液，滴加在样品槽中，5min后用100μL缓冲液滴加在样品槽中冲洗后读数。选取灰度为8900左右的固定相区域，读取荧光值。

其结果如下：

CRP

PCT

D-Dimer

Claims

1.一种基于特定尺寸微球和塑料基材的微球微流控检测技术，其特征是使用工程塑料基材并在上面制造孔道，并采特定粒径的微球做为固定相和检测相，可完成样本中特定分子的定性/定量检测。

2.根据权利要求1所述的塑料基材，以工程塑料为材料、通过注塑或压膜加工成型的基材，所述基材有添加样品区域，即样品槽；有荧光微球放置区域；有检测区域，即检测槽；有吸水区域，即吸水槽。

3.根据权利要求1所述的塑料基材中有荧光微球放置区域，沉积有“荧光微球——一抗”结合物探针；其中所述结合物探针具有与被检测物形成特异蛋白结合的特点。

4.根据权利要求1所述的塑料基材中有检测槽区域，放置有白色微球；其中所述白色微球表面偶联二抗(双抗体夹心法)，或所述白色微球表面偶联检测物(竞争法)。

5.根据权利要求1所述的塑料基材中有吸水槽区域，放置有吸水性材料。

6.根据权利要求1所述的固定相微球，其特征是20～1000μm微球，其材质为苯乙烯、乙烯基甲苯、甲基丙烯酸甲酯、羟乙基丙烯酸甲酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯、丙烯醛、氯甲基苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯等材质的聚合物或共聚物。其表面基团为氨基、羧基、醛基、磺酸基、硫酸基、环氧基、氯甲基、链霉亲和素不等。

7.根据权利要求1所述的检测相微球，其特征是50～1000nm微球，其材质为苯乙烯、乙烯基甲苯、甲基丙烯酸甲酯、羟乙基丙烯酸甲酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯、丙烯醛、氯甲基苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯等材质的聚合物或共聚物。其表面基团为氨基、羧基、醛基、磺酸基、硫酸基、环氧基、氯甲基、链霉亲和素不等。