CN109507422A - 基于聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片 - Google Patents

基于聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种光学微流控芯片，包括：芯片沟道层(3)，包括进样区(3‑1)、进样沟道(3‑2)、光学检测区(3‑3)、废液沟道(3‑4)及废液存储区(3‑5)，进样沟道(3‑2)内设有混溶微米结构(7)，废液沟道(3‑4)内设有至少一段时间控制溶解膜(8)，在光学检测区(3‑3)上设有荧光检测器件(13)，在光学检测区(3‑3)内设有捕获抗体/识别物(9)，在进样沟道(3‑2)进口设有标记抗体/识别物(10)；在芯片沟道层(3)两侧设有芯片底层板(1)及芯片上层盖板(2)，芯片底层板(1)由聚合物及多层金属纳米粒子修饰层(6)修饰而成。该芯片在检测时灵敏度高，不受入射光和多余荧光粒子干扰，且无需复杂泵阀等装置和设备，利于现场快速检测。

Description

基于聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片
技术领域
本发明涉及生物传感器检测技术领域，尤其涉及一种基于聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片。
背景技术
全内反射光学检测以及全内反射荧光检测，具有背景噪声低的优点，广泛应用于生物医疗检测。其中，全反射荧光技术是一种新型的光学检测技术，采用全反射产生的消逝场来激发荧光，使在入射光作用界面200纳米以内的荧光颗粒受到激发产生荧光，而入射光和多余的其它区域的荧光粒子不会对检测形成干扰，样品的颜色和浑浊度也对检测没有影响，因此，检测信噪比高。
而现有的检测技术存在一些缺点：仪器系统复杂昂贵，无法实现一步式检测，需要额外的加入试剂步骤，需要洗涤，从而无法实现即时检测(Point Of Care Testing，POCT)的应用，限制了应用场地和范围；检测速度慢，对于超低浓度物质无法实现快速现场检测；检测灵敏度低。
在光学传感检测技术发展中，高透明有机聚合物材料由于成本低、化学机械性能多样，已广泛应用于生物传感器光学微器件的研究和大规模制造。然而，聚合物的生物相容性差不利于酶和生物分子的固定化，因此，表面改性是聚合物微器件设计和修饰中的首要关键问题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明提出一种基于聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片，用于针对微量样品中低浓度物质的快速、灵敏、便捷检测需求，为解决现有检测方法的仪器设备复杂昂贵、不够便捷、检测步骤多、需要驱动泵等装置、检测速度慢等问题。
(二)技术方案
本发明提供一种光学微流控芯片，用于样品检测，包括：芯片沟道层3，包括进样区3-1、光学检测区3-3及废液存储区3-5，进样区3-1与光学检测区3-3通过进样沟道3-2连接，光学检测区3-3与废液存储区3-5之间通过废液沟道3-4连接，其中，进样沟道3-2内设有混溶微米膜7，废液沟道3-4内设有至少一段时间控制溶解膜8，在光学检测区3-3上设有荧光检测器件13，在光学检测区3-3内设有捕获抗体/识别物9，在进样沟道3-2的进口设有标记抗体/识别物10；在芯片沟道层3两侧设有芯片底层板1及芯片上层盖板2，将芯片沟道层3密封；其中，芯片底层板1由聚合物及多层金属纳米粒子修饰层6修饰而成，用于检测样品全内反射光信号的可选地，多层金属纳米粒子至少包括致密纳米粒子层6-1及疏松纳米粒子层6-2，致密粒子层6-1用于在全内反射中形成等离子激元信号，疏松纳米粒子层6-2用于在全内反射中形成光学信号放大热点。
可选地，光学微流控芯片设有两种激发模式：上层激发模式及下层激发模式。
可选地，致密纳米粒子层的厚度为40～50nm。
可选地，致密纳米粒子层6-1为单层致密例子排列或多层致密粒子层层组装排列。
可选地，时间控制溶解膜8的溶解时间为1～5分钟。
可选地，进样沟道3-2内设有亲水膜层，亲水膜层为亲水胶或表面活性剂或纳米材料。
可选地，芯片上层盖板2为透明材料，厚度为0.5～10mm。
可选地，疏松纳米粒子层6-2为圆形纳米粒子或尖角结构的纳米粒子。
可选地，致密纳米粒子层6-1及疏松纳米粒子层6-2为金纳米粒子或银纳米粒子。
(三)有益效果
本发明提出一种基于聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片，具有以下有益效果：
(1)采用在聚合物基底上共价修饰多层金属纳米粒子，增强光学的激发产生荧光强度，从而提高检测灵敏度，将聚合物芯片批量制备的优点和纳米增强效应结合，实现了微量样品超低浓度物质的一步式检测。
(2)采用多层金属纳米粒子的致密层全内反射放大效应与疏松层的纳米增强效应，与全反射荧光技术结合，不受入射光和多余荧光粒子干扰，有效排除了干扰。
(3)采用进样沟道区的混溶微米柱/微米盘/微米孔膜和废液沟道的时间控制溶解膜联合应用，实现特异生物材料多步反应的有效反应和时间控制，可有效提高反应的灵敏度。与全反射荧光模块技术结合，无需复杂设备和装置，利于现场快速检测。
附图说明
图1是本发明实施例多层金属纳米粒子修饰增强的全内反荧光检测原理示意图。
图2是本发明实施例聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片的结构示意图。
图3是本发明实施例本发明实施例聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片结构的俯视图。
图4是本发明实施例本发明实施例聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片的双激发模式示意图。
【附图标记】
1-芯片底层板
2-芯片上层盖板
3-芯片沟道层
3-1--进样区 3-2--进样沟道 3-3--光学检测区
3-4--废液沟道 3-5--废液存储区
6-多层金属纳米粒子
6-1--致密纳米粒子层 6-2--多层金属纳米粒子修饰层
7-混溶微米结构
8-时间控制溶解膜
9-捕获抗体/识别物
10-标记抗体/识别物
11-荧光复合粒子
12-待测抗原/待测物
13-荧光/荧光检测器件
14-入射光
15-全反射光
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明提出一种基于聚合物和多层金属纳米粒子修饰的光学微流控芯片，该光学微流控芯片结合表面官能团修饰技术及自组装技术进行多层金属纳米粒子修饰，实现光学信号的放大，可以无需洗涤，减少实验步骤，无需复杂的显微系统，无需泵阀装置，实现低浓度物质在芯片上的快速灵敏一步法检测，并且结合了磁荧光复合纳米粒子的微流控芯片不仅适用于蛋白分子等疾病标志物，也适用于核酸分子、异质体和细菌、病毒等物质的快速定量检测。该光学微流控芯片光学角度层采用高透明聚合物材料，具有全内反射的光学角度。光学微流控芯片材料选用高透明、高热学稳定性聚合物材料，如高透明塑料等，采用注塑成型或微注塑等工艺制备成型，采用微注塑方法可同时制备出微米量级的沟道和反应区。入射光区域为镜面光学平整度，可以采用上侧光束和下侧光束两种激发模式，两种不同光学模式都需要达到全内反射角度。
如图1-3所示，该光学微流控芯片包括：
芯片底层板1、芯片上层盖板2和芯片沟道层3，芯片底层板1及芯片上层盖板2设在芯片沟道层3的上下两侧，将芯片沟道层3密封。
芯片底层板1，由聚合物及多层金属纳米粒子修饰层6修饰而成。采用多层金属纳米粒子修饰层6修饰以增强光学检测信号，其中，多层金属纳米修饰层6至少为2层，接近基底层采用致密纳米粒子层6-1修饰，上层采用纳米粒子层6-2修饰。聚合物修饰为阳离子官能团和双效官能基团修饰方法实现纳米粒子的自组装高效修饰。芯片底层板1为透明聚合物材料，厚度在0.5～10毫米，采用微注塑、热压成型或者精密雕刻等技术制备。在芯片模具成型时，优选PE、PMMA等高透明、热胀冷缩效应小材料，入射光面光学平整度。
芯片上层盖板2，其为高透明材料，厚度优选为0.5～10mm，用于以获得最大的荧光检测信号，入射光以大于全反射角度入射，激发产生的荧光可以在光学检测区3-3的正上方或者正下方通过荧光检测器件13检测。在全反射和微流控作用下，入射光和多余的荧光粒子对检测没有干扰，因此，可以获得无干扰高灵敏光学信号。
芯片沟道层3，包括进样区3-1、光学检测区3-3及废液存储区3-5，进样区3-1与光学检测区3-3通过进样沟道3-2连接，光学检测区3-3与废液存储区3-5之间通过废液沟道3-4连接。进样沟道3-2内设有混溶微米膜7，废液沟道3-4内设有至少一段时间控制溶解膜8，在光学检测区3-3上设有荧光检测器件13，在光学检测区3-3内设有捕获抗体/识别物9，在进样沟道3-2的进口设有标记抗体/识别物10。进样区3-1的样品通过进样沟道3-2进入光学检测区3-3进行检测，检测完后的废液通过废液沟道3-4流入废液存储区3-5。
其中，芯片沟道层3可以采用微注塑、MEMS技术和材料制备，也可以采用高精度雕刻技术制备，或者采用微注塑、MEMS技术、高精度雕刻和热压成型几种技术协同制备以实现高精度流控的控制和反应检测区的高灵敏检测。在简易制备体系中，对边界要求精度大于10微米时，采用微注塑或者高精度雕刻工艺形成沟道层；对沟道要求不苛刻区域也可以直接采用热压成型或者常规灌注成型工艺制备沟道层。在高精密制备体系中，对边界精度要求小于10微米，采用微注塑、MEMS技术的负胶光刻工艺技术制备反应区域图形，以实现关键区域反应体积和面积的有效控制达到高精度检测，与雕刻工艺技术集成形成整个沟道区域的制备，实现高精度检测与成本控制的有效结合。微注塑制备工艺昂贵，但可以批量化制备高精度尺寸要求的芯片，一致性高。
其中，该光学微流控芯片还设有芯片光学角度层，采用高透明聚合物材料，具有全内反射的光学角度。
其中，官能团修饰：在芯片底层板1表面首先进行官能团等修饰，为纳米粒子的修饰提供可接枝的基团。可以采用安全无毒的强阳离子聚电解质或者双活性基团的官能团，在芯片底层板1表面形成正电荷，包括醛基、酚类、酯类官、烃类、烷基类、氨基、季胺型等官能团。这些官能团在生成化学键的同时可以与携带负电荷的金纳米粒子或其它贵金属离子形成均匀、稳定的自组装结合。多层金属纳米修饰：在官能团修饰基础上，首先进行金属致密纳米粒子层6-1修饰，可以采用金或银纳米粒子，粒子修饰厚度控制在40～50nm左右，这是等离子激发的优选厚度，可以采用单层致密粒子排列也可以采用多层致密粒子层层组装排列方式。通过优化官能团组合、pH和修饰密度，调节金胶粒子尺寸、浓度和pH，实现金纳米粒子颗粒大小均匀一致、稳定紧密排列。致密层修饰优选10nm、20nm、40nm金纳米粒子。在致密粒子层上进一步修饰疏松纳米粒子层6-2，该层纳米粒子可以采用常规圆形纳米粒子，也可以采用不规则具有尖角结构的纳米粒子，以实现光学信号的天线放大效果。疏松层纳米粒子层6-2可以优选采用金、银等贵金属纳米粒子。致密纳米粒子层6-1可以在全内反射中形成等离子激元信号，疏松纳米粒子层6-2进一步形成光学信号放大热点。光学检测区3-3的光输入输出区域是高度透明的。
其中，光学检测区3-3的基板为芯片底层板1一部分，采用至少两层金属纳米粒子修饰来获得光学信号增强效应，全反射光的激发效应基于2种模式，一种采用上层激发模式，对于致密金纳米粒子6-1的修饰厚度要求不严格。一种是下层入射激发模式，对于基底层的致密金纳米粒子6-1的修饰厚度要求严格控制在40～50nm范围。两种激发模式对于疏松金属粒子6-2的厚度和形状要求不严格。其中，光学检测区3-3还设有试剂固定区，试剂固定区域采用分离固定方法，并结合固体、液体分离固定方法，实现免疫夹心纳米粒子增强反应。
其中，芯片上层盖板2内上侧进行亲水处理形成亲水膜层，形成进样区和进样沟道均一的亲水界面，即进样沟道3-2内设有的亲水膜层。亲水膜层为亲水胶或表面活性剂或纳米材料，采用化学亲水修饰得到。该亲水膜层实现样品的顺利延展流动进样以防止样品进样的阻滞。进样沟道3-2进行微米级凸起或者柱状设计，以增加标记抗体复合物(标记复合物)与代检测物质的充分结合反应。等离子物理处理和化学亲水性修饰双效亲水处理修饰为微量样品自动进样流控提供基础和前提。
其中，混溶微米结构/膜7为微米柱或微米盘或微米孔，通过微注塑制备混溶微米柱/微米盘/或者固定上微米孔膜，用于实现标记试剂与待检测物质的充分混合和反应，控制预反应的时间。
其中，废液储存区3-5具有储液垫，防止废液外溢，避免对外部环境形成生物污染。废液沟道3-4采用弯道设计达到阻止样品过快离开反应检测区，以控制反应时间。同时，在废液沟道3-4进行专用时间可控式可溶性膜的修饰，设置时间控制溶解膜8，以进一步实现反应时间的控制，从而实现高灵敏检测。时间控制溶解膜8选用溶解时间在1～5分钟的膜材料，可采用多段式修饰以实现总反应时间的控制。
其中，采用干法共价固定修饰，将捕获抗体/识别物9牢固固定在光学检测区，与修饰的金属纳米粒子结合。采用干法/湿法固定将标记抗体/识别物10固定在进样沟道3-2的进口，其与金磁粒子和荧光分子结合形成标记抗体复合物以液态或者固态方式预存储于进样区或沟道区域，当待检测液体加入后，与检测液中待测物质结合。标记抗体/识别物10使用了试剂固定区的特异标记识别试剂进行标记，特异性标记识别试剂可以是抗体、核酸、适配体、凝集素等特异性识别生物材料。特异性标记识别试剂采用非共价固定等弱结合力方法已达到较容易的复溶效果和迅速反应。特异性标记识别试剂是特异识别材料与纳米荧光复合粒子11结合形成的复合物。荧光复合粒子11是外包被荧光纳米粒子或者直接包被荧光材料的复合微米粒子或者复合纳米粒子，以增加荧光检测效应和实现三维光学增强效应。荧光纳米粒子可以是多孔纳米粒子中结合镶嵌荧光分子材料。微米粒子/纳米粒子可以是金纳米粒子或者金磁复合粒子。荧光材料可以是无机荧光材料或者有机荧光材料或者是荧光量子点。无机荧光材料可以采用稀土离子发光及稀土荧光材料。有机荧光材料可以采用酞菁类和花菁类染料。
其中，荧光检测器件13置于光学检测区的上方或者下方，距离芯片的距离小于1厘米以实现荧光的精密检测，可以采用光电倍增管、二极管、CCD等实现紧凑便携式系统检测。荧光检测器件13可以采用光谱仪、显微系统实现高精度检测。检测时，入射光14可以采用单色光，也可以进行偏光前处理采用偏振光，入射光14进行准直处理，采用等于大于全反射角度，激发经夹心反应固定在界面区的荧光复合粒子，发出荧光，荧光被芯片上方或者下方的光学检测器件检测。因为入射光14、反射光15与荧光13在不同的角度，因此，入射光14和全发射光15不会对荧光的检测形成干扰。随捕获待测抗原/待测物12的浓度变化，在特定反应时间，荧光信号的强度与捕获待测抗原/待测物12的浓度正相关，光学检测信号经过专用软件处理分析，得到与浓度相关的数字信号
其中，检测样品可以是血样、尿液、唾液、体液等。采用免疫检测原理或者特异识别，适用于样品中含量低的待检物。在芯片上固定多种抗体/识别材料，可以实现一个芯片上一次检测多个指标。光学检测区3-3的捕获识别生物试剂采用共价修饰方法固定在反应检测区的多层纳米粒子层表面，可以采用阵列布局，利于固定入射光检测；也可以采用线性阵列，利于多参数检测。另外，光学检测区3-3同时也是样品反应、富集区和检测区，无需额外的洗涤步骤。当捕获待测抗原/待测物12进入光学微流控芯片中的光学检测区3-3后，通过上方或者下方荧光检测器件13(发光二极管、光电倍增管或CCD、CMOS)进行荧光光学检测，并且可以辅以反射光区域检测进行检测矫正，并进行浓度校正计算，从而得到待测物质的浓度。
下面描述基于光学微流控芯片的制作方法及采用上激发模式和下激发模式检测PCT(降钙素原，procalcitonin)的具体实施例。对于光学微流控芯片的具体结构，上面已做相应描述，在此不再赘述，只描述芯片相应制作方法及PCT检测过程。
实施例1(上激发模式)
芯片底层板1和芯片沟道层3采用微注塑成型方式一步成型制备，底层板厚度为0.5～10mm，优选采用PET和PMMA高透明聚合物材料，光学透明度和稳定性好，入射光线从侧下方光学面准直投入。微注塑成型技术兼顾光学面的平整度和沟道的微米级精度要求，在进样沟道区域实现微柱/微盘阵列结构，利于试剂的混溶反应和进样时间控制。入射斜面具备镜面级别的平滑度以实现入射光线的高效耦合输入和输出，凹槽入射角大于40度，入射光线采用600nm的单色光，可以进行偏振和准直化处理以实现高效输入和激发；反射区域也采用对应角度设计，保证全反光线的射出，避免多次全反射。
芯片上层盖板2采用高透明塑料通过精密机械工艺制备。对盖板内侧先采用亲水胶均匀涂敷形成具有高粘度的亲和界面，再采用表面活性剂吐温20低浓度活化处理，形成进样区和进样沟道均一的亲水界面，双效亲水处理修饰为微量样品自动进样流控提供基础和前提。在废液沟道进行专用时间可控性渐进性可溶性膜的贴附修饰，调节膜的长度和溶解度以实现反应时间的控制。
在基底表面首先进行官能团等修饰，为纳米粒子的修饰提供可接枝的基团。可以采用安全无毒的强阳离子聚电解质或者双活性基团的官能团，在基底表面形成正电荷，包括醛基、酚类、酯类官、烃类、烷基类、氨基、季胺型等官能团。这些官能团在生成化学键的同时可以与携带负电荷的金纳米粒子或其它贵金属离子形成均匀、稳定的自组装结合。将聚烯丙胺盐酸盐(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)依次吸附到PET芯片表面形成有羧酸盐(PET-CO2-)和铵(PET-NH3 +)官能团的基底表面。采用聚烯丙胺酰胺化法和聚乙烯醇吸附法在光滑PET表面引入胺基(NH2)和醇基(OH)官能团，为纳米粒子修饰提供接枝基团。
在官能团修饰基础上，首先进行致密金属纳米粒子修饰，可以采用金或银纳米粒子，粒子修饰厚度控制在40～50nm左右，这是等离子激发的优选厚度，可以采用单层致密粒子排列也可以采用多层致密粒子层层组装排列方式。通过优化官能团组合、pH和修饰密度，调节金胶粒子尺寸、浓度和pH，实现金纳米粒子颗粒大小均匀一致、稳定紧密排列。致密层修饰优选10nm、20nm、40nm金纳米粒子。加入0.5％的20nm的纳米金溶液，反应1小时，洗涤后，再进行官能团修饰，第二次加入0.05mg/ml的20nm的纳米金溶液，进行双层修饰，形成致密金衬底层，双层纳米粒子形成比单层更为致密的金基底层，利于下层激发式检测。在致密金粒子层上进一步修饰疏松纳米粒子层，该层纳米粒子可以采用常规圆形纳米粒子，也可以采用不规则具有尖角结构的纳米粒子，以实现光学信号的天线放大效果。在官能团修饰后，加入0.01mg/ml浓度的50nm的三角形金纳米粒子进行疏松层纳米粒子修饰，反应1小时，形成疏松纳米粒子层。致密粒子金衬底层可以在全内反射中形成等离子激元信号，疏松纳米粒子层进一步形成光学信号放大热点，在入射光激发下金属纳米粒子会产生增强局域光场。
在金纳米粒子修饰层上固定PCT捕获抗体，通过纳米喷印方式在表面上以点阵或线阵固定上单抗，在静止状态下让羊抗人PCT单克隆抗体溶液(10μg/ml)和金纳米修饰金衬底共孵育2小时，以让抗体连接到金衬底上。然后将多余抗体洗掉，干燥低温保存。
采用100nm银纳米粒子与亲和素修饰的高效异硫氰酸荧光素材料形成复合纳米粒子。纳米荧光复合粒子与PCT标记单抗(20μg/ml)共反应孵育2小时后，梯度离心，去除未结合抗体，重新复溶后分装于5微升的扁平微囊，粘附于进样沟道前端，芯片低温保存。选用小于200纳米银粒子以形成界面200纳米内的有效消逝场激发形成荧光，在界面上侧获得高效的荧光信号。
检测时，加入10微升样品到进样区3-1，样品在化学、物理双重亲水作用下流控下通过进样沟道3-2，进样过程中通过仪器设计上的针或锤将标记试剂微囊压破，标记抗体-荧光复合材料与样品中的PCT抗原混合，在微柱/微盘区域流动受阻，进一步加速混合和反应，形成“抗原-标记抗体-荧光复合”物，到达光学检测区3-3，“抗原-标记抗体-荧光复合”与捕获抗体结合，被捕获于芯片底板上，形成“捕获抗体-抗原-标记抗体-荧光复合”物，反应后，多余反应液体在废液沟道3-4的时间控制溶解膜8可控溶解的可控溶解状态下流至废液存储区3-5。如图4的激发模式一(A)所示，单色入射光14以大于全反射角入射至光学检测区3-3，激发捕获的荧光复合纳米粒子11发出荧光，纳米粒子的高比表面积有效提高荧光发光效率，降低光淬灭，形成的三维免疫夹心结构，形成局域等离子增强效应，有效增加光学灵敏度。上方荧光检测器件13采用光电倍增管或者CCD等检测荧光强度，利于整个检测装置的便携式集成，利于现场检测，荧光强度与待测物质浓度正相关。
实施例2(下激发模式)
芯片底层板1和芯片沟道层3采用微注塑成型方式一步成型制备，底层板厚度为0.5～10mm，优选采用PET和PMMA高透明聚合物材料，光学透明度和稳定性好，入射光线从侧下方光学面准直投入。微注塑成型技术兼顾光学面的平整度和沟道的微米级精度要求，在进样沟道区域实现微柱/微盘阵列结构，利于试剂的混溶反应和进样时间控制。入射斜面具备镜面级别的平滑度以实现入射光线的高效耦合输入和输出，凹槽入射角大于40度，入射光线采用600nm的单色光，可以进行偏振和准直化处理以实现高效输入和激发；反射区域也采用对应角度设计，保证全反光线的射出，避免多次全反射。
芯片上层盖板2采用高透明塑料通过精密机械工艺制备。对盖板内侧先采用亲水胶均匀涂敷形成具有高粘度的亲和界面，再采用表面活性剂吐温20低浓度活化处理，形成进样区和进样沟道均一的亲水界面，双效亲水处理修饰为微量样品自动进样流控提供基础和前提。在废液沟道进行专用时间可控性渐进性可溶性膜的贴附修饰，调节膜的长度和溶解度以实现反应时间的控制。
在基底表面进行功能聚合物官能团自组装修饰和金粒子修饰结合方法。首先进行官能团等修饰，为纳米粒子的修饰提供可接枝的基团。可以采用安全无毒的强阳离子聚电解质或者双活性基团的官能团，在基底表面形成正电荷，包括醛基、酚类、酯类官、烃类、烷基类、氨基、季胺型等官能团。这些官能团在生成化学键的同时可以与携带负电荷的金纳米粒子或其它贵金属离子形成均匀、稳定的自组装结合。利用含胺聚合物聚亚胺(PEI)进行表面处理的新方法，通过3mg/mL将PEI在静置状态与芯片PMMA表面反应区结合修饰1小时，形成氨基活化表面，为纳米粒子提供接枝表面基团。
在官能团修饰基础上，首先进行致密金属纳米粒子修饰，可以采用金或银纳米粒子，粒子修饰厚度控制在40～50nm左右，这是等离子激发的优选厚度，可以采用单层致密粒子排列也可以采用多层致密粒子层层组装排列方式。通过优化官能团组合、pH和修饰密度，调节金胶粒子尺寸、浓度和pH，实现金纳米粒子颗粒大小均匀一致、稳定紧密排列。致密层修饰优选10nm、20nm、40nm金纳米粒子。加入0.5％的20nm的纳米金溶液，反应1小时，洗涤后，再进行官能团修饰，第二次加入0.05mg/ml的20nm的纳米金溶液，进行双层修饰，形成致密金衬底层。在致密金粒子层上进一步修饰疏松纳米粒子层，该层纳米粒子可以采用常规圆形纳米粒子，也可以采用不规则具有尖角结构的纳米粒子，以实现光学信号的天线放大效果。在官能团修饰后，加入0.01mg/ml浓度的50nm的三角形金纳米粒子进行疏松层纳米粒子修饰，反应1小时，形成疏松纳米粒子层。致密粒子金衬底层可以在全内反射中形成等离子激元信号，疏松纳米粒子层进一步形成光学信号放大热点，在入射光激发下金属纳米粒子会产生增强局域光场。
在金纳米粒子修饰层上固定PCT捕获抗体，通过纳米喷印方式在表面上以点阵或线阵固定上单抗，在静止状态下让羊抗人PCT单克隆抗体溶液(10隆抗体溶液(米)和金纳米修饰金衬底共孵育2小时，以让抗体连接到金衬底上。然后将多余抗体洗掉，干燥低温保存。
采用100nm银纳米粒子与亲和素修饰的高效异硫氰酸荧光素材料形成复合纳米粒子。纳米荧光复合粒子与PCT标记单抗(20μg/ml)共反应孵育2小时后，梯度离心，去除未结合抗体，加入复溶助剂，重新复溶后滴加于进样沟道前端，干燥后，芯片低温保存。
检测时，加入10微升样品到进样区3-1，样品在化学、物理双重亲水作用下流控下通过进样沟道3-2，进样过程中复溶标记试剂，标记抗体-荧光复合材料与样品中的PCT抗原混合，在微孔膜区域流动受阻，进一步加速混合和反应，形成“抗原-标记抗体-荧光复合”物，到达光学检测区3-3，“抗原-标记抗体-荧光复合”与捕获抗体结合，被捕获于芯片底板上，形成“捕获抗体-抗原-标记抗体-荧光复合”物，反应后，多余反应液体在废液沟道3-4的时间控制溶解膜8的可控溶解状态下流至废液存储区3-5。如图4的激发模式二(B)所示，单色入射光14以大于全反射角入射至光学检测区3-3，激发捕获的荧光复合纳米粒子11发出荧光，纳米粒子的高比表面积有效提高荧光发光效率，降低光淬灭，形成的三维免疫夹心结构，形成局域等离子增强效应，有效增加光学灵敏度。上方荧光检测器件13采用光电倍增管或者CCD等检测荧光强度，利于整个检测装置的便携式集成，利于现场检测，荧光强度与待测物质浓度正相关。
综上所述，本发明提出了一种基于全反射荧光和多层金属纳米粒子基底修饰增强的光学自驱动微流控芯片，包括：芯片底层板、芯片沟道层和芯片上层盖板。其中，芯片底层板，采用透明聚合物材料，并结合功能聚合物自组装修饰及多层金属纳米粒子修饰以增强光学检测信号，多层金属纳米修饰层至少为2层，接近基底层采用金纳米粒子致密修饰，上层采用贵金属粒子的疏松修饰，采用阳离子官能团和双效官能基团修饰方法实现纳米粒子的自组装高效修饰。芯片沟道层包括进样区、进样沟道、试剂固定区、光学检测区、废液沟道和废液储存区光学检测区基板采用至少两层金属纳米粒子修饰来获得光学信号增强效应，本设计芯片的全反射光的激发效应适用于2种模式，一种是下层入射激发模式，对于基底层的致密金纳米粒子的修饰厚度要求严格控制在40～50nm范围。一种采用上层激发模式，对于致密金纳米粒子的修饰厚度要求不严格。两种激发模式对于疏松金属粒子的厚度和形状要求不严格。致密粒子层可以在全内反射中形成等离子激元信号，疏松纳米粒子层进一步形成光学信号放大热点。双层粒子的协同放大作用有效增加光学信号的灵敏度。其中进样区采用混溶微米柱/微米盘结构实现反应时间控制，并结合废液沟道区的时间控制溶解膜实现了对反应时间双重有效控制。其中试剂固定区：试剂固定区域采用分离固定方法，并结合固体、液体分离固定方法，实现免疫夹心纳米粒子增强反应；上层盖板采用高透明材料，以获得最大的荧光检测信号，入射光以大于全反射角度入射，激发产生的荧光可以在光学检测区的正上方或者正下方通过光学检测元件检测。在全反射和微流控作用下，入射光和多余的荧光粒子对检测没有干扰，因此，可以获得无干扰高灵敏光学信号。本发明基于有机材料基团修饰方法、纳米粒子沉积修饰和免疫夹心纳米粒子增强修饰方法，在光学传感器器件的生物材料固定和反应信号增强方面结合研究，研究制备高灵敏度、低成本的有机光学传感器器件。本发明的微流控芯片通过结合基底纳米粒子修饰的光学放大方法和全反射荧光光学检测技术，实现了样品的快速反应和分离，提高了灵敏度，简化了检测步骤，不仅降低了检测成本，还省去了采用常规检测所需要的样品浓缩和洗涤步骤，最重要的是不会受到浑浊样品和有色杂质的影响，有利于样品中低浓度样品的快速检测。将这些优势集中，从而实现一步式高精度的全内反荧光免疫检测。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光学微流控芯片，用于样品检测，其特征在于，包括：
芯片沟道层(3)，包括进样区(3-1)、光学检测区(3-3)及废液存储区(3-5)，所述进样区(3-1)与所述光学检测区(3-3)通过进样沟道(3-2)连接，所述光学检测区(3-3)与所述废液存储区(3-5)之间通过废液沟道(3-4)连接，其中，所述进样沟道(3-2)内设有混溶微米结构(7)，所述废液沟道(3-4)内设有至少一段时间控制溶解膜(8)，在所述光学检测区(3-3)上设有荧光检测器件(13)，在所述光学检测区(3-3)内设有捕获抗体/识别物(9)，在所述进样沟道(3-2)的进口设有标记抗体/识别物(10)；
在所述芯片沟道层(3)两侧设有芯片底层板(1)及芯片上层盖板(2)，将所述芯片沟道层(3)密封；其中，芯片底层板(1)由聚合物及多层金属纳米粒子修饰层(6)修饰而成，用于检测样品全内反射光信号。
2.根据权利要求1所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述多层金属纳米粒子至少包括致密纳米粒子层(6-1)及疏松纳米粒子层(6-2)，所述致密粒子层(6-1)用于在所述全内反射中形成等离子激元信号，所述疏松纳米粒子层(6-2)用于在所述全内反射中形成光学信号放大热点。
3.根据权利要求1所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述光学微流控芯片设有两种激发模式：上层激发模式及下层激发模式。
4.根据权利要求2所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述致密纳米粒子层的厚度为40～50nm。
5.据权利要求2所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述致密纳米粒子层(6-1)为单层致密粒子排列或多层致密粒子层层组装排列。
6.根据权利要求1所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述时间控制溶解膜(8)的溶解时间为1～5分钟。
7.根据权利要求1所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述进样沟道(3-2)内设有亲水膜层，所述亲水膜层为亲水胶或表面活性剂或纳米材料。
8.根据权利要求1所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述芯片上层盖板(2)为透明材料，厚度为0.5～10mm。
9.根据权利要求1所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述疏松纳米粒子层(6-2)为圆形纳米粒子或尖角结构的纳米粒子。
10.根据权利要求1所述的光学微流控芯片，其特征在于，所述致密纳米粒子层(6-1)及所述疏松纳米粒子层(6-2)为金纳米粒子或银纳米粒子。
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