CN101571536A - 单个纳米颗粒及其阵列基生物分子检测器的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明是基于生物分子对单个纳米颗粒局域化的表面等离子体共振效应的影响而开发的使用局域化的表面等离子体共振波谱检测生物分子的方法，解决对纳米颗粒的可控制备，定位定向、与微流控系统耦合以及对微流道内信号收集区进行优化的基础上，消除检测时的非特异性吸附和杂光信号。本发明包括使用气相沉积技术和微纳材料和结构的先进制备技术在微流体内制备可识别的单个纳米颗粒或颗粒阵列，根据需要将其集成在微流道内，进而将其表面修饰并功能化，并通过生物分子对纳米颗粒的局域化的表面等离子体共振效应的影响产生的光学信号而检测流体内生物分子的种类和浓度。从而在微流道内构筑成高产出的超敏感芯片基生物分子检测器。

Description

单个纳米颗粒及其阵列基生物分子检测器的制备工艺

技术领域

本发明涉及生物制剂和生物活性物质的诊断和检测，属生物医学领域。

背景技术

开发用于对疾病、新药发现、大规模蛋白质结构和功能、以及对环境中有毒的生物体(细菌、病毒等)和生物制剂的诊断和检测是一个非常重要的课题。从原理上讲，生物传感器是基于将生物配体和受体间耦合效应转换成可识别信号的信号转换器。近些年来，许多基于生物分子相互作用的信号转换方法被相继开发出来，如光学信号、辐射信号、电化学信号、磁信号、微力学信号、压电效应和质谱等。开发基于大规模微型仿生信号转换器序列使得我们能够在线即时对多个生物分子进行识别和追踪。近几年，由于快速、直观、低成本、高灵敏度和易于规模化集成并具多重平行检测能力的表面等离子体共振效应(SPR)信号转化器得到青睐，该技术可对材料局域环境的介电效应的变化产生快速而灵敏的响应，其检测精度可达10^-6mM/L，已被Biaco公司开发成高灵敏度的在线研究生物分子相互作用的仪器。为了进一步提高检测的灵敏度、靶向性、集成度和可计数性，在更小的空间获得对更多靶向目标的平行检测并达到或接近单分子的检测精度，需要开发基于单个纳米颗粒局域化的表面等离子体共振效应(LSPR)的单个纳米颗粒的生物分子检测器。和SPR生物传感器相比，其可以将来自单个特定纳米颗粒表面的微小折光指数和介电常数变化引起的具传播性的表面等离子体共振信号的改变转化成可直接检测的光谱信号，检测手段更加灵活、简单，虽然LSPR的折光指数敏感度(m)只有约2×10²nm/RIU(SPR为约2×10⁶nm/RIU，RIU：光辐射强度单位)，其特征电磁场衰减距离(l_d)只有约6nm，远低于SPR的约200nm。根据公式(i)，这个更短的特征电磁场衰减距离仍可赋予LSPR大的灵敏度。

$\mathrm{\Δ}{R}_{\max }=m(n_{\mathrm{dd}}-n_{\mathrm{blank}})\exp (-2d_{\mathrm{ad}}/l_d)\×(1-\exp (-2d_{\mathrm{ad}}/l_d))---\left(i\right)$

式中：ΔR_max是表面等离子体共振或局域化的表面等离子体反应信号变化，n_ad和n_blank分别是吸附上目标物质后颗粒的折光系数和未吸附上目标物质前周围环境的折光系数，d_ad是吸附层的有效厚度，l_d，颗粒的特征尺寸。

但是，由于缺乏对单个纳米颗粒的几何形貌(尺寸、形状)进行精确控制或昂贵的制备设备和复杂的工艺，特别是对制备的单个纳米颗粒进行定位和定向，如何在和微流控系统耦合时消除微流道内壁产生的微荧光和光散射等对收集的光信号的影响等问题，以及如何消除检测时的非特异性吸附等问题，使制备该类生物分子传感器仍具有很大挑战性，该类生物传感器目前仍处在研究阶段。

发明内容

本发明主要是在解决对纳米颗粒的可控制备、定位定向、与微流控系统耦合以及对微流道内信号收集区的结构和材料优化的基础上，消除检测时的非特异性吸附，开发一种可用于现场检测和鉴定生物分子的单个纳米颗粒基和颗粒阵列基微流控生物分子检测器，利用生物分子受体-配体对之间的耦合对纳米颗粒局域化的表面等离子体共振波谱位移的变化来检测生物分子，该方法的科学性和精确性也用原子力显微镜对模型生物分子检测前后颗粒厚度的测量进一步证实。

本发明提供一种单个纳米颗粒及其阵列基生物分子检测器的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在透明基材先镀上一层3-15纳米厚的铬层或氧化铟锡膜，在铬层或氧化铟锡膜上使用微制造技术将部分铬层或氧化铟锡膜选择性刻蚀掉，制备出多级微结构图案，在最后一级的模版结构中，制备出位置和形状不同的透明微窗口并标记；

(2)在上述透明微窗口内制备出不同形状、尺寸和表面形貌的纳米颗粒或颗粒阵列；通过由各级坐标标识的最后一级的透明微窗口以及微窗口的相对位置和形状，定位定向透明微窗口内纳米颗粒的坐标、位置和取向；

(3)在制备有纳米颗粒或颗粒阵列的微图案上通过微制造技术制备出微流道并用透明材料对其封盖，构筑微流道壁的材料为混合有消光或吸光作用颗粒的聚合物，消光或吸光作用颗粒用量为构筑微流道壁的材料质量的0.5％-10％；

(4)对封盖后微流道内的纳米颗粒或其阵列进行修饰，即修饰上一带活性基团羧基或胺基和消除非特异性吸附的羟基；然后通过碳亚二胺或双琥珀酰亚胺二酸酯耦联工艺活化该羧基或胺基，将生物活性分子耦联到纳米颗粒或其阵列表面，从而将纳米颗粒或其阵列进行生物分子功能化，形成单个纳米颗粒及其阵列基生物分子检测器。

本发明效果：本发明是基于对单个纳米颗粒或颗粒阵列局域化的表面等离子体共振效应随偶联上的生物分子种类和个数而产生的变化量进行检测，从而完成对生物分子的识别和浓度测定的。具定位作用的微窗口的设计可直接起到类似暗场聚焦镜的作用，可将检测器能耗降到很低，并可将入射光方向和检测器的检测方位根据颗粒的方位调节到最佳灵敏度位置(如光垂直入射于颗粒的横截面而使光波信号中的磁信号达到最强)；由于检测时可对颗粒进行定位定向，因此无论对自然白光还是具偏振方向的偏振光，颗粒均可被调节到最大灵敏度的方向和位置，因此被检测的颗粒无需激发，对光源无特殊要求，自然白光或偏振光均可，被检测信号也具有多样性。发明中独特的具消光和吸光作用的微流道器壁材料和被检区的结构设计，可将检测时的杂光尽量降低，提高被检信号的信噪比。使用单个纳米颗粒或颗粒阵列作为检测单元，可使检测器具有高的集成度和高输入输出特性。同时，这种由单个纳米颗粒或颗粒阵列构成的检测单元比连续薄膜型检测器，可尽可能地降低非异性吸附，具有高的靶向性和高的信噪比；由于单个纳米颗粒耦合上的分子数可计量，其灵敏度可准确地计量，可达到单分子或数个分子的精度。

附图说明

图1.通过微制造技术(紫外线刻蚀技术、X-光刻蚀技术、电子束刻蚀技、模版电镀技术或聚焦离子束刻蚀技术等)在玻片上形成用来定位定向纳米颗粒的多级规整排列的微窗口。1：第一级微图案阵列；2：第二级微图案阵列；3：最后一级微图案中的透明微窗口

图2.通过微纳米制备技术制备的和微流道系统耦合的单个纳米颗粒或颗粒阵列基生物分子检测器的制备工艺图。(a)通过纳米颗粒制备技术(电子束刻蚀、聚焦离子束刻蚀、纳米球模版刻蚀、模版电镀等)在多级微结构的最后一级微窗口内制备具有特定三维形貌的光子晶体或具有可控间距的颗粒阵列。(b)-(c)在该光学纳米颗粒或颗粒点阵上用光敏树脂构建一层微流道结构。(d)将制备有纳米光子晶体的微流道用具有光纤接口和对焦图案的透明盖片进行封盖。(e)对微流体内的纳米光子颗粒进行修饰和功能化，见反应式(1)-(5)。

4：基片，玻璃，有机玻璃(PMMA)、石英片、双向拉伸聚乙烯(BOPE)、双向拉伸聚丙烯(BOPP)等；

5：Cr或氧化铟锡(ITO)层，3-15nm；

6-a-6-b：纳米颗粒或颗粒阵列；

7：混有黑色微纳米颗粒的光敏树脂(如混有20nm-3μm炭黑的SU-8或混有20nm-500nm Fe₃O₄纳米颗粒的PMMA等)，高度约50-400μm；

8-a-8-b：构建的微流道；

9：带有光纤接口和对焦口的封盖用透明材料(玻璃片、石英片、BOPE、BOPP、PMMA等)，0.1-3mm；

10-a-10-b：光纤连接口和对焦口；

11：抗体或具有识别功能的生物分子，如抗体球蛋白IgG、IgM、L-选择素等、细胞膜溶素肽(LP)、黄体生成素释放激素(LHRH)、VEGF-C配体等。

图3.多通道高产出单个纳米颗粒或颗粒阵列基生物分子检测器检测用光路图。12-1-12-n：连有光导纤维的多重探测器窗口；13-1-13n：输送光信号的光导纤维；14：波谱分析仪，如局域化的表面等离子体共振波谱仪如Spectropro-150，表面增强的Ramann波谱仪、微型光纤波谱仪S2000等；15：来自暗场聚焦镜的自然白光或偏振光。

图4通过紫外光刻工艺制备的多级微结构中最后一级的一个微图案及在其内制备的纳米颗粒阵列。

图5.制备的微窗口内具有方位标志的纳米颗粒及颗粒阵列的微流道。

图6修饰前后、功能化前后和检测前后银纳米颗粒群的高度变化。

图7功能化的纳米颗粒的表面等离子体共振波谱在不同被检生物分子浓度下峰位随时间的变化。

图8耦合的生物分子(PrA)的浓度和产生的LSPR波峰位移的关系。

图9制备的单个三角形银纳米颗粒生物分子检测器中银的CCD和AFM图像。

图10制备的由三角形金纳米颗粒排列成两个六角形环构成的生物分子检测器的AFM(A)、CCD(B)和真实散射色(C)的图像，真实的蓝色已灰度化。

图11在微窗口内制备的近似棒状金纳米颗粒：a、b、c为该颗粒的AFM、CCD、真实散射色的图像(图中虚线所框)；d、e、f为a、b、c图像的部分放大。

图12用于大肠杆菌检测的由功能化的单个纳米铜颗粒构成的检测器的微流道的显微照片。

图13颗粒间具有强耦合效应的由三角形Au颗粒构成的多个六边形阵列的生物检测器的CCD图像(A)和部分颗粒的AFM图像(B)。

具体实施方式

其制备工艺包括：

(1)在透明基材(如玻璃，有机玻璃(PMMA)、石英、双向拉伸聚丙烯(BOPP)、双向拉伸聚乙烯(BOPE)等)先镀上一层3-15纳米厚的铬层或氧化铟锡膜，在其内使用微制造技术(如紫外线刻蚀技术、X-光刻蚀技术、电子束刻蚀技、模版电镀技术或聚焦离子束刻蚀技术)将部分铬层或氧化铟锡膜选择性刻蚀掉，制备可对纳米颗粒进行分辨的多级微图案，级数可根据所用仪器的探测视野和精度而定，一般通过3级以上就可将毫米的视野降到微米的视野。其中具有三级结构的微图案的结构见图1。(1)三级微结构的第一级微图案阵列，可有标记有X-Y坐标的多个同样的模块构成，通过将各个区用坐标系的数列标明可以很容易找到所要测量的下一层次的位置；该层次的尺寸a1可为10-50mm，其中的每一个黑色方块标识的单元尺寸为1-2mm。(2)三级微结构的第二级微图案阵列，在第一级的每一个单元内在被制备上可标记x-y坐标的多个同样的模块构成，其总尺寸(b1＝1-2mm)为组成第一级结构中各单元的尺寸，其内的模块尺寸可进一步减小，为50-200μm。(3)三级微结构的最后一级微结构可设计含有不同尺寸和形状的透明窗口并作标记，如R、L、P、T、S等，根据需要其尺寸可在3-10μm或300-800nm范围，然后通过各种纳米颗粒的制备技术(如电子束刻蚀技、模版刻蚀技术、模版电镀技术或聚焦离子束刻蚀技术)在这些窗口内制备出不同形状、尺寸和表面形貌的纳米颗粒或颗粒阵列。这样通过这些微窗口的相对位置、方向和形状就可以在不同仪器上鉴定同一个纳米颗粒的位置和方位。本发明中每个窗口中的同一颗粒均可通过LIGA工艺中的校准技术进行识别和定位(误差在30nm)，并在其上再集成封盖好的微流道(图2)，对微流道进行封盖的盖片上有标记好的光纤接口，可通过光纤将特定的纳米颗粒和检测器连接(见图3)。最后，颗粒的结构参数(包括尺寸、形状、取向、颗粒间距和厚度)便可以同其光学响应相关联了。

(2)使用气相沉积技术在石英片、玻璃片或透明的聚合物基片(图2：4)(如有机玻璃(PMMA)、双向拉伸聚丙烯(BOPP)、双向拉伸聚乙烯(BOPE)等)上的由铬层或氧化铟锡膜(图2：5)构成的多级微图案的最后一级的微窗口内沉积一层具有光学特性的材料(如金、银、铜、CdSe、InGa、GaAs，ZnO等)(见图2a)，并使用纳米颗粒的制备技术在微图案内制备不同形状和尺寸的纳米颗粒或颗粒阵列(图2：6a，6b)。

(3)在制备有纳米颗粒或颗粒阵列的微图案上通过紫外线光刻技术、X-光刻蚀技术或微模塑工艺制备上微流道(图2：8a，8b)并对其进行封盖，封盖的材料为透光性很好的BOPE、BOPP、PMMA、玻璃等(图2：9)，其上预先加工有连接光纤等连接部件的接口(图2：10a，10b)。微流道的构筑材料为光敏树指(如SU8、环氧丙稀酸等)或聚乙烯、聚丙烯、PMMA等，但其内混有强削光和吸光作用的填充物(如碳黑，黑色金属纳米颗粒Fe₃O₄、CoO、SiO₂、TiO₂等)的(图2：7)，通过检测混有不同填充物种类和浓度下构筑材料(制成0.2mm厚的薄片)的紫外-可见光波段的相对吸光度＞95％，确定的填充物浓度为作用构筑材料质量的0.5％-10％。

(4)对微流道内的纳米颗粒或其阵列进行修饰，反应式1是将一三角锥型纳米颗粒可控修饰上一带活性基团羧基(羧基硫醇)和消除非特异性吸附的羟基(羟基硫醇)。反应式2到3是通过碳亚二胺类偶联试剂(EDC，化学式可表示为R-N＝C＝N-R′，R、R′可以是烃基或氢，如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、丁二酰亚胺等)活化羧基，并即时将生物活性分子(如抗体球蛋白IgG、IgM、L-选择素等、细胞膜溶素肽(LP)、黄体生成素释放激素(LHRH)、VEGF-C配体等)耦合到纳米颗粒表面，从而将微流道内由铬或氧化铟锡薄膜构成的微窗口内的纳米颗粒进行生物分子功能化(图2：11)(反应式2-3)。

半球型纳米光子颗粒，如银、金、GaAs，GaIn等；三角锥型纳米光子颗粒，如银、金、铜、GaAs，GaIn等；

具有识别功能的生物分子，如抗体球蛋白IgG、L-选择素等、细胞膜溶素肽(LP)、黄体生成素释放激素(LHRH)、VEGF-C配体；

羧基硫醇；

胺基硫醇；

羟基硫醇。

反应式1中也可将羧基硫醇用胺基硫醇替换，用双琥珀酰亚胺二酸酯耦联(如双琥珀酰亚胺己二酸酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯DSS等)通过其分子上一个活化的羧基和胺基偶联，再通过另外一个活化的羧基将生物活性分子((如抗体球蛋白IgG、IgM、L-选择素等、细胞膜溶素肽(LP)、黄体生成素释放激素(LHRH)、VEGF-C配体等)耦合到纳米颗粒表面，从而将纳米颗粒进行生物分子功能化(反应式4到5)。

(5)将微流道中微窗口内功能化的纳米颗粒对入射光(图3：15)响应的光信号通过微流道封盖上的预留的光纤连接口(图3：12-1-12-n)通过光纤(图3：13-1-13-n)和检测器(如暗场显微波谱仪、表面增强的拉曼波谱仪、微型光纤波谱仪)耦合(图3：14)，通过记录经过微流道时耦联上的生物分子对纳米颗粒的光学特性的影响来检测溶液中生物分子的种类和浓度。如检测使局域化的表面等离子体共振-LSPR-波谱红移、蓝移和峰形状的改变；也可和拉曼光谱技术联合，通过检测该类生物分子对纳米颗粒的表面增强的拉曼光谱来鉴定溶液中生物分子的种类和浓度，但检测方法并不局限在这两种。其中使用颗粒的表面等离子体共振波谱为检测信号的检测方法简述如下：通过微流体泵将待检测的含有不同生物分子(如病毒、细菌、抗原等其它活性生物分子或化合物)的料液输入微流道并根据需要进行循环。光源为来自暗场聚光镜的自然白光或偏振光。光源照射到检测的微流道内的纳米光子颗粒，纳米光子颗粒吸收部分光子后通过表面等离子体共振发出不同波段的散射光，该光信号通过定位光纤被波谱分析仪收集并绘成谱图。当溶液内有和纳米颗粒功能上的抗体等生物活性分子相匹配的生物活性物质或化合物时，就会被纳米颗粒上的抗体类生物分子吸附或键合，引起纳米颗粒表面的介电性能的变化，从而使纳米颗粒表面环境的折光率发生变化，根据公式(i)，就会使收集到的表面等离子体共振散光波谱变化，根据波谱变化及变化大小就可检测出该类分子的存在与否及其在料液内的浓度大小。

实例1

通过紫外光刻技术制备的多级微结构，在最后一级的由10nm铬层构成的微窗口内通过纳米球模版刻蚀技术制备银纳米颗粒阵列(图4)。首先，用紫外光刻技术，将掩膜上的微图案转移到玻璃片上的铬层内，最后一级的几个微图案的暗场图像如图4A示，转录后的微窗口规则排列、清晰可辨。然后，通过使用纳米球模版刻蚀技术在特定微窗口内制备所需的纳米颗粒(断面示意如图2a)，图4B是通过纳米球(直径约1000nm)模版法在一圆形微图案(R)内，制备的边长为350纳米的三角型纳米银颗粒阵列的AFM照片，右边是虚线所框的颗粒的三维形貌图。图4C和4D是其相应的CCD照片和彩色光学照片(根据专利需要已灰度化，实际颗粒的颜色为橘红色)。通过对比光学显微镜和原子力显微镜(AFM)拍摄的图像可辨识每一窗口中的单个纳米颗粒及其方位，通过LIGA工艺的对焦功能就可将玻璃微纤接口和所需测定的纳米颗粒对准(图2和图3)。最后，所测颗粒的光学响应就可通过光纤与图3中的波谱检测仪关联起来。通过X-光刻蚀技术和紫外光刻蚀技术经图2中的b-d步骤在其上构筑上具有黑色消光流道壁的微流道(SU-8和50nm炭黑的混合物，炭黑含量1wt％)，图5是制备的在不同微窗口内具有规则六角形排列的纳米颗粒的多个并行的微流道的平面光学照片，微窗口内的颗粒尺寸可从20nm到500nm可调。

微流道构建好后，用带有玻璃纤维接口的玻璃片(图2：9)进行封盖，并将之和检测用微玻璃纤维(200nm内径)连接(图3)并密封。通过微流体泵将颗粒修饰和功能化料液逐步打入微流体内循环，进行1到3的反应，将其功能化上IgG(一种免疫球蛋白抗体)，然后将1.0wt％的聚乙烯醇(PVA)水相缓冲液打入微流道内将器壁羟基化，消除非特异性吸附。

我们以模型生物分子对来研究其对生物分子种类和浓度的检测作用。在多级微图案中通过微流体泵在低流速下循环(0.1mL/min)4个小时以上，利用浸渍法如反应式1将其修饰上一定量的活性羧基和抑制非特异性吸附的羟基。再通过碳亚二胺耦联剂(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)耦联上抗体IgG之后，整个微流道用PBS缓冲液保护，并在4℃封存。

为了证明其已被修饰和接枝上了所需的抗体IgG，进行一个对照试验。即在未构建微流道的纳米颗粒阵列上进行同样的修饰和功能化程序(反应1-3)，然后用AFM在湿态下检测修饰前后和功能化前后颗粒的高度。测定的统计结果如图6所示，颗粒的平均高度约32nm。通过修饰上巯基十二烷酸(12-MUA)和羟基癸硫醇，其高度增加了约3nm，而计算的12-MUA本身的高度约2nm，因此可以认为颗粒基本上修饰上了12-MUA单分子层。通过功能上IgG，颗粒的高度又增高了约8.5nm，和IgG的理论尺寸10nm接近，因此，可以认为基本上又耦联上了一层IgG单分子层。通过加入和IgG配对的抗体蛋白质A(PrA)和IgG耦联，耦联后的高度提高了3.1nm，基本上和PrA的理论尺寸3nm一致。

纳米颗粒经修饰和功能化并和微流体以及检测器连接集成后，就可以用其检测溶液中的活性生物分子。本发明中以检测和IgG配对的抗原蛋白质A(PrA)为例说明。通过用微流体泵打入不同浓度PrA的PBS缓冲液，通过循环来提高其耦联上的PrA量，直到饱和，同时不断测定锁定颗粒表面局域化的等离子体共振(LSPR)波谱。通过波谱的位移来检测其对浓度和循环时间的变化率。图7是其用来检测不同浓度时银纳米颗粒的表面等离子共振波谱在不同时间内的位移情况。开始期间，为稳定纳米颗粒的表面性能，先观测未加待检测溶液前，其LSPR波谱位移，直到其稳定。对该实验，其中一个纳米颗粒的反应如下。未加30nM的PrA溶液时，颗粒的LSPR波谱从629.7nm移到645.5nm稳定1小时不变。然后泵送30nM的PrA溶液，其LSPR波谱不断蓝移，其峰强度也不断下降，到34min后其维持在625.9nm保持1个小时基本不变，可以认为IgG与PrA的耦联反应已达饱和或平衡。可以算出，其浓度敏感度为：0.65nm/nM；其时间敏感性为：0.58nm/min；其时间浓度敏感性为0.02nm/(nM·min)。然后泵入300nM的PrA溶液，其LSPR波谱继续蓝移，LSPR散射光强度继续下降，到104min后。再经过1个多小时，其波谱基本不变，维持在561.6nm。可以看出，在该浓度下，其浓度敏感度为：0.213nm/nM；其时间敏感性为：0.61nm/min。由于纳米颗粒表面已被30nM的PrA溶液先饱和了，故其浓度敏感性有所下降。但由于浓度提高，其时间敏感性有所提高。从30nM的数据看，该类单个纳米颗粒的LSPR波谱的检测灵敏度为1.5nM/nm波长，因此其具有检测浓度为nM的生物分子的潜力。

通过对照试验，用AFM对检测的PrA溶液前后颗粒高度的表征(图6)可以看出，其高度也提高了约3.1nm，和理论的蛋白质A的尺寸(约3nm)也基本一致，充分说明了IgG对PrA的键合形式基本上是单分子层，这个数据也充分说明单个银纳米颗粒阵列作为生物分子检测器的潜力。

我们也用该系统使用局域化的表面等离子体共振波谱对其它浓度的蛋白质A进行了测定，其结果见图8。发现在低浓度下(小于60nM)，由于耦合产生的局域化的表面等离子体波谱位移(LSPR峰位移)和抗原(蛋白质A)的浓度基本成线形关系；当浓度高于60nM后，其表面等离子体波谱位移(LSPR位移)和抗原(蛋白质A)的浓度的关系变得不太敏感。因此，该类生物分子检测器具有低浓度敏感特性。目前用该尺寸的纳米颗粒，最低的检测浓度可到1-2nM左右。平均到单个纳米颗粒上，检测精度约为10-20个蛋白质A。

实例2

根据实例1中的方法，在石英片为基材的用3nm厚的氧化铟锡膜构成的微图案内通过聚焦离子束技术制备的散开得很好的三角型Ag纳米颗粒。确定其在多级微结构图案中的位置的光学CCD的照片和其尺寸大小的AFM的照片如图9A和9B所示。图9A的CCD图像中的白虚线所指的白点即为该颗粒，如图9B所示颗粒的AFM图像表明该三角锥形银纳米颗粒的边长约350nm。通过实例1的微流道制备工艺和反应工艺在其上构筑微流道，并将纳米颗粒修饰上胺基十二硫醇和羟基癸硫醇，使用DSS耦合剂通过反应(4)和(5)将该颗粒功能化上所需的生物活性分子IgG。微流道构筑材料为光敏环氧丙烯酸树脂和氧化钴纳米颗粒(粒径范围为15-30nm，含量5wt％)，封盖材料为厚度为3mm的BOPP。将抗原蛋白质A(PrA)配成23.5nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵打入制备有功能化的三角形银纳米颗粒的微流道中，其耦合上蛋白质A前后的LSPR波谱位移为16.7nm，基本和图8中的估计值15.0nm接近。

实例3

根据实例1中的方法，在2.54mm厚的双向拉伸聚丙烯(BOPP)由10纳米厚的铬膜构成的微窗口内通过电子束刻蚀技术制备出三角型Au纳米颗粒点阵，颗粒的边长为60纳米。其中典型的纳米颗粒点阵的AFM照片见图10A所示，其CCD照片见图10B，该纳米颗粒的散射光的真实颜色照片表明该颗粒发出蓝绿色光。使用模塑工艺制备微流道并在其上构筑微流道并将该颗粒功能化上所需的生物活性分子IgG，其中修饰工艺中将12-MUA替换成硫普罗宁(C₅H₉NO₃S，TP)。微流道构筑材料为聚丙烯和氧化铜纳米颗粒(粒径范围为10-50nm，含量10wt％)，封盖材料为1mm的BOPP。将抗原蛋白质A(PrA)配成60nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵打入制备有功能化得三角形银纳米颗粒的微流道中，其耦合上蛋白质A前后的LSPR波谱位移为22nm，基本和图8中的估计值15.0nm接近。

实例4

根据实例1中的方法，通过模版电镀技术制备由铬层构成的微窗口，在微窗口内通过聚焦离子束刻蚀技术制备出棒状Au纳米颗粒，其宽为30纳米，长为70纳米，厚度为20nm。其三维形貌的AFM照片和CCD及真实颜色图像如图11所示，该纳米颗粒的散射光的真实颜色照片表明该颗粒发出绿色光，并产生双峰，分别在502nm的弱峰和560nm的主峰。根据实例1的微流道制备工艺和反应工艺在其上构筑微流道并将该颗粒功能化上所需的生物活性分子细胞膜溶素肽(LP)，其中修饰工艺中将12-MUA替换成硫普罗宁(C₅H₉NO₃S，Tp)。微流道构筑材料为PMMA和氧化硅纳米颗粒(粒径范围为100-150nm)。将分离出的乳腺癌细胞膜表面的受体蛋白质(LP)配成100nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵打入制备有功能化得金纳米颗粒的微流道中，经20分钟，其耦合上蛋白质受体前后的在502nm处的LSPR波谱位移为14nm，在560纳米处的LSPR波谱位移为18nm，虽然其LSPR波谱位移比例3中的银纳米颗粒少，但仍可用之检测该浓度下的生物分子，且具有双峰检测和双验证功能。

实例5

根据实例1中的方法，但使用X-光刻蚀技术制备多级微结构，在最后一级微图案内通过电子束刻蚀技术制备出球形InGa纳米颗粒点阵，其直径为40纳米。使用波长为560nm的激光通过45度线偏振片后，照射该纳米颗粒，该纳米颗粒的散射光的真实颜色照片表明该颗粒发出橘色光，波长在602纳米处。根据实例1的微流道制备工艺和反应工艺在其上构筑微流道并将该颗粒功能化上所需的生物活性分子IgG，其中修饰工艺中使用12-MUA。微流道构筑材料为聚乙烯和氧化铁纳米颗粒(粒径范围为50-80nm)。将抗原蛋白质A(PrA)配成30nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵打入制备有功能化得InGa纳米颗粒的微流道中，使用微型光纤波谱仪(S2000，检测波长范围400-1600nm)检测其波谱峰位变化，经50分钟，其耦合上蛋白质A前后在602nm处的LSPR波谱位移为16nm，可用之检测低浓度下的生物分子。

实例6

根据实例1中的方法，在微窗口内通过电子束刻蚀技术制备出圆柱形InGa纳米颗粒阵列，直径为20纳米，厚度20nm。使用波长为560nm的线偏振光照射该纳米颗粒，该纳米颗粒的激发光的真实颜色照片表明该颗粒发出红色光，在612纳米处。根据实例1的微流道制备工艺和反应工艺在其上构筑微流道并将该颗粒功能化上所需的生物活性分子-对病变淋巴结具有特异性的L-选择素，其中修饰工艺中使用10-MUA和羟基己硫醇。微流道构筑材料为双向拉伸聚乙烯(BOPE)和四氧化三铁纳米颗粒(粒径范围为50-100nm，含量3wt％)。将病变淋巴细胞和正常淋巴细胞各配成10nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵分别送入制备有功能化的InGa纳米颗粒的微流道中，经20分钟，发现输送有病变淋巴结细胞溶液的微流道内的纳米颗粒612nm处的LSPR波谱红移为30nm；而只有正常淋巴细胞的纳米颗粒的LSPR红移只有3nm。可见该类生物分子检测器具有很高的靶向性。由于检测的生物分子体积大，其LSPR波谱位移比较大，可用之检测低浓度下的体积大的生物分子，如细菌。

实例7

根据实例1中的方法，在微图案内通过模版电镀技术制备出圆饼状GaAs纳米颗粒阵列，其直径为40纳米，厚20nm。使用波长为600nm的90度线偏振光照射该纳米颗粒，该纳米颗粒的散射光的真实颜色照片表明该颗粒发出红色光，使用表面增强的拉曼波谱仪测定其波峰位值，在620纳米处。根据实例1的微流道制备工艺和反应工艺在其上构筑微流道并将该颗粒功能化上所需的生物活性分子IgG，其中修饰工艺中使用12-MUA。微流道构筑材料为BOPP和氧化钛纳米颗粒(粒径范围为50-80nm，含量8wt％)。将抗原蛋白质A(PrA)配成20nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵打入含有功能化的InGa纳米颗粒的微流道中，使用表面增强的拉曼波谱仪测定其波峰位移，经40分钟，其耦合上蛋白质A前后的在620nm处表面增强的拉曼光谱波谱位移为16nm。由于检测的生物分子的浓度降低，其波谱位移比例6中的颗粒多，说明该类纳米颗粒对表面抗体抗原对的耦合更敏感，仍可用检测更低浓度下的生物分子。

实例8

根据实例1中的方法，在由ITO膜框成的微窗口内通过电子束刻蚀技术制备出棒状ZnO纳米颗粒阵列，直径为20nm，厚度为60nm。使用波长为540nm的激光照射该纳米颗粒，该纳米颗粒的激发光为黄色光，在570纳米处。根据实例1的微流道制备工艺和功能化工艺在其上构筑微流道并将该颗粒功能化上所需的生物活性分子黄体生成素释放激素(LHRH)，其中修饰工艺中使用Tp。微流道构筑材料为聚丙烯和氧化钛纳米颗粒(粒径范围为50-80nm，含量4wt％)。将乳腺癌细胞配成10nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵打入制备有功能化得ZnO纳米颗粒的微流道中，经30分钟，其检测到乳腺癌细胞后在570nm处的光谱红移了30nm。由于检测的生物分子的体积提高，对颗粒表面的介电性能影响比较大，和实例6一样，其LSPR波谱位移比较大。

实例9

根据实例8中的方法，在以2.54mm厚的双向拉伸聚丙烯(BOPP)为基片上由10nm厚的ITO膜框成的微窗口内通过电子束刻蚀技术制备出分得很开的棒状Cu纳米颗粒，直径为50nm，厚度为50nm。使用模塑工艺制备微流道并在其上构筑微流道，最后将该颗粒功能化上对大肠杆菌具有特异性的生物配体。微流道的构筑材料为具有消光作用的含3wt％炭黑(粒径50-100nm)的聚丙烯构成，封盖材料为厚0.2mm的BOPP。构成的微窗口内含分散很好的单个铜纳米颗粒的微流道如图12所示。将该微流道系统和暗场显微波谱仪相连就可用来检测溶液中是否含有大肠杆菌。将大肠杆菌配成20nM的溶液，然后泵送到微流道内循环，经过10分钟，铜纳米颗粒的LSPR从612nm蓝移到540nm，可见其对体积大的生物分子(如细菌)的灵敏度很高，LSPR波峰位移可达3.6nm/nM。

实例10

使用纳米球模版刻蚀技术在实例3中的微窗口内制备更多紧密排列的由三角形Au颗粒构成的六边形阵列，构成具有颗粒间电磁耦合效应的生物分子检测器。其中典型的纳米颗粒点阵的CCD照片见图13A，由于颗粒间的距离最远也只有190nm，三角形颗粒之间的尖尖距离均小于40nm，因此发生了很强的耦合效应，虽然单个的六角环上颗粒的颜色为蓝色，但经过很多六角环之间及颗粒将的耦合效应，其总体颜色均红移到粉红色，受到CCD照片的分辨率限制，很难将单个六角环分辨出来。其中扫描的部分颗粒的AFM照片见图13B，其颗粒边长约60nm，六角环内径约190nm。根据实例3中的工艺构建微流道并将该纳米颗粒阵列耦合上生物活性分子IgG，其中修饰工艺中将12-MUA替换成硫普罗宁(C₅H₉NO₃S，TP)。微流道构筑材料为聚乙烯和氧化铁纳米颗粒(粒径范围为10-50nm，含量5wt％)，封盖材料为1mm的BOPP。将抗原蛋白质A(PrA)配成20nM的PBS缓冲溶液，通过微流体泵打入含有功能化的三角形银纳米颗粒阵列的微流道中，其耦合上蛋白质A前后的LSPR波谱位移为30nm，其检测精度达到每纳摩尔浓度其LSPR波峰位移可到达2.0nm，比只有单个环的金颗粒的LSPR位移高出近4倍，这主要是由于颗粒将的电磁共振耦合效应的结果。

实例11

根据实例8中的方法，制备四组含纳米金颗粒的微流道。在以2.54mm厚的双向拉伸聚丙烯(BOPP)为基片上由10nm厚的ITO膜构成的微窗口内通过电子束刻蚀技术制备出分得很开的棒状Au纳米颗粒，直径为30nm，厚度为50nm。根据实例1中的方法，将IgG换成强生傲拓公司HCV抗体ELISA诊断试剂。将其中头两组微流道内的纳米金颗粒功能化上强生傲拓公司HCV抗体ELISA诊断试剂，另两组只用12-MUA和羟基硫醇进行修饰，两个微流道均用2wt％的PVA进行涂覆，消除非特异性吸附。将该微流道系统和暗场显微波谱仪相连就可用来检测病人血清中是否含有丙肝病毒。通过将含有40nM丙肝病毒的血清样品和未含有丙肝病毒的血消样品分别泵送到头两组含有功能上HCV抗体ELISA颗粒的微流道内循环；将含有40nM丙肝病毒的血清样品和未含有丙肝病毒的血清样品分别泵送到另外两组未功能上HCV抗体ELISA颗粒的微流道内循环。均循环10分钟，结果发现只有将含有40nM丙肝病毒的血清样品泵入含有功能上HCV抗体ELISA的颗粒的微流道时，金纳米颗粒的LSPR波谱发生了15nm，波峰从525nm红移到540nm；而其它微流道内的颗粒的LSPR波谱均只波动0.4-1纳米左右，可见由功能化上HCV抗体ELISA的LSPR基生物分子检测器对肝炎病毒具有很好的灵敏度和准确性。

Claims (1)

1.一种单个纳米颗粒及其阵列基生物分子检测器的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在透明基材先镀上一层3-15纳米厚的铬层或氧化铟锡膜，在铬层或氧化铟锡膜上使用微制造技术将部分铬层或氧化铟锡膜选择性刻蚀掉，制备出多级微结构图案，在最后一级的模版结构中，制备出位置和形状不同的透明微窗口并标记；

(2)在上述透明微窗口内制备出不同形状、尺寸和表面形貌的纳米颗粒或颗粒阵列；通过由各级坐标标识的最后一级的透明微窗口以及微窗口的相对位置和形状，定位定向透明微窗口内纳米颗粒的坐标、位置和取向；

(3)在制备有纳米颗粒或颗粒阵列的微图案上通过微制造技术制备出微流道并用透明材料对其封盖，构筑微流道壁的材料为混合有消光或吸光作用颗粒的聚合物，消光或吸光作用颗粒用量为构筑微流道壁的材料质量的0.5％-10％；

(4)对封盖后微流道内的纳米颗粒或其阵列进行修饰，即修饰上一带活性基团羧基或胺基和消除非特异性吸附的羟基；然后通过碳亚二胺或双琥珀酰亚胺二酸酯耦联工艺活化该羧基或胺基，将生物活性分子耦联到纳米颗粒或其阵列表面，从而将纳米颗粒或其阵列进行生物分子功能化，形成单个纳米颗粒及其阵列基生物分子检测器。

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