CN105015200A - 基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，包括：下层基板和上层盖板；形成于下层基板上表面、上层盖板下表面或下层基板与上层盖板之间的加样槽、反应通道、反应池、反应细通道、反应排气孔、标定槽、标定通道、标定池、标定细通道和标定排气孔，其中，加样槽通过被亲水处理的反应通道连通于反应池，反应池通过反应细通道连通于反应排气孔，标定槽通过被亲水处理的标定通道连通于标定池，标定池通过标定细通道连通于标定排气孔；以及形成于上层盖板且分别与加样槽、反应排气孔、标定槽及标定排气孔位置对应的开口；所述反应池的顶盖内侧预固定抗体-磁粒子，所述反应池的底侧通过纳米印章压印或者微纳点样预固定配对的特异识别单抗或者多抗。

Description

基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片

技术领域

本发明涉及生物传感器检测技术领域，是采用微流控技术、免疫技术和纳米磁粒子技术的一种基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片。

背景技术

即时检验(point-of-care testing，POCT)产品的发展经历了采用试条试纸的第一代定性检测，采用色板卡比色或半定量仪器阅读的第二代半定量，采用手工操作的第三代全定量系统，以及采用自动化信息化智能化的第四代技术平台。微流控(microfluidics)芯片是可以完成生物化学分析仪的微型芯片，可以实现对原有检验仪器微型化，制成便携式仪器，用于床边检验。

微流控技术是一种针对极小量流体进行操控的系统科学技术，是现代生物科学的一个重要信息采集和处理平台，为生命领域研究提供技术支撑和操作平台。微流控集成芯片不仅可以实现许多化学和一些传统生物学实验的自动化操作、检测与分析，而且可以大大减小样品、试剂和时间的消耗，极大地提高实验的通量，减少实验中废弃物的产生。更重要的是，集成微流控芯片不仅仅是简单地对传统意义上的化学或生物学实验进行微型化的集成，它还提供了一种全新的理念和技术平台，使得原先在传统的化学和生物学手段下很难完成或不能完成的某些实验能够得以顺利地实现。疾病诊断和药物研究随着微流控芯片技术的不断发展，渐渐发展成融合生物样本处理纯化、反应标记及检测等多个实验步骤的功能化生物芯片，从而扩大在疾病诊断和药物研究等领域的应用。但是，由于很多集成芯片外部的控制设备过于复杂，芯片附属的连接管道、移液附件、外置泵体等配件，大幅提高了芯片的费用，也使操作精细，难以在实验室外的场地推广应用。因此，需要设计制备不需要外加配件的集成芯片，简化芯片的操作，实现便捷应用，从而实现微流控集成芯片商品化和实用化。

结合磁珠分离的免疫检测技术，可以通过磁珠的分离效应，有效的捕捉到待测样品中的低浓度待测样品，结合荧光或者化学发光等检测方式，使检测灵敏度大幅度提高，通过磁场的转换，磁粒子的运动增加了捕获待测物的速度，检测速度也可以大幅提高。但是，由于需要洗涤等步骤去处未结合的废液，通常需要再进行缓冲液或者发光试剂等，需要多步骤操作，从而增加了检测的复杂度，不能实现一步检测，限制了检测场地和应用领域；因此需要在结合微流控技术方面进行新的检测方法等方面设计和优化，从而实现便捷的POCT检测。

S.F.Yang，B.Z.Gao，H.Y.Tsai and C.Bor Fuh，Detection of c-reactiveprotein based on a magnetic immunoassay by using functional magnetic andfluorescent nanoparticles in microplates，Analyst，2014，139，5576-5581.最新报道的集成微流控芯片，采用磁粒子荧光检测方法实现C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)的高灵敏检测(1μg/L～10mg/L)(10pM～0.1μM)，但是需要采用微泵分步加入粒子和各种反应试剂，此外需要洗涤步骤，不能实现一步检测。

C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是第一个被认为是急性时相反应蛋白，正常情况下含量极微量，在急性创伤和感染时其血浓度急剧升高。CRP是临床上最常用的急性时相反应指标。一般新生儿血清CRP水平小于2mg/L，大于此值即与细菌感染的严重程度有关；儿童和成人≤10mg/L；10～99mg/L提示局灶CRP检测对性或浅表性感染，≥100mg/L提示败血症或侵袭性感染等严重感染。于疾病的诊断无特异性，但其浓度上升是各种原因引起的炎症和组织损伤的敏感指标。在感染发生后4～6h开始升高，24～48h达到高峰，，峰值可谓正常值的100～1000倍。在感染消除后其含量急剧下降，一周内可恢复正常。病毒感染时，CRP不增高(除了一些严重侵袭导致组织损伤的病毒如腺病毒、疱疹病毒等)。临床上CRP一般作为鉴别细菌或病毒感染的一个首选指标，用于自身免疫性及感染性疾病的诊断和监测、抗生素疗效观察、辅助诊断新生儿期感染性疾病、监测病情变化以及术后感染等。超敏C反应蛋白(High sensitivity C-reactive protein)与CRP并不是两种蛋白，其实是根据测定方法的敏感性而命名。研究表明，hs-CRP≥2.0mg/L是中国人发生心血管疾病的有效预测因子。与心血管疾病一样，动脉粥样硬化在脑血管病的发病中也起重要作用，血清hs-CRP不仅是脑血管意外的预测因子，也是预后与评价疗效的指标之一。临床常规测定普通CRP的方法检测线性一般为3～200mg/L，因缺乏较高的灵敏性已不足以预测心血管事件的危险。近年相继采用胶乳增强的免疫比浊法等技术大大提高了分析的灵敏度(检测低限为0.005～0.10mg/L不等)，在低浓度CRP(如0.15～10mg/L)测定范围内有很高的准确度。用这些方法所进行测定的CRP称为高敏感(high-sensitivity)或超敏感(ultrasensitive)CRP。一般认为，我国健康人群hs-CRP水平的中位数范围为0.58～1.13mg/L。多数研究认为hs-CRP在3mg/L以下，冠状动脉事件发生危险较低。美国疾病控制预防中心(CDC)与美国心脏协会(AHA)建议，可根据hs-CRP水平对患者进行心血管病危险分类：即3.0mg/L为高度危险。目前CRP检测主要采用ELISA等方法，检测步骤多；采用POCT方法，主要是胶体金试条，在量化检测方面准确度不够。因此，迫切需要检测方便，准确度高的POCT产品。

为了实现样品的快速灵敏便捷的检测，在实现本发明的过程中，申请人发现上述现有技术存在如下技术缺陷：

(1)无法实现一步式检测，需要额外的加入试剂步骤，需要洗涤；这就无法实现POCT的应用；限制了应用场地和范围。

(2)多步检测反应，在每步操作中增加了误差，微泵进样控制差异会导致检测结果的偏差，并增加了检测的复杂性。

(3)微流控芯片缺少质控检测步骤，对于抗体的失活与否没有判定，容易导致漏检。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明针对血样等微量样品中低浓度物质的快速、灵敏、便捷检测需求，为解决现有检测方法的不够便捷和金标试条非定量化的局限性问题：1)目前检测针对血液样品中CRP及其更低浓度的蛋白类物质和细胞等时，需要多步操作，不适于快速的现场检测、床边检测等；2)多步检测反应，在每步操作中增加了误差，微泵进样控制差异会导致检测结果的偏差，并增加了检测的复杂性；3)金标试条的定量化检测不足。因此，本发明结合微流控技术和免疫磁富集分离技术，结合F-TIR光学检测，样品富集区和检测区提供了一种基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片。

(二)技术方案

为达到上述目的，本发明提供了一种基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，包括：下层基板和上层盖板；形成于下层基板上表面、上层盖板下表面或下层基板与上层盖板之间的加样槽、反应通道、反应池、反应细通道、反应排气孔、标定槽、标定通道、标定池、标定细通道和标定排气孔，其中，加样槽通过被亲水处理的反应通道连通于反应池，反应池通过反应细通道连通于反应排气孔，标定槽通过被亲水处理的标定通道连通于标定池，标定池通过标定细通道连通于标定排气孔；以及形成于上层盖板且分别与加样槽、反应排气孔、标定槽及标定排气孔位置对应的开口；其中：所述反应池的顶盖内侧预固定抗体-磁粒子，所述反应池的底侧通过纳米印章压印或者微纳点样预固定配对的特异识别单抗或者多抗。

上述方案中，所述反应池的底侧通过纳米印章压印或者微纳点样预固定配对的特异识别单抗或者多抗，纳米印章是通过MEMS工艺制备出与反应池尺寸匹配的PDMS印章。

上述方案中，所述纳米印章制备为A印章、B印章或者包含A、B两部分的全印章；采用A印章、B印章的组合，能够实现在反应池底侧固定两种不同物质的抗体，从而实现双参数检测。

上述方案中，所述纳米印章在单抗溶液中浸泡10～30秒，然后取出压印在反应池底侧，形成单抗的圆形阵列的修饰层。

上述方案中，所述修饰层能够减少试剂干燥过程中的边缘效应，提高均一性，更利于微量物质的光学检测。

上述方案中，所述修饰层能够进行洗涤和封闭步骤，具体是采用0.5g/LTween-20的PBS缓冲液洗涤一次，用10g/L BSA and 100g/L sucrose的PBS封闭剂进行1小时封闭处理，然后去除缓冲液，4℃低温密封干燥保存。

上述方案中，所述纳米印章底部制备出凸出的圆柱形微米阵列，微米阵列的凸出圆柱阵列的圆柱截面半径尺寸范围在50～500微米。

上述方案中，所述纳米印章印制形成的阵列为直径50～500微米的抗体液滴圆点排列成的阵列；阵列单元的数量在4～100之间。

上述方案中，所述反应池是圆形或者多边形，宽度尺寸范围在1～5毫米之间，深度范围在50～500微米之间。

上述方案中，所述磁粒子为200～5000nm的磁微纳粒子。

(三)有益效果

从上述技术方案可以看出，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，采用的磁微粒子免疫富集分离反应，有效提高了反应速度，简化了实验步骤，实现了一步式检测。

(2)本发明提供的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，采用的模板压印微型图形的修饰技术，可以提高修饰的一致性，减少了边缘效应，使结果准确度更高；可以通过A、B印章模式，方便地实现两种抗体的固定，可用来检测同一样品中的2种抗原物质。

(3)本发明提供的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，结构简单，采用简单步骤实验样品进样，避免了复杂阀或进样管等灌注进样操作，单向通道避免样品回流，简化检测，提高检测效率。

(4)本发明提供的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，采用简单的平行标定检测，提高了样本检测的有效性，避免漏检。

(5)本发明提供的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，采用简单的平行参比检测，有效排除背景干扰信号，提高了样本检测的准确性。

附图说明

图1示出了依照本发明第一实施例的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片的结构示意图。

图2示出了依照本发明第二实施例的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片的结构示意图。

图3示出了依照本发明第三实施例的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片的结构示意图。

图4示出了图1中稀释槽至加样槽之间单向通道的结构示意图。

图5示出了基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片中具有富集捕获区和检测区的双重作用的印章或者纳升点样反应池的结构示意图。

图6示出了制备基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片的工艺图。

图7A至图7D示出了检测反应原理的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

如图1至图3所示，本发明提出的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其包括：下层基板和上层盖板；形成于下层基板上表面、上层盖板下表面或下层基板与上层盖板之间的加样槽、反应通道、反应池、反应细通道、反应排气孔、标定槽、标定通道、标定池、标定细通道和标定排气孔，其中，加样槽通过被亲水处理的反应通道连通于反应池，反应池通过反应细通道连通于反应排气孔，标定槽通过被亲水处理的标定通道连通于标定池，标定池通过标定细通道连通于标定排气孔；以及该光学微流控芯片还包括形成于上层盖板且分别与加样槽、反应排气孔、标定槽及标定排气孔位置对应的开口。

其中，下层基板用来起支撑作用，采用长方形玻璃或者透明塑料，宽度一般为1～3厘米，长度一般为3～6厘米。

上层盖板可以采用PDMS材料或透明塑料材料(如PMMA等)制备，上层盖板尺寸等于或者略小于下层基板尺寸。上层盖板采用PDMS材料制备时可以采用MEMS负胶工艺，利用打孔机对上层盖板钻孔形成加样槽、反应排气孔、标定槽及标定排气孔及其开口；上层盖板采用PMMA材料制备时需要通过激光打孔或注模成型来形成加样槽、反应排气孔、标定槽及标定排气孔及其开口。

上层盖板可以采用PDMS或者透明塑料材料制备；分别与加样槽、反应排气孔、标定槽及标定排气孔位置对应的开口，都是在上层盖板上打孔形成。下层基板采用长方形玻璃或者透明塑料；加样槽、反应通道、反应池、反应细通道、反应排气孔、标定槽、标定通道、标定池、标定细通道和标定排气孔，如果形成于下层基板和上层盖板之间，则采用微加工技术；当然，加样槽、反应通道、反应池、反应细通道、反应排气孔、标定槽、标定通道、标定池、标定细通道和标定排气孔，也可以制备在下层基板的上表面，或者制备在上层盖板的下表面。上层盖板与下层基板的封装或者键合，根据材料的不同选择离子键合工艺或者粘贴方法。

反应通道和标定通道，均采用亲水设计，覆盖一层透明亲水膜层，以利于液体快速流过。反应排气孔和标定排气孔，其设计主要是为了使液体顺利流动到达反应池或标定池。反应池与反应排气孔之间的反应细通道的宽度窄于反应池与加样槽之间的反应通道的宽度，是其宽度的1/2或者更窄，其目的是为了使足够的样品液滞留于反应池进行反应和检测。同样，标定池与标定排气孔之间标定细通道的宽度窄于标定池与标定槽之间标定通道的宽度，是其宽度的1/2或者更窄，其目的是为了使足够的抗原液体滞留于标定池进行反应和检测。反应通道或标定通道宽度范围在50～2000微米之间，深度范围在50～500微米之间。

反应通道，其用来支撑和促使待测样品流动，并到达反应池，其可制备在下层基板上，采用激光雕刻等工艺制备反应通道，在下层基板制备反应通道时，由于在加样槽开口和通反应道处形成落差，更利于待测样品液流动；其也可制备在上层盖板的下侧，采用PDMS作为上层盖板时，通过MEMS负胶工艺在PDMS底层制备出反应通道，精度高；其也可通过双面胶经过激光雕刻工艺来制备，通过粘合将下层基板和上层盖板封合，形成反应通道，制备简单，但需要高精度的激光雕刻工艺。具体制备工艺可以参照图6所示。

标定槽，其底部固定有锥针，该锥针用以刺破预放置的含有已知浓度抗原液体的标定液储囊；标定液储囊，预放置于标定槽中，含有已知浓度的抗原液体。

标定池，用于对光学微流控芯片进行质控标定；采用按阀按压标定槽中预放置的标定液储囊，标定槽底部的锥针将该标定液储囊刺破，在按阀压力下，该标定液储囊中的抗原液体沿被亲水处理的标定通道流至标定池，对光学微流控芯片进行质控标定。

加样槽，用于加入待测样品，待测样品通过被亲水处理的反应通道流向反应池；加样槽开口又称为样品滴加孔，其底侧固定有高亲水性材料及高滤透材料，待测样品例如血液滴加于该区域后，经过玻璃纸材料过滤，血细胞留存于玻璃纸材料中，血清则进入加样槽并沿被亲水处理的反应通道流向反应池。

反应池，其顶盖内侧预固定抗体-磁粒子，而底侧通过印章压印或者微纳点样预固定配对的特异识别单抗或者多抗；待测样品中的待测物与反应池中的抗体-纳米磁粒子进行结合反应，并进一步在变换磁场的作用下，抗体-磁粒子在反应池中上下运动，增加了抗体-磁粒子与样品中待测物的接触，提高了反应结合速度，大大减少了反应时间；通过转换磁场还可以将多余的磁粒子吸附至反应池顶盖内侧，而与待测物结合的磁粒子则通过配对抗体结合作用固定在反应池底侧，待测物的浓度与最终被固定在反应池底侧的纳米磁粒子密度成正比。反应池可以是圆形或者长方形，宽度尺寸范围在1～5毫米之间，深度范围在50～500微米之间。磁粒子优选200～5000nm的磁微纳粒子。

反应池顶盖内侧修饰：单抗1-磁粒子固定在反应池顶盖内侧，通过滴加、涂敷等方式固定，功能化磁粒子的滴加量：0.1～1微升，磁粒子的粒径最优范围在200nm～2000nm；单抗1-磁粒子悬浮液优选(50g/L sucrose，50g/L BSA，PBS)，浓度优选：10g/L。

反应池底侧修饰：单抗2固定在反应池底侧，可以通过滴涂方式固定，也可通过微米印章来印制固定；微米印章是通过MEMS工艺制备出与反应池尺寸匹配的PDMS印章，印章底部制备出凸出的圆柱形微米阵列，微米阵列的凸出圆柱阵列的圆柱截面半径尺寸范围在：50～500微米；印章可以制备为A印章、B印章或者全印章(包含A、B两部分)；采用A印章、B印章的组合，可以实现在反应池底侧固定两种不同物质的抗体，从而实现双参数检测。印章在单抗2溶液中浸泡10～30秒，然后取出压印在反应池底侧，形成单抗的圆形阵列的修饰层，阵列的修饰层减少试剂干燥过程中的边缘效应，提高均一性，更利于微量物质的光学检测；阵列抗体修饰层可以进行洗涤和封闭步骤。采用0.5g/L Tween-20的PBS缓冲液洗涤一次，用10g/L BSA and 100g/L sucrose的PBS封闭剂进行1小时封闭处理，然后去除缓冲液，4℃低温密封干燥保存。

如图5所示，印章印制形成的阵列为直径50～500微米的抗体液滴圆点排列成的阵列；阵列单元的数量在4～100之间；有多个圆点组成的阵列形成的检测图像，一是可以有效排除单个圆点图像的误差；二是可以形成多种检测抗体的排列，利于样品中多参数的检测。

进一步地，本发明提出的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片还包括有稀释槽，通过单向通道连通于加样槽，稀释槽的底部固定有锥针，用以刺破预放置的缓冲液储囊，缓冲液储囊中的缓冲液用于在对高浓度待测样品检测时，稀释待测样品的浓度。在需要对待测样品进行稀释时，用按阀按压缓冲液储囊，稀释槽底部的锥针将该缓冲液储囊刺破，该缓冲液储囊中的缓冲液通过单向通道流入加样槽，稀释加样槽中的待测样品；该单向通道如图4所示，自稀释槽至加样槽通道宽度逐渐缩小，用于避免缓冲液回流，造成样品的浓度变化。对于包括有稀释槽的光学微流控芯片，其上层盖板还形成有与稀释槽位置对应的开口。

另外，反应池同时也是样品富集区和检测区，无需额外的洗涤步骤。本发明提出的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片可以有单个或者两个并列的完全相同的反应池，待测样品通过经过亲水处理的反应通道同时流向两个反应池，两个反应池可以检测2种不同的物质，也可以其中一个反应池用作参比池，如图3所示；反应池顶盖内侧预固定单克隆抗体1-磁粒子，而底侧预固定另一种抗原特异识别单抗或者多抗；待测样品中的待测物与反应池中的抗体-纳米磁粒子进行结合反应，并进一步在变换磁场的作用下，抗体-磁粒子在反应池中上下运动，增加了抗体-磁粒子与待测样品中待测物质的接触，提高了反应结合速度，大大减少了反应时间。通过转换磁场可以将多余的磁粒子吸附至反应池顶盖内侧，而与待测物结合的磁粒子则通过二抗结合作用固定在反应池底侧，待测物的浓度与最终被固定在反应池底侧的纳米磁粒子密度成正比。通过光学检测装置(发光二极管、光电倍增管或CCD)进行FTIR光学检测，并进行浓度校正计算，从而得到待测物质的浓度。

检测反应原理如图7A至图7D所示，磁富集和磁分离采用电磁场驱动的位于芯片反应池上方和下方的两个小电磁铁来实现，交替给予上下两个线圈电控制，实现磁场的快速变化，从而驱动磁粒子在反应池上下运动，加快反应速度；最终，上磁场驱动进行未反应磁粒子上浮，反应磁粒子吸附在反应池底侧，实现磁作用下样品分离。由于本发明的芯片反应池很小，同时为了避免产热，本发明采用1～10mm直径，2～10mm高度的微磁铁。也可以通过电磁阀控制的永磁铁进行磁富集和磁分离，分别置于芯片反应池上下两侧两个小型永磁铁，通过电磁阀控制实现靠近和离开芯片，实现磁粒子的上下扰动，从而实现磁富集和磁分离。

本发明提供的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，反应通道和标定通道采用毛细的反应通道和标定通道。反应通道或标定通道宽度范围在50～2000微米之间，深度范围在50～500微米之间。该毛细的反应通道和标定通道是通过激光雕刻双面胶和亲水胶而形成的。磁搅拌和毛细的反应通道和标定通道是该光学微流控芯片两个重要特点，在基于毛细管进样的作用下，实现样品液流的自动稳定(进样速度温和，无外力冲击)进入反应池，将反应池预固定的磁粒子充分复溶，保证了磁粒子不被外力冲出反应池，是一种自稳定状态的进样和反应体系。磁搅拌作用和磁分离作用结合SPR的特殊光学表面检测原理，实现了在一个区域(反应富集区和检测区)的反应、分离、检测一步式检测，避免了阀、泵等部件的应用和洗涤、分离等多步操作步骤，适用于多种样品的现场快速检测。

检测方法：待测样品可以是全血、血浆、血清或者唾液、尿液等。首先，将芯片放入检测仪，采用笔式定量移液器取定量待测样品(例如全血)10微升，加入加样槽，待测样品经过滤膜，滤掉细胞，在毛细管作用力和亲水效应下，同时按阀给予一定压力，待测样品流入反应通道，进入反应池；待测样品将反应池中的复合磁微粒子复溶于液体中，在外加变换磁场作用力下，抗体-磁粒子与待测样品中抗原迅速结合，形成抗原-抗体1-磁粒子复合物，复合物进一步与反应池底部的抗体2结合，形成抗体2-抗原-抗体1-磁粒子复合物，并被固定在反应池底侧，反应池底侧复合物的密度与抗原的浓度成正比。通过光学检测装置进行FTIR光学检测，并进行浓度校正计算，从而得到待测抗原物质的浓度。

实施例1

图1示出了依照本发明第一实施例的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片的结构示意图。如图1所示，该光学微流控芯片包括下层基板、上层盖板、标定槽、稀释槽、加样槽、通道、标定池、反应池、排气孔、按阀、储液袋、锥针。该微流控免疫芯片用于血样、尿样、唾液等生物样品中蛋白大分子等极低浓度物质的快速、灵敏检测。

其中，所述基于磁微粒子的微流控免疫芯片是基于MEMS技术、磁粒子富集分离技术、免疫技术和F-TIR光学检测原理制备的集成芯片。

其中，上层盖板采用MEMS技术制备的PDMS，通道、反应池和标定池都通过MEMS技术的SU8负胶成型模板制备在PDMS上层盖板的底面上，然后，通过打孔器形成稀释槽、加样槽、标定槽和排气孔。然后，对加样槽和反应池之间的反应通道进行亲水修饰，采用0.1％Triton X-100进行处理。对反应池和标定池的顶盖内侧进行Anti-C-CRP-磁微粒子和Anti-C-cTnI-磁微粒子混合物质的修饰，分别滴加0.5微升功能化磁微粒子，干燥4℃低温密封干燥保存。

下层基板采用玻璃基板，玻璃基板先进行清洗浸泡，去除表面油污杂质，吹干；然后进行等离子亲水处理，打氧30秒；然后将玻璃板卡放在打印有加样槽和反应池的图片上，在反应池位置进行亲水性修饰，滴加1微升聚赖氨酸，过夜放置后，冲洗一下，干燥；用预制备好的PDMS阵列点样印章A，浸泡于Anti-N-CRP缓冲液中10秒，取出立即压印在对应的反应池位置，干燥后，用1g/L Tween-20的PBS缓冲液洗涤一次去除未结合抗体；用预制备好的PDMS阵列点样印章B，浸泡于Anti-N-cTnI缓冲液中10秒，取出立即压印在对应的反应池位置，干燥后，用1g/L Tween-20的PBS缓冲液洗涤一次去除未结合抗体；然后用含10g/L BSA的PBS封闭剂进行1小时封闭处理，然后去除缓冲液；4℃低温密封干燥保存。

下层基板与上层盖板中间用不透明塑料部分保护后，进行等离子处理20秒钟，取出，立即取下局部保护膜，进行键合。

在稀释槽槽中心固定锥针，在加样槽中固定过滤材料。抗原储囊放置于标定槽，缓冲储液袋放置于稀释槽。然后，铝箔纸封装，4℃低温密封干燥保存。

需要检测时，取出芯片，取出按阀，加指血全血样2微升加样槽，按阀同时按压标定槽和稀释槽，标定槽中的抗原液释放并通过被亲水处理的标定通道流入标定池，稀释槽中的缓冲液释放并进入加样槽稀释待测样品，接着通过被亲水处理的反应通道流入反应池；然后将芯片放入检测仪，反应10分钟，在仪器机械装置转换和光学部件检测下，先检测标定池，再检测反应池，如果标定池中的试剂在有效范围内，则标定合格，显示反应池中的检测结果有效。

实施例2

图2示出了依照本发明第二实施例的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片的结构示意图。如图2所示，该光学微流控芯片包括下层基板、上层盖板、标定槽、加样槽、通道、标定池、反应池、排气孔、按阀、储液袋和锥针。相较于实施例1，本实施例中的光学微流控芯片不具有稀释槽。

下层基板、上层盖板都采用透明塑料板，通过热压成型技术制备，同时在上层盖板上形成标定槽、加样槽和加样排气孔、标定排气孔。

通道、标定池和反应池采用超薄双面胶制备，通过高精度绘图仪或者激光雕刻机雕刻出通道、标定池和反应池图形。将刻制后的双面胶贴附在底层，形成通道、标定池和反应池。通道上方可以覆盖亲水膜以形成亲水通道覆盖层，不仅可实现自动亲水毛细进样，而且可以避免反应池上层修饰时产生的无效溢流。将揭下的双面胶上层膜贴附于上层基板，用于反应池和标定池的定位和修饰。修饰步骤同实施例1。

生物材料修饰：标定槽：滴加1微升1nM的CRP抗原液体，干燥；反应池顶盖内侧：滴加磁粒子-抗体复合物，干燥；反应池底侧的抗体修饰采用非接触式点样仪进行喷点修饰，干燥后，用1g/L Tween-20的PBS缓冲液洗涤一次去除未结合抗体，然后用含10g/L BSA的PBS封闭剂进行1小时封闭处理，然后去除缓冲液，干燥。修饰完成后，将下层基板与上层盖板对准粘合，抽真空增加粘合度。铝箔密封，4℃低温密封干燥保存。

在储液槽中心固定锥针，在加样槽中固定过滤材料。缓冲液储囊放置于稀释槽。然后，铝箔纸封装，4℃低温密封干燥保存。

实施例3

图3是依照本发明第三实施例的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片的结构示意图，如图3所示，该光学微流控芯片包括：下层基板、上层盖板、储液槽、加样槽、通道、反应池、对比池、排气孔、按阀、储液袋和锥针。

下层基板采用透明塑料板，通过热压成型技术制备，上层盖板采用亲水单面胶材料，采用激光雕刻技术在该亲水单面胶材料上形成储液槽、加样槽、通道、反应池、对比池和排气孔。

通道、对比池和反应池采用超薄双面胶制备，通过高精度绘图仪或者激光雕刻机雕刻出通道、对比池和反应池的图形。将刻制后的双面胶贴附在底层，形成通道和反应池。将揭下的双面胶上层膜贴附于上层基板，用于反应池和对比池的定位和修饰。修饰步骤同实施例1。

反应池底层的抗体修饰采用非接触式点样仪进行喷点修饰，干燥后，用1g/L Tween-20的PBS缓冲液洗涤一次去除未结合抗体，然后用含10g/LBSA的PBS封闭剂进行1小时封闭处理，然后去除缓冲液，干燥。修饰完成后，将上下两层对准粘合，抽真空增加粘合度。铝箔密封，4℃低温密封干燥保存。

在储液槽中心固定锥针，在加样槽中固定过滤材料。按阀放置于储液槽，储液袋放置于加样槽。然后，铝箔纸封装，4℃低温密封干燥保存。

需要检测时，取出芯片，取出按阀，加指血全血样2微升加样槽，按阀按压储液袋，缓冲液通过释放出通过单向通道流入加样槽，按阀按压加样槽，促进残留样品进样，同时将加样槽覆盖，避免生物样品外流，减少或避免生物污染；然后芯片放入检测仪，样品流经通道，进入反应池和对比池，反应10分钟，对比池主要用于排除背景干扰作用，检测结果更为准确，显示检测结果。

本发明用了优选实施例进行说明，优选实施例只是为了说明的目的，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上可以对本发明作许多改进和改变。因此，在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不是上述的其它实现方式。例如：抗体抗原种类、具体胶材料种类、反应通道的制备方式等。所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，包括：下层基板和上层盖板；形成于下层基板上表面、上层盖板下表面或下层基板与上层盖板之间的加样槽、反应通道、反应池、反应细通道、反应排气孔、标定槽、标定通道、标定池、标定细通道和标定排气孔，其中，加样槽通过被亲水处理的反应通道连通于反应池，反应池通过反应细通道连通于反应排气孔，标定槽通过被亲水处理的标定通道连通于标定池，标定池通过标定细通道连通于标定排气孔；以及形成于上层盖板且分别与加样槽、反应排气孔、标定槽及标定排气孔位置对应的开口；其特征在于：

所述反应池的顶盖内侧预固定抗体-磁粒子，所述反应池的底侧通过纳米印章压印或者微纳点样预固定配对的特异识别单抗或者多抗。

2.根据权利要求1所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述反应池的底侧通过纳米印章压印或者微纳点样预固定配对的特异识别单抗或者多抗，纳米印章是通过MEMS工艺制备出与反应池尺寸匹配的PDMS印章。

3.根据权利要求2所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述纳米印章制备为A印章、B印章或者包含A、B两部分的全印章；采用A印章、B印章的组合，能够实现在反应池底侧固定两种不同物质的抗体，从而实现双参数检测。

4.根据权利要求2所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述纳米印章在单抗溶液中浸泡10～30秒，然后取出压印在反应池底侧，形成单抗的圆形阵列的修饰层。

5.根据权利要求4所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述修饰层能够减少试剂干燥过程中的边缘效应，提高均一性，更利于微量物质的光学检测。

6.根据权利要求4所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述修饰层能够进行洗涤和封闭步骤，具体是采用0.5g/L Tween-20的PBS缓冲液洗涤一次，用10g/L BSA and 100g/L sucrose的PBS封闭剂进行1小时封闭处理，然后去除缓冲液，4℃低温密封干燥保存。

7.根据权利要求2所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述纳米印章底部制备出凸出的圆柱形微米阵列，微米阵列的凸出圆柱阵列的圆柱截面半径尺寸范围在50～500微米。

8.根据权利要求7所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述纳米印章印制形成的阵列为直径50～500微米的抗体液滴圆点排列成的阵列；阵列单元的数量在4～100之间。

9.根据权利要求1所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述反应池是圆形或者多边形，宽度尺寸范围在1～5毫米之间，深度范围在50～500微米之间。

10.根据权利要求1所述的基于纳米印章固定单抗修饰层的光学微流控芯片，其特征在于，所述磁粒子为200～5000nm的磁微纳粒子。