CN109807345A - 一种光热转换点阵阵列芯片的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光热转换点阵阵列芯片的制备和应用，属于生物医学技术及工程领域。本发明制备的具有光热转换效应的多枝状纳米金颗粒应用于点阵阵列芯片，具有灵敏度高，性质稳定的特点，通过替换连接芯片金纳米颗粒上的抗体、酶、DNA、RNA等标记物，可用于多种物质或肿瘤细胞的识别和治疗，具有巨大的应用前景。

Description

一种光热转换点阵阵列芯片的制备和应用

技术领域

本发明涉及一种光热转换点阵阵列芯片的制备和应用，属于生物医学技术及工程领域。

背景技术

光热治疗(photothermal therapy，PTT)是近年来快速发展的一种新型肿瘤局部治疗方法，其原理是利用外源性光热治疗物质在肿瘤部位的高度富集，在近红外光(650～900nm)激发下产生光热效应(hyperthermia)，诱导肿瘤的急性坏死、细胞凋亡以及免疫反应等，从而实现对肿瘤的抑制作用。PTT治疗发挥疗效的关键在于肿瘤细胞内部的温度梯度变化和周围组织的变化。当温度在37～41℃范围内，可引起血流加速及细胞膜通透性增加；当温度在41～48℃过高热范围时，可引起蛋白质的折叠与变形、增加放化疗的敏感性以及不可逆损伤；当温度在48～60℃的条件下，在短时间内(5min左右)即可引起不可逆的损伤、严重而不可修复的蛋白质损伤及DNA的变形和损伤。表面等离子体增强是指吸附于特定纳米级粗糙界面的分析物结构信号被极大增强的一种现象，其增强机理已被证实为相邻纳米颗粒之间区域电磁场耦合形成表面电子云叠加“热点”，即“热点”效应。(“热点”：相邻金属纳米颗粒由于局域电磁场耦合而形成的分析物信号极大增强的区域)。等离子体增强“热点”效应的发现和“热点”基底制备方法的迅速发展，使得等离子体技术在化学、分析、生物等科学研究和应用工程领域均得到了广泛应用。近年来，研究表明相对于由二聚体及三聚体纳米颗粒形成的一维(1D)“热点”，二维(2D)、三维(3D)结构的等离子体“热点”增强阵列因其长程效应和热点数量的增多而使得总体等离子体信号大大增强，并且信号增强效应更加稳定、持久。虽然三维“热点”阵列具有独立的光散射和众多空间增强局域场，但由颗粒自组装形成的界面有序二维“热点”阵列因具有偏振光效应且易于实际操控和应用。

目前，缺乏2D等离子体“热点”增强检测靶向肿瘤细胞与光热治疗结合的技术，借助金纳米颗粒2D等离子体长程效应扩增现象，开发灵敏度高、靶向型光热转换阵列芯片器件。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种光热转换点阵阵列芯片的制备技术并将其用于靶向肿瘤细胞检测与癌症治疗。

本发明的目的是通过如下所述的技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供一种光热转换阵列芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)制备多枝状光热转化金颗粒黑体材料；(2)在亲水物质界面上制备微纳米点阵阵列；(3)将步骤(1)制备的金颗粒黑体材料沉降并键合到步骤(2)制备的微纳米点阵阵列表面，得到光热转换阵列芯片。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的金颗粒黑体材料的制备方法为：以Turkevich的方法制备固定尺寸的金种溶液，在室温剧烈搅拌的条件下，控制pH＝4.5～5.5，向金种溶液中加入摩尔比为1：(15～25)的硝酸银和抗坏血酸，反应8～12s。

在本发明的一种实施方式中，所述剧烈搅拌是在转速≥1000rpm的条件下进行搅拌。

在本发明的一种实施方式中，向金种溶液中加入100微升10mM硝酸银溶液和200微升0.1M的抗坏血酸溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)包括如下步骤：

(a)将微球溶液分散在芯片基底上，形成单层微球点阵，自然风干；

(b)将固定有微球点阵的亲水基底蒸镀铝膜；

(c)超声清洗，除去微球颗粒，制得表面具有微纳孔洞铝膜的芯片基底；

(d)对步骤(c)处理后的芯片基底表面硅烷化处理，使处理后的界面带正电荷；

(e)将纳米金材料滴在步骤(d)处理后的基底表面，获得点阵阵列芯片。

在本发明的一种实施方式中，所述芯片基底是玻璃片、硅片或半导体。

在本发明的一种实施方式中，所述蒸镀铝膜用于固定微球位置和排布形态。

在本发明的一种实施方式中，所述硅烷化改性是在真空环境下，于60～80℃蒸镀硅烷偶联剂(APTES)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)具体是：

A.玻璃片的清洗：将玻璃片间隔放入设计好的PT凹槽板，浸没在无水乙醇溶液中超声15-20min，再浸没在UPW中超声15-20min；

B.微球的清洗：在3500～2500rpm下梯度降速离心45s；

C.等离子发生器：玻璃片清洗后用N₂吹干，在等离子体中接通O₂后，等离子清洗20Min，随后，将玻璃片浸没于超纯水待使用；

D.微球的铺排：在玻璃片上滴加50微升浓度为2％的二氧化硅微球水溶液铺排后等待15min；

E.镀铝：用磁控镀膜系统对铺排微纳米球的固相基底镀铝，固定微球位置和排布形态，时间30分钟；

F.除去载体微纳米球：于超纯水中超声清洗10s，即获得点阵阵列玻璃基底，基底呈现碗状微纳米坑阵列形态；

G.在真空环境下，用Hot Plate Magnetic Stirrer将真空干燥器加热至70℃，干燥器底部滴加APTES液体以蒸镀APTES，对玻璃界面进行硅烷化改性，且结束后不立即打开阀门，等待温度冷却至室温。

在本发明的一种实施方式中，所述芯片的金纳米颗粒上连接抗体、酶、DNA或RNA。

本发明的第二个目的是提供一种多枝状金纳米颗粒，是按下述方法制备：将HAuCl₄溶液与柠檬酸三纳溶液混合，加热回流溶液15min，收集金种溶液，加入600ul的25mMHAuCl₄，50ul的1M的HCL，同时在剧烈搅拌下滴加100ul的10mM硝酸银和200ul0.1M的抗坏血酸反应10s。制备获得多枝状的金颗粒材料。

本发明的第三个目的是提供所述光热转换阵列芯片的应用。

本发明的第四个目的是提供一种检测方法，所述方法是将带有疾病标志物的癌细胞或者肿瘤细胞装载到所述光热转换阵列芯片上，经红外光线照射，并利用光学显微镜观察细胞活性变化。

本发明有如下的有益效果：

(1)本发明制备获得了一种具有光热转换效应的多枝状纳米金颗粒，该材料合成迅速，仅需反应10秒即可反应完成，而现有方法需合成数小时；

(2)本发明应用该纳米金颗粒制得的点阵阵列芯片，在微纳坑纳米颗粒聚集处具有等离子体增强特性，且合成的是多支状光热转化金颗粒材料，增大了灵敏度，使得后续与待测标记物连接更加容易。

(3)将本发明制备的芯片在室温条件下放置一个月后测试检测性能，结果显示，灵敏度几乎不发生变化，表明本发明制备的芯片性质稳定。

(4)本发明的芯片可以用于多种物质的检测，多种肿瘤细胞的识别和治疗，只需要替换连接芯片金纳米颗粒上的抗体、酶、DNA、RNA等，即可以制备得到各种不同靶向性的细胞或者金属离子、毒素、农药的检测芯片。

附图说明

图1：多枝状金颗粒材料的红外成像图；

图2：多枝状金颗粒材料猝灭碳量子点的荧光图；

图3：经过多枝状金颗粒材料修饰的电化学表征图；

图4：多枝状金颗粒材料的透射电镜表征图；

图5：金颗粒嵌合芯片的扫描电镜图；

图6：光热转换阵列芯片的制备示意图；

图7：CCK8测试细胞致死率的吸光度图；

图8：在明场下基片上HEPG2状态图。

具体实施方式

实施例1多枝状金颗粒材料的制备

按下述方法制备金种原液：在蒸馏装置中搅拌加入200ml的0.75mM的HAuCl₄溶液，一次性迅速加入155.2mM的柠檬酸三纳溶液5ml，溶液颜色迅速改变为深红色，继续加热回流溶液15min，收集金种溶液。在含有100ul金种原液的20ml水溶液中加入600ul的25mMHAuCl₄，50ul的1M的HCL，同时在搅拌转速为1800rpm的剧烈搅拌下滴加100ul的10mM硝酸银和200ul0.1M的抗坏血酸反应10s。制备获得多枝状的金颗粒材料。

将得到的金颗粒材料以三分钟每次，一次10微升的频率滴加到碳膜上制样，观察透射电镜(如图1)。经过980nm的激光器，红外热像仪进行测试，具有光热转换效应(如图2)。

在图1中，可观察到多枝状直径80nm左右的球形金纳米。在图2中，随着激光照射的时间加长，材料的温度成抛物线上升趋势，持续到照射十分钟，至温度最高点即32.5℃，说明此方法合成的金颗粒材料具有一定的光热效应。

实施例2金颗粒材料猝灭荧光碳量子点

将金颗粒材料和荧光碳量子点以1：1的比例在4℃下孵育12h，10000rpm离心10min,水洗3次，再测试荧光(如图3)。在图3中，金材料无吸收没有荧光，而仅仅荧光碳量子点带有荧光，强度为11125，金复合荧光碳量子点的荧光值为1360，降低了10倍，说明本发明方法制作的金颗粒材料具有猝灭荧光效应。

实施例3

本发明对玻碳电极进行了修饰金颗粒材料。

用0.5％的硫酸活化电极，电解液测定玻碳电极的信号，(K₃[Fe(CN)]₆ 0.0823g，K₄[Fe(CN)]₆.3H₂O 0.1056g，KCl 0.7455g)，清洗后，在玻碳电极上电镀沉积金颗粒材料，电镀时间为100s。通过裸电极(未修饰的玻碳电极)和修饰电极的CV响应来验证修饰后玻碳电极的灵敏性。如图4所示，裸电极显示的电流值为1.24E-4，而经过修饰金颗粒材料的电极显示电流值为5.6E-4，可见，经修饰的金颗粒材料具有增强电极灵敏性的特性，可使电极的灵敏度增强4-5倍，强于一般金材料的2～3倍。

实施例4制备光热转换阵列芯片

如图5所示，按照如下步骤制备光热转换阵列芯片：

(1)玻璃片的清洗：将玻璃片间隔放入设计好的PT凹槽板，浸没在无水乙醇溶液中超声15-20min，再浸没在UPW中超声15-20min。

(2)微球的清洗：将SiO₂微球在3500～2500rpm下梯度降速离心45s。

(3)将步骤(1)清洗后的玻璃片用N₂吹干，在等离子发生器中接通O₂后，等离子清洗20min，随后，将玻璃片浸没于超纯水待使用。

(4)微球的铺排：在步骤(3)处理后的玻璃片上滴加50微升浓度为2％的二氧化硅微球水溶液，铺排后等待15min；

(5)用磁控镀膜系统对铺排微纳米球的固相基底镀铝，固定微球位置和排布形态，时间30分钟；

(6)用超声于超纯水中清洗10s，即获得点阵阵列玻璃基底，此时，基底呈现碗状微纳米坑阵列形态。

(7)在真空环境下，用Hot Plate Magnetic Stirrer将真空干燥器加热至70摄氏度。干燥器底部滴加APTES液体以蒸镀APTES，进行玻璃界面硅烷化改性，且结束后不立即打开阀门，等待温度冷却至室温，获得点阵芯片。

(8)将实施例1制备获得的纳米金颗粒在6000rpm持续20分钟的离心浓缩两次，滴加500微升浓缩液在步骤(7)制得的点阵芯片上，经过5h的自然沉降和吸附作用，超声清洗半分钟除去杂质，对该芯片进行扫描，结果如图6所示。沉降的金颗粒之间间隔基本一致，金颗粒的排列规律。

实施例5光热转换阵列芯片检测HEPG₂细胞

应用实施例4制备的光热转换阵列芯片，连接上HEpG₂的特异性膜表面抗体anti-Glypican3antibody，用PEG封闭多余位点，将基片放置在培养有HepG₂的培养液中，培养10-15h后，经过PBS缓冲液的冲洗轻缓吹打，在明场显微镜下观察基片上的细胞形态，(如图8)为HepG₂细胞。用红外灯照射20s、30s、60s后测cck8的致死率(如图7)。

图7显示，照射时间从20s增加到60s发现随之时间的延长，细胞吸光度降低，细胞致死率也上升，说明红外光的照射转成的热量致死HepG2细胞。在图8中，在40倍明场下观察培养在金材料点阵的基片上的细胞，细胞被材料识别筛选图8中全为HepG2细胞。

实施例6

具体实施方式同实施例1，区别在于，金种原液的用量调整为80微升，氯金酸用量调整为400微升，氯化氢调整为40微升。

结果显示，本方法获得的效果得到的金颗粒枝更长更尖锐，且枝多而密集，有更多的被附着位点，增加了灵敏性和被检测物质的数量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种光热转换阵列芯片的制备方法，包括如下步骤：(1)制备多枝状光热转化金颗粒黑体材料；(2)在亲水物质界面上制备微纳米点阵阵列；(3)将步骤(1)制备的金颗粒黑体材料沉降并键合到步骤(2)制备的微纳米点阵阵列表面，得到光热转换阵列芯片；所述金颗粒黑体材料是在剧烈搅拌的条件下，用硝酸银和抗坏血酸还原HAuCl₄制备而成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是在20～25℃剧烈搅拌的条件下，控制pH＝4.5～5.5，向金种溶液中加入摩尔比为1：(15～25)的硝酸银和抗坏血酸，反应8～12s。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述剧烈搅拌是在转速≥1000rpm的条件下进行搅拌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括如下步骤：

(a)将微球溶液分散在芯片基底上，形成单层微球点阵，自然风干；

(b)将固定有微球点阵的亲水基底蒸镀铝膜；

(c)超声清洗，除去微球颗粒，制得表面具有微纳孔洞铝膜的芯片基底；

(d)对步骤(c)处理后的芯片基底表面硅烷化处理，使处理后的界面带正电荷或负电荷。

5.应用权利要求1～4任一所述方法制备的光热转换阵列芯片。

6.根据权利要求5所述的光热转换阵列芯片，其特征在于，芯片的金纳米颗粒上连接抗体、酶、DNA或RNA。

7.权利要求5或6所述的光热转换阵列芯片在生物、医学、农业、环境领域检测方面的应用。

8.一种肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，应用权利要求4或5所述的光热转换阵列芯片，将带有疾病标志物的肿瘤细胞装载到所述光热转换阵列芯片上，经红外光线照射，观察细胞活性变化。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述标记物包括但不限于特异性抗体。

10.一种制备多枝状光热转化金颗粒黑体材料的方法，其特征在于，在室温剧烈搅拌的条件下，控制pH＝4.5～5.5，向金种溶液中加入摩尔比为1：(15～25)的硝酸银和抗坏血酸，反应8～12s；所述剧烈搅拌是在转速≥1000rpm的条件下进行搅拌。