CN101216429A

CN101216429A - 一种sers生物探针及其制备方法

Info

Publication number: CN101216429A
Application number: CNA2008100556888A
Authority: CN
Inventors: 马占芳
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2008-01-07
Filing date: 2008-01-07
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2028-01-07
Also published as: CN100520366C

Abstract

本发明公开了一种SERS生物探针及其制备方法。本发明所提供的SERS生物探针，包括二氧化硅颗粒核心和所述二氧化硅颗粒核心表面上的金属纳米颗粒层，所述金属纳米颗粒层上连接有若干拉曼信号分子，所述金属纳米颗粒层外还形成有二氧化硅层，所述拉曼信号分子位于所述金属纳米颗粒层和所述二氧化硅层之间；所述二氧化硅层表面修饰有生物探针分子；所述金属纳米颗粒层为金纳米颗粒层或银纳米颗粒层。本发明提供的SERS生物探针具有广泛的普适性，将在生物分子(DNA分子、蛋白类分子)的识别检测、疾病的快速诊断、生物医学成像技术以及重大疾病的治疗、食品卫生、环境监测等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种SERS生物探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型的表面增强拉曼光谱(SERS)生物探针及其制备方法。

背景技术

激光拉曼光谱技术近年来成为研究生物分子结构常用的光谱手段，尤其在研究水溶液中蛋白质的结构和构象方面发挥了重要作用。拉曼技术在对生物样品的研究上主要具有以下优点：其一是能在分子水平上直接得到基团和化学键的信息以及微环境对生物样品结构的影响；其二是不破坏样品的结构，可用于水溶液体系的研究。基于这些特点，使其在生物体系的研究中占有重要的地位。然而，常规拉曼光谱的信号强度很低，限制了其在各个领域的应用。表面增强拉曼光谱(SERS)可使信号大大增强[S.R.Emory，S.M.Nie，Science 1997，275，1102.K.Kneipp，Y.Wang，et al.Phys.Rev.Lett.1997，78，1667]，这为拉曼光谱在生物方面的应用开拓了全新的局面。目前，解释SERS增强机理模型可以分为电磁增强机理和化学增强机理。电磁增强机理认为，当电磁波入射到金属表面时，由于金属表面的粗糙化，电磁波在金属表面发生表面等离子共振，使得表面电场大大增强，靠近金属表面的分子由于受到强大电场的影响而产生很强的拉曼散射。电磁增强是一种具有普遍性的增强机理，其增强因子一般为10⁴-10⁷[J.Phys.Chem.B 2003，107，9964；J.Phys.Chem.B 2000，10，11965； Phys.Rev.E 2000，62，4318.]。化学增强机理认为，金属与吸附分子在入射光的作用下发生电荷转移而产生电子共振，化学增强的作用一般较电磁增强的作用弱。由于制备简单、性质稳定易保存胶体，因此金作为一种常见的SERS增强基底被广泛应用在SERS检测中，同时由于胶体金与生物分子(DNA分子、蛋白类分子以及生物组织)具有很好的亲和性，常常作为标记物用于生物标记、识别和检测中。上世纪九十年代末，一系列免疫金标记技术以及DNA金标记技术[J.Am.Chem.Soc.1998，120，1959.]与SERS技术结合，发展出SERS标记技术[Langmuir 2003，19，4784；Anal.Chem.2005，77，3261；Science2002，297，1536.]。由于高的检测灵敏度，因此利用SERS标记技术进行生物分子(DNA分子以及蛋白类分子如抗体和抗原等)的SERS检测，尤其在免疫分析和DNA检测方面，受到了人们的关注。

使用SERS技术具有以下优点：(1)拉曼谱峰宽度通常比荧光光谱的谱峰宽度窄10-100倍；(2)拉曼散射受水的影响较小；(3)SERS信号很少受光致褪色的影响，所以可在一定程度上为获得较好的信号而适当地延长检测时间；(4)SERS拉曼信号分子不会象荧光标记物那样发生自淬灭，所以可以通过增加生物探针分子上拉曼信号分子的数量来增强SERS信号，提高检测灵敏度。目前的SERS研究，大多数都直接将拉曼信号分子与球形的金和银纳米颗粒构成的基底结合来增强拉曼信号[Science 2002，297，1536；Anal.Chem.1999，71，4903；Chem.Phys.Lett.1981，82，355.]，这种方法的缺点是：(1)必须使用金、银颗粒制备颗粒膜作为SERS的检测基底；(2)一个拉曼信号分子只能结合在一个分子上进行检测，很难实现多个拉曼信号分子同时结合在一个分子上进行检测，因此检测灵敏度受到很大的限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种SERS生物探针及其制备方法。

本发明所提供的SERS生物探针，包括：

二氧化硅颗粒核和在所述二氧化硅颗粒核表面上的金属纳米颗粒层；

所述金属纳米颗粒层上连接有若干拉曼信号分子，所述金属纳米颗粒层外还形成有二氧化硅层，所述拉曼信号分子位于所述金属纳米颗粒层和所述二氧化硅层之间；

所述二氧化硅层表面修饰有生物探针分子；

所述金属纳米颗粒层为金纳米颗粒层或银纳米颗粒层。

其中，优选的，所述二氧化硅颗粒核心的粒径为10-2000nm；所述二氧化硅层的厚度为1-500nm。优选的，拉曼信号分子为对巯基苯胺、对巯基吡啶、1，4-二巯基苯、巯基苯、4-甲基巯基苯、2-巯基萘。

本发明SERS生物探针的制备方法，包括如下步骤：

1)将表面官能团化的二氧化硅颗粒与金或银纳米颗粒在溶液中混和，使金或银纳米颗粒固定在二氧化硅颗粒表面，得到表面形成有金或银纳米颗粒层的二氧化硅颗粒；

2)将拉曼信号分子与步骤1)所得表面形成有金或银纳米颗粒层的二氧化硅颗粒进行反应，使所述拉曼信号分子连接于所述金或银纳米颗粒层上；

3)将经步骤2)处理的颗粒分散于乙醇中，加入氨水后，搅拌加入正硅酸乙酯的乙醇溶液，在所述金或银纳米颗粒层外形成二氧化硅层；

4)将经步骤3)处理的颗粒与生物探针分子反应，在所述二氧化硅层上连接所述生物探针分子，得到所述SERS生物探针。

常见的，表面官能团化的二氧化硅颗粒为表面氨基化的二氧化硅颗粒，表面巯基化的二氧化硅颗粒，表面醛基化的二氧化硅颗粒，或者，为表面吸附有与金或银纳米颗粒相反电荷的聚合电解质的二氧化硅颗粒。

其中，表面氨基化的二氧化硅颗粒按如下过程制备：将二氧化硅颗粒与氨基化溶液混和反应，即得到表面氨基化的二氧化硅颗粒；所述氨基化溶液选自聚乙烯亚胺、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷、聚合-2-乙烯吡啶、聚合-4-乙烯吡啶或3-氨基丙基-三甲氧基硅烷；

所述表面巯基化的二氧化硅颗粒按如下过程制备：将二氧化硅颗粒与巯基化溶液混和反应，即得到表面巯基化的二氧化硅颗粒；所述巯基化溶液选自3-巯基丙基-三乙氧基硅烷或3-巯基丙基-三甲氧基硅烷；

表面吸附有与金或银纳米颗粒相反电荷的聚合电解质的二氧化硅颗粒按如下过程制备：将二氧化硅颗粒与聚电解质溶液混和，即得到表面吸附有与金或银纳米颗粒相反电荷的聚电解质的二氧化硅颗粒；所述聚电解质溶液选自聚合阳离子和聚合阴离子；所述聚合阳离子包括聚苯乙烯磺酸盐、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸铵、聚丙烯酰胺、聚合-4-乙烯吡啶、聚合-2-乙烯吡啶；聚合阴离子包括聚苯乙烯磺酸盐，聚丙烯酰胺。

其中，二氧化硅颗粒的粒径为10-2000nm；所述金或银纳米颗粒的粒径为3-200nm。为了便于生物探针分子的固定，步骤4)中经步骤3)处理的颗粒与生物探针分子反应前，还经过氨基化或者醛基化或者巯基化处理。

本发明的优点在于：1)本发明SERS生物探针的核壳结构的夹心层载有很多的拉曼信号分子，将具有很强的SERS效应；2)通常的SERS方法，需要制备金、银颗粒膜作为SERS的检测基底，而使用本发明的新型SERS生物探针可以直接用于拉曼标记，就可以产生显著的SERS效应，可以省去制备金、银颗粒膜作为SERS检测基底的过程。

本发明的创新点在于：1)与普通的拉曼检测的单个拉曼信号分子标记分子相比，本发明SERS生物探针包含有多个的拉曼信号分子，这样本身就会具有很强的拉曼信号，而且这些拉曼信号分子处于二氧化硅层里面，这样会很好避免拉曼信号分子以及金、银纳米颗粒对检测分子可能产生的不良影响；2)二氧化硅层具有很好的生物相容性和成熟的修饰方法，容易实现生物分子的修饰；3)拉曼信号分子直接吸附在不同形状的金、银纳米颗粒的表面，在SERS检测过程中，二氧化硅里面的金、银颗粒层将起到表面增强拉曼信号的作用。本发明制备的SERS生物探针，可以解决普通SERS检测中存在的问题，而且省去了制备金、银颗粒膜作为SERS检测基底的步骤。利用本发明的新型SERS生物探针进行SERS灵敏生物检测，具有操作过程简便、检测灵敏度高等特点。本发明提供的SERS生物探针具有广泛的普适性，将在生物分子(DNA分子、蛋白类分子)的识别检测、疾病的快速诊断、生物医学成像技术以及重大疾病的治疗、食品卫生、环境监测等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明SERS生物探针的制备过程流程图。

图2利用金纳米棒制备的新型SERS免疫探针检测不同浓度的h-IgG的SERS谱图。图中曲线从下到上的顺序对应的h-IgG浓度依次为：空白、0.01、0.1、1、10、100ngmL^-1。

具体实施方式

与以前利用球形的金和银纳米粒子颗粒膜为基底进行SERS研究不同，本发明通过静电引力将不同形状(包括球形、棒状、三角形)的金、银纳米颗粒吸附在氨基化的二氧化硅颗粒表面，制备出稳定的金、银纳米颗粒的聚集体来增强拉曼信号，并在二氧化硅表面吸附的金、银纳米颗粒的核壳粒子(SiO₂@nano-Au、SiO₂@nano-Ag)上吸附拉曼信号分子，然后在吸附有拉曼信号分子的核壳粒子表面再形成一层厚度可控的纳米二氧化硅层，形成具有“三明治”结构的复合纳米颗粒(SiO₂@nano-Au@SiO₂/SiO₂@nano-Ag@SiO₂)，这样就可以将多个拉曼信号分子包裹在复合颗粒中的金、银纳米颗粒的“夹心层”，最后在复合颗粒的表面修饰抗体分子或者DNA探针分子，制备出可以用于SERS灵敏检测生物分子的新型SERS生物探针。本发明SERS生物探针的制备过程如图1所示，具体步骤如下：

1)利用现有的方法分别制备的二氧化硅(SiO₂)颗粒和不同形状(球形、三角形、棒状)的金、银纳米颗粒(nano-Au、nano-Ag)；

2)将二氧化硅(SiO₂)颗粒表面官能团化，如氨基化、巯基化、醛基化等，这些官能团化的方法可参考文献进行(Langmuir 2002，18，4915；Langmuir 1990，6，792.)。例如，氨基化可按照如下过程进行：将二氧化硅(SiO₂)颗粒与聚乙烯亚胺(PEI)(或者与3-氨基丙基-三乙氧基硅烷；或者与聚合-4-乙烯吡啶；或者聚合-2-乙烯吡啶；或者与3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)溶液混合，然后离心处理，即得到表面氨基化和巯基化的二氧化硅(SiO₂)颗粒二氧化硅颗粒，将所得颗粒分散在纯水中。或者在二氧化硅(SiO₂)颗粒表面吸附上与金或银纳米颗粒相反电荷的聚合电解质，可参考文献进行(Langmuir 2007，23，4606；Mater.Chem.Phys.2007，105，419.)。聚合电解质的种类包括聚合阳离子和聚合阴离子，聚合阳离子包括聚乙烯亚胺，聚丙烯酸铵，聚丙烯酰胺，聚合-4-乙烯吡啶，聚合-2-乙烯吡啶等；聚合阴离子包括聚苯乙烯磺酸盐，聚丙烯酰胺等。

3)将步骤1)制备的金、银纳米颗粒加入到步骤2)制备的表面官能团化或者表面吸附有与金或银纳米颗粒相反电荷的聚合电解质的二氧化硅(SiO₂)颗粒溶液中，使得金或银纳米颗粒固定在SiO₂颗粒表面，经离心处理后备用；

4)SERS生物探针的制备：在步骤3)制备的金或银纳米颗粒包裹的SiO₂核壳颗粒SiO₂@nano-Au或者SiO₂@nano-Ag的表面，吸附拉曼信号分子，然后再形成一层厚度可控的纳米二氧化硅层，形成具有“三明治”结构和拉曼信号分子的复合纳米颗粒(SiO₂@nano-Au@SiO₂或者SiO₂@nano-Ag@SiO₂)，这样就可以将多个拉曼信号分子包裹在复合颗粒中的金、银纳米颗粒的“夹心层”；最后在复合颗粒的表面修饰生物探针分子(DNA探针或抗体分子)，制备出可以用于SERS灵敏检测生物分子的SERS生物探针。

常用的，二氧化硅(SiO₂)颗粒可参照文献进行[J.Colloid Interface Sci.1968，26，62.]；不同形状(球形、三角形、棒状)的金、银纳米颗粒可参照文献进行[J.Am.Chem.Soc.1998，120，1959；Adv.Funct.Mater.2007，17，3295；Chem.Mater.2003，15，1957；Analyst 2003，128，686；Adv.Mater.2005，17，412.]。

步骤4)中，形成纳米二氧化硅层的方法可参照如下过程进行：将经步骤3)处理的颗粒分散于乙醇中，加入氨水调整体系的pH值在6-14后，搅拌加入正硅酸乙酯的乙醇溶液(0.1mmol/L-2mol/L)，所加正硅酸乙酯与二氧化硅颗粒的用量摩尔比为200∶1～1∶200，反应后在所述金或银纳米颗粒层外形成二氧化硅层；整个反应在5-80℃进行1小时以上。

可以用于本发明的拉曼信号分子有多种，只需要拉曼信号分子中含有巯基或者氨基即可，常见的有对巯基苯胺、对巯基吡啶、1，4-二巯基苯、巯基苯、4-甲基巯基苯、2-巯基萘。各种能与二氧化硅层良好修饰的生物探针分子均可以用于本发明，如DNA分子，抗体分子等。

实施例1、以金纳米棒为例制备新型SERS免疫探针：

1)参照文献(Chem.Mater.2003，15：1957.)的方法制备金纳米棒(Au_rod)；参考文献(J.Colloid Interface Sci.1968，26，62.)制备二氧化硅纳米粒子。

2)SiO₂@Au_rod的制备：将制备的二氧化硅颗粒105mg分散到1000mL无水乙醇中，在搅拌下加入3-氨基丙基-三甲氧基硅烷20mL，反应10min后，得到氨基化二氧化硅颗粒。向制备的金纳米棒颗粒溶液中加入1.8mol/L的PVP溶液30mL，20min后离心，并将其加入到氨基化的SiO₂中1min，然后将反应液离心分离，用纯水和乙醇洗涤超声再离心除去过量的PVP，这样金纳米棒被固定在二氧化硅的纳米球上。

3)拉曼信号分子(例如对巯基苯胺，4-ATP)在SiO₂@Au_rod粒子表面的固定：将1.5mol/L的4-ATP溶液，加入到SiO₂@Au_rod溶液中，搅拌反应10min，然后离心清洗去除多余的4-ATP。

4)具有“三明治”结构的带有拉曼信号分子的复合纳米颗粒(SiO₂@Aur_od@SiO₂)的制备：将步骤(3)制备的颗粒分散到乙醇溶液中，将25％的氨水1mL加入其中，在搅拌下，将正硅酸乙酯的乙醇溶液(10mmol/L)滴加入混合溶液中，反应1h后，就可以得到SiO₂壳并在“夹心层”带有拉曼信号分子的复合纳米颗粒SiO₂@Au_rod@SiO₂。不同量的正硅酸乙酯可得到不同厚度的SiO₂壳，如：使用200μL、300μL和400μL的正硅酸乙酯乙醇溶液的情况下，所得SiO₂壳厚度分别为20nm、25nm和32nm。

5)复合纳米颗粒SiO₂@Au_rod@SiO₂的氨基化：将步骤(4)制备的复合纳米颗粒浸入30％的聚乙烯亚胺溶液中反应5min，然后将颗粒离心处理。

6)将步骤(5)处理的复合颗粒，分散在磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)中，然后加入5％的戊二醛溶液反应1h，经过离心分离处理后，分散在pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中备用。

7)新型SERS免疫探针的制备：将经过步骤(6)处理的复合颗粒，加入到抗人IgG溶液(浓度为300μgmL^-1)中反应6 h，反应后离心处理，再用牛血清白蛋白溶液处理SiO₂@Au_rod@SiO₂复合颗粒，然后离心处理并分散在pH值为7.0的Tris/HCl缓冲溶液中，4℃下保存备用，得到可以用于SERS检测的SERS免疫探针。

利用金纳米棒制备的SERS免疫探针进行SERS检测人IgG(h-IgG)：

(1)将玻璃片浸入浓硫酸和双氧水混合液溶液(98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝4∶1(V/V))中，然后用纯水充分清洗。

(2)将步骤1)处理后的玻璃片浸入聚乙烯亚胺溶液中，然后将基片用纯水冲洗，备用。

(3)将步骤2)处理后的玻璃片，浸泡于戊二醛溶液中反应中，然后用水淋洗，备用。

(4)将步骤3)处理的玻璃片浸入羊抗人IgG溶液中反应，然后用磷酸缓冲溶液(pH＝7.6)清洗，并用L-赖氨酸或者牛血清白蛋白处理玻璃片，之后用去离子水淋洗，放在pH值为7.0的Tris/HCl缓冲溶液中保存待用。

(5)将步骤4)处理的玻璃片，用上述不同浓度的人IgG溶液制备得到的SERS免疫探针进行处理，用磷酸缓冲溶液(pH＝7.6)清洗后，用于SERS检测。

不同浓度h-IgG的SERS检测谱图参见图2，图中曲线从下到上的顺序对应的h-IgG浓度依次为：空白、0.01、0.1、1、10、100ng mL^-1。结果显示，本实施例所得SERS探针对人IgG的检测限为10 pg/mL。

实施例2：

以三角银纳米颗粒为例制备新型SERS免疫探针：

除参照文献(Adv.Mater.2005，17，412.)制备三角银纳米颗粒代替金纳米棒颗粒以外，其余的制备过程与实施例1相同。

利用三角银纳米颗粒制备的SERS免疫探针进行SERS检测人IgG(h-IgG)：

除利用三角银纳米颗粒制备的SERS免疫探针代替利用金纳米棒颗粒制备的SERS免疫探针以外，其余的检测过程与实施例1相同，结果显示，对于人IgG的检出限达到了15pg/mL。

实施例3：

以球形金纳米颗粒为例制备新型SERS免疫探针：

除参照文献(J.Nanosci.Nanotech.2007，7，712.)制备球形金纳米颗粒代替金纳米棒颗粒以外，其余的制备过程与实施例1相同。

利用球形纳米颗粒制备的SERS免疫探针进行SERS检测人IgG(h-IgG)：

除利用球形金纳米颗粒制备的SERS免疫探针代替利用金纳米棒颗粒制备的SERS免疫探针以外，其余的检测过程与实施例1相同，对于人IgG的检出限为30pg/mL。

实施例4：

模型寡核苷酸分子如下：

探针1：5’-TCTCAACTCGTATTTTTT-(CH₂)₃-NH₂-3’

探针2：5’-H₂N-(CH₂)₃-TTTTTTCGCATTCAGGAT-3’

靶标DNA：5’-TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG-3’

以金纳米棒为例制备SERS寡核苷酸探针：

参照实施例1中步骤(1)——步骤(5)的制备过程，SERS寡核苷酸探针的制备，即步骤(6)操作如下：将经过步骤(5)处理的复合颗粒，加入探针1溶液(浓度为1μmol/L)进行反应2 h，然后离心处理，再用牛血清白蛋白溶液处理SiO₂@Au_rod@SiO₂复合颗粒，然后离心处理并分散在pH值为7.6的磷酸缓冲溶液中，4℃下保存备用，得到可以用于SERS检测DNA分子的SERS寡核苷酸探针。

利用金纳米棒制备的SERS寡核苷酸探针进行SERS检测DNA分子：

1)将玻璃片浸入浓硫酸和双氧水混合液溶液(98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝4∶1(V/V))中，然后用纯水充分清洗。

2)将步骤1)处理后的玻璃片浸入聚乙烯亚胺溶液中，然后将基片用纯水冲洗，备用。

3)将步骤2)处理后的玻璃片，浸泡于10％(V/V)的戊二醛溶液中反应中，然后用水淋洗，备用。

4)将步骤3)处理的玻璃片浸入探针2的磷酸缓冲溶液中(pH＝7.6)，反应4h。然后用磷酸缓冲溶液(pH＝7.6)清洗，并用L-赖氨酸或者牛血清白蛋白处理玻璃片，之后用磷酸缓冲溶液(pH＝7.6)清洗，放置在pH值为7.6的磷酸缓冲溶液中备用。

5)将步骤4)处理的玻璃片，用上述以探针1溶液制备得到的SERS寡核苷酸探针进行处理，再用磷酸缓冲溶液(pH＝7.6)清洗后，用于SERS检测。结果显示，对革巴标DNA的检测限为1×10^-16mol/L。

实施例5：

模型寡核苷酸分子如下：

探针1：5’-TCTCAACTCGTATTTTTT-(CH₂)₃-NH₂-3’

探针2：5’-H₂N-(CH₂)₃-TTTTTTCGCATTCAGGAT-3’

靶标DNA：5’-TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG-3’

利用三角银纳米颗粒制备新型SERS寡核苷酸探针：

除参照文献(Adv.Mater.2005，17，412.)制备三角银纳米颗粒代替金纳米棒颗粒以外，其余的制备过程与实施例4相同。

利用三角银纳米颗粒制备的SERS寡核苷酸探针进行SERS检测DNA分子：

除利用三角银纳米颗粒制备的SERS免疫探针代替利用金纳米棒颗粒制备的SERS免疫探针以外，其余的检测过程与实施例4相同。结果对靶标DNA的检测限为1×10^-17mol/L。

实施例6：

模型寡核苷酸分子如下：

探针1：5’-TCTCAACTCGTATTTTTT-(CH₂)₃-NH₂-3’

探针2：5’-H₂N-(CH₂)₃-TTTTTTCGCATTCAGGAT-3’

靶标DNA：5’-TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG-3’

利用球形金纳米颗粒制备新型SERS寡核苷酸探针：

除参照文献(J.Nanosci.Nanotech.2007，7，712.)制备球形金纳米颗粒代替金纳米棒颗粒以外，其余的制备过程与实施例4相同。

利用球形金纳米颗粒制备的SERS寡核苷酸探针进行SERS检测DNA分子：

除利用球形金纳米颗粒制备的SERS免疫探针代替利用金纳米棒颗粒制备的SERS免疫探针以外，其余的检测过程与实施例4相同。结果对靶标DNA的检测限为1×10^-15mol/L。

使用其他的拉曼信号分子如巯基苯胺、对巯基吡啶、1，4-二巯基苯、巯基苯、4-甲基巯基苯、2-巯基萘等采用与实施例1相同的方法制备本发明SERS生物探针，将其用于检测人IgG(h-IgG)时，其检测限均达到10pg/mL的量级，具有很高的检测灵敏度。

Claims

1.一种SERS生物探针，包括

二氧化硅颗粒核心和在所述二氧化硅颗粒核心表面上的金属纳米颗粒层；

所述二氧化硅层表面修饰有生物探针分子；

所述金属纳米颗粒层为金纳米颗粒层或银纳米颗粒层。

2.根据权利要求1所述的SERS生物探针，其特征在于：所述二氧化硅颗粒核心的粒径为10-2000nm；所述二氧化硅层的厚度为1-1000nm。

3.根据权利要求1所述的SERS生物探针，其特征在于：所述拉曼信号分子为对巯基苯胺，巯基苯胺、对巯基吡啶、1，4-二巯基苯、巯基苯、4-甲基巯基苯、2-巯基萘。

4.权利要求1所述SERS生物探针的制备方法，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述表面官能团化的二氧化硅颗粒为表面氨基化的二氧化硅颗粒，表面醛基化的二氧化硅颗粒，表面巯基化的二氧化硅颗粒，或者，为表面吸附有与金或银纳米颗粒相反电荷的聚合电解质的二氧化硅颗粒。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述表面氨基化的二氧化硅颗粒按如下过程制备：将二氧化硅颗粒与氨基化溶液混和反应，即得到表面氨基化的二氧化硅颗粒；所述氨基化溶液选自聚乙烯亚胺、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷、聚合-2-乙烯吡啶、聚合-4-乙烯吡啶或3-氨基丙基-三甲氧基硅烷；

所述表面醛基化的二氧化硅颗粒按如下过程制备：将二氧化硅颗粒与醛基化溶液混和反应，即得到表面醛基化的二氧化硅颗粒；所述醛基化溶液选自3-醛基烷基-三乙氧基硅烷或3-醛基烷基-三甲氧基硅烷；

7.根据权利要求4-6任一所述的制备方法，其特征在于：所述二氧化硅颗粒的粒径为10-2000nm；所述金或银纳米颗粒的粒径为3-200nm。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述拉曼信号分子选自对巯基苯胺，巯基苯胺、对巯基吡啶、1，4-二巯基苯、巯基苯、4-甲基巯基苯、2-巯基萘。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤3)形成SiO₂层的具体条件：用氨水调整溶液的pH在6-14，正硅酸乙酯的浓度范围0.1mmol/L-2mol/L，正硅酸乙酯与二氧化硅颗粒的用量摩尔比为200∶1～1∶200。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中经步骤3)处理的颗粒与生物探针分子反应前，还经过氨基化和戊二醛处理。