CN109991207B - 一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的sers传感器及其制备和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的SERS传感器及其制备和检测方法，该SERS传感器利用酪氨酸酶抗原抗体的特异性识别的原理，通过磁性基底的吸附和表面增强拉曼探针的增强作用，基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体—待测抗原—标记抗体”三明治结构，通过对标记分子SERS信号的识别进行分析酪氨酸酶的含量，据此建立了检测酪氨酸酶的表面增强拉曼分析方法。本发明所述的检测方法具有快速、灵敏，简便、样品消耗少等优点。此外，利用此传感器检测酪氨酸酶具有良好的的线性，检测限较低，可达1ng/mL。同时，实际人血清样品中酪氨酸酶的加标回收率在96.0%‑136.0%范围内。因此，本发明有望成为临床检测酪氨酸酶的一种有效方法。
Description
技术领域
本发明属于表面增强拉曼分析检测技术的技术领域，具体涉及一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的SERS传感器及其制备和检测方法。
背景技术
酪氨酸酶(TYR)是一种含铜氧化酶，可将单酚或邻苯二酚转化为相应的邻醌，是从酪氨酸生物合成黑色素的限速酶。酪氨酸酶也是一种细胞质的黑素细胞分化蛋白，通过介导酪氨酸氧化成部分醌来启动黑色素的形成，TYR是检测黑色素瘤的潜在生物标志物，因为它的表达水平与恶性水平密切相关。此外，异常水平的酪氨酸酶可能导致严重的皮肤病，如白癜风和帕金森病等神经系统综合征。因此，酪氨酸酶测定在临床诊断、化妆品和食品工业中的基础研究和实际应用都具有重要意义。
目前检测酪氨酸酶的方法有比色法，荧光法，电化学法和分光光度法。但是这些方法的检测灵敏度不够高，特异性低，色谱和荧光分析，受到繁琐的样品处理，复杂的探针合成或昂贵仪器的要求的限制。中国专利号(CN 10285423313 B)公开了一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法，但是这种方法易受到环境的干扰，检测的重现性较差。中国专利号(CN 109239255 A)公开了一种基于壳聚糖-铂纳米粒子催化显色体系的酪氨酸酶及其抑制剂的测定方法，该方法通过颜色的变化来检测酪氨酸酶，但是灵敏度不够高。
表面增强拉曼散射(SERS)技术因其高灵敏度，高选择性，非破坏性，操作简单，所需样品量少等优点而被广泛应用。目前，人们越来越关注合成SERS活性核-分子-壳纳米粒子，其中分子层夹在贵金属的核和壳之间，该分子显示稳定的SERS信号，因此可以做为内标定量检测。4-巯基苯甲腈做为内标分子，因为它在生物静默区有信号，这样在生化分子的检测过程中避免其他信号的干扰。磁性SERS活性基底的生物传感器能自动快速分离三明治结构，避免了固态基底检测蛋白质过程中的机械损伤并且利用外部磁场能将分散的三明治结构汇聚成可逆的聚集体，产生新的SERS热点。因此开发一种三明治结构SERS传感器检测酪氨酸酶的方法是必不可少的。
发明内容
为了解决上述问题，发明的目的在于提供一种一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的SERS传感器及其制备和检测方法，该传感器应具有高的灵敏度、选择性，具有较高的特异性识别能力，该传感器可以应用于人体血液中酪氨酸酶的检测。该传感器制备方法简单其在酪氨酸酶的检测中具有广泛的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备，包括以下步骤：
(1)纳米金溶胶的制备
取100ml质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1-2ml质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾10-20min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；
(2)Au4MB@Au胶体的制备(Au4MB@Au胶体是一种核壳结构的胶体，以纳米金胶体为核，在其表面修饰4-巯基苯甲腈，然后再在Au@4MB胶体外面形成金壳，4-巯基苯甲腈分子在核壳中间)取10mL纳米金溶胶，加入5-15μL浓度为0.1mol/L的4-巯基苯甲腈的乙醇溶液(4MB溶液)作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金溶胶上的4-巯基苯甲腈的溶液，离心后的沉淀重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@4MB胶体(纳米金溶胶表面修饰4-巯基苯甲腈)；往10mL的制备好的Au@4MB胶体中加入100-250μL浓度为6*10-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，离心后的沉淀重新分散于5ml超纯水中(超纯水是另外加的)，得到Au4MB@Au胶体，浓度为0.2nmol/L；
(3)SERS探针的制备
取1mL步骤(2)中制备好的Au4MB@Au胶体，加入5-40μL浓度为10-4mol/L的巯基-聚乙二醇-羧基溶液(HS-PEG-COOH溶液)，搅拌后离心洗涤，离心后的沉淀重新分散于1mLPBS缓冲溶液中，再加入50μL的浓度为10mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液用来活化Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体表面的羧基，搅拌30min后离心洗涤去除多余的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，离心后的沉淀重新分散于1mL PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，得到Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体(Au4MB@Au溶胶表面修饰HS-PEG-COOH)；将20-70μL浓度为1.2*10-2mg/mL的酪氨酸酶抗体加入至1mLAu4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体中，25℃偶联2h后加入5μL质量分数为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h从而封闭Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体表面未反应的羧基基团，制得SERS探针；
(4)磁性基底的制备
取500μL浓度为0.5mg/mL的羧基化的磁珠加入50μL的浓度为10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，旋涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30分钟，磁性分离洗涤，去除上清液；接着加入20-70μL的酪氨酸酶的抗体，25℃偶联1.5-3h后加入5μL质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，离心管置于磁性分离器上分离去除上清液，得磁性基底；
(4)SERS传感器的制备
取1mL制备好的SERS探针和500μL制备好的磁性基底放置于5毫升离心管中超声5min,即为SERS传感器。
进一步的，所述HS-PEG-COOH的分子量为2000。
进一步的，所述磁珠的粒径为1微米。
进一步的，所述纳米金溶胶的粒径为25-40nm,紫外吸收波长为520nm。
进一步的，所述Au4MB@Au核壳结构的粒径为35-50nm，紫外吸收波长为530nm。
本发明还包括一种检测酪氨酸酶的方法，包括以下步骤
(1)建立工作曲线：配置不同浓度的酪氨酸酶样品溶液；将SERS传感器与不同浓度的酪氨酸酶室温下共培养1h，磁分离去除上清液后，将沉淀取出滴于铝板上进行SERS检测；记录传感器SERS信号强度，以传感器SERS信号下降幅度为纵坐标，酪氨酸酶浓度为横坐标作出相对应的工作曲线；
(2)将SERS传感器与待测样品共培养1h，磁分离去除上清液后，将沉淀取出滴于铝板上进行SERS检测，记录传感器SERS信号强度，计算SERS信号强度的下降幅度，对照工作曲线，计算得出血清中酪氨酸酶的浓度。
进一步的，所述拉曼的激发波长为785nm。
进一步的，所述SERS方法绘制的工作曲线方程为：Y＝38.06+24.8Log[X]，R2＝0.98，其中Y为4-巯基苯甲腈的拉曼强度；X为酪氨酸酶的浓度，最低检测限1ng/mL。
本发明的有益效果：
1、使用Au4MB@Au核壳结构做为SERS探针，磁性基底分离富集样品，通过固相抗体-待测抗原-标记抗体组装酪氨酸酶三明治结构表面增强拉曼传感器。这种生物传感器具有几个优点。首先酪氨酸酶是检测黑色素毒瘤的潜在生物标志物，因为表达水平与恶性水平密切相关，SERS检测方法具有灵敏度高的特点，不容易受水的影响，因此该传感器适合于体液或者细胞中酪氨酸酶的检测，适用范围广。其次抗原抗体的特异性也赋予该传感器具有特异性，不会受其它酶或者蛋白质的影响。
2、本发明研究的Au4MB@Au核壳结构具有如下优势：纳米金生物相容性好，对细胞毒性小；4-巯基苯甲腈做为拉曼信号分子，在生物静默区(＞1800cm-1)有个特征峰,细胞或者血液在1800cm-1波数前也存在特征峰，如果不用静默区的峰，就容易与待测物质本身的峰重叠；外面的金壳既可以增强内标分子的信号又可以保护内标分子不受外界环境，pH和温度等的影响。
3、本发明使用的磁性基底避免了固态基底检测蛋白质过程中的机械损伤并且利用外部磁场能将分散的三明治结构汇聚成可逆的聚集体，产生新的SERS热点。
4、本发明所得的传感器制备方法具有快速、灵敏度高、样品消耗少等优点，并且可以在血清这个复杂的生物体系中实现特异性检测且操作方便，灵敏度高，酪氨酸酶的最低检出限可达到1ng/mL。
附图说明
1、图1是实施例1中AuNPs和Au4MB@Au核壳结构的紫外吸收光谱图；
2、图2是实施例1中AuNPs和Au4MB@Au核壳结构的透射电镜图；
3、图3是实施例1中AuNPs、AuNPs@4MB、Au4MB@Au、Au4MB@Au-HS-PEG-COOH、Au4MB@Au-HS-PEG-COOH-Ab的Zeta电位图；
4、图4是实施例2中Au4MB@Au核壳结构均匀性表征的柱状图；
5、图5是实施例3中最佳HS-PEG-COOH体积的表面增强拉曼光谱图；
6、图6是实施例4中最佳体积酪氨酸酶抗体的表面增强拉曼光谱图；
7、图7是实施例5中不同浓度酪氨酸酶的表面增强拉曼光谱图；
8、图8是实施例5中特征峰强度2220cm-1与酪氨酸酶浓度的线性关系示意图；
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备
(1)纳米金核的制备
取100ml质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1-2ml质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾10-20min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；
(2)Au4MB@Au胶体的制备
取10mL纳米金溶胶，加入5-15μL浓度为0.1mol/L的4-巯基苯甲腈的乙醇溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金胶上的4-巯基苯甲腈的溶液，重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@4MB胶体；往10mL的制备好的Au@4MB胶体中加入100-250μL浓度为6*10-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5ml超纯水中，得到Au4MB@Au胶体,浓度约为0.2nMol/L；
(3)SERS探针的制备
取1mL步骤(1)中制备好的Au4MB@Au胶体，加入5-40μL浓度为10-4mol/L的巯基-聚乙二醇-羧基溶液，搅拌后离心洗涤重分散于1mLPBS缓冲溶液中，再加入50μL的浓度为10mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液用来活化胶体表面的羧基，搅拌30min后离心洗涤去除多余的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，重分散于1mL PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，得到Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体；将20-70μL浓度为1.2*10-2mg/mL的酪氨酸酶抗体加入至1mLAu4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体中，25℃偶联2h后加入5μL质量分数为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h从而封闭胶体表面未反应的羧基基团，制得SERS探针；
(4)磁性基底的制备
取500μL浓度为0.5mg/mL的羧基化的磁珠加入50μL的浓度为10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，旋涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30分钟，磁性分离洗涤，去除上清液；接着加入20-70μL的酪氨酸酶的抗体，25℃偶联1.5-3h后加入5μL质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，离心管置于磁性分离器上分离去除上清液，得磁性基底；
(5)取1mL制备好的SERS探针和500μL制备好的磁性基底放置于5毫升离心管中超声5min,即为SERS传感器。
性能测试：
1、紫外
图1表明实施例1制备的Au4MB@Au核壳结构紫外吸收光谱比AuNPs吸收光谱就红移了10nm,说明核壳结构的粒径尺寸变大，表面等离子体共振能量变小，紫外吸收能量也变小，波长随之增大，其等离子峰发生红移。
2、透射电镜图
从图2的AuNPs和Au4MB@Au的透射电镜图中也可以看出粒径尺寸变大，Au4MB@Au的分布更均匀。
3、Zeta电位
图3是AuNPs、AuNPs@4MB、Au4MB@Au、Au4MB@Au-HS-PEG-COOH、Au4MB@Au-HS-PEG-COOH-Ab的Zeta电位图，是为了证明实施例1的步骤(2)中是否有金壳的存在以及抗体是否与SERS探针偶联上了。Au4MB@Au的电位比AuNPs@4MB更负了，是因为AuNPs是带负电，在金核外面修饰上纳米金后电位发生了变化，同时从图2的透射电镜图也可以看出Au4MB@Au的粒径更大了，所以表明在金核外面形成了金壳。酪氨酸酸酶的抗体带负电，当修饰完抗体后，电位比Au4MB@Au-HS-PEG-COOH更负了，从而可以证明抗体和HS-PEG-COOH的羧基偶联上了。
4、Au4MB@Au核壳结构SERS基底均匀性的表征
取1mL实施例1中步骤(2)中制备好的Au4MB@Au(10000rpm,10min)离心，去除上清液，取1.5μLAu4MB@Au胶体和1.5μL罗丹明6G溶液(10-5mol/L)混合后滴于铝板上，待干燥后进行拉曼测试。图4是在一个光斑下随机测量的10个点，利用罗丹明6G特征峰1361cm-1和4-巯基苯甲腈特征峰2220cm-1强度的比值。计算标准偏差RSD为5.1％，可见Au4MB@Au的均匀性好。
5、最佳体积HS-PEG-COOH的拉曼测定
取1mL实施例1中步骤(2)中制备好的Au4MB@Au胶体加入5、10、15、20、30、40μL HS-PEG-COOH溶液(10-4mol/L，分子量2000)，磁力搅拌30min后离心洗涤进行拉曼测试，从图5可以看出最佳的HS-PEG-COOH的量是10μL，当它的量继续增加的时候，拉曼信号降低了，这有可能是因为包裹的PEG太厚了影响拉曼信号，当体积继续增加的时候，拉曼信号保持稳定，说明这个时候已经达到饱和了。
6、最佳体积酪氨酸酶抗体的拉曼测定
取1mL实施例1中步骤(2)中制备好的Au4MB@Au胶体加入10μL HS-PEG-COOH溶液(10-4mol/L，分子量2000)，磁力搅拌30min后离心洗涤重散于PBS(pH＝7)缓冲液中，再加入50μL的EDC(10mg/mL)和50μL的NHS(10mg/mL)磁力搅拌30分钟后离心洗涤去除多余的EDC和NHS，重分散于PBS溶液中(pH＝7.4)。将连接在Au4MB@Au胶体外面的羧基活化,加入20、30、40、50、60、70μL的酪氨酸酶的抗体(1.2*10-2mg/mL)。从图6中可以看出，50μL或者60μL的酪氨酸酶抗体的拉曼信号都比较好，50μL抗体量所对应的的拉曼信号更好，所以之后的实验都选择50μL酪氨酸酶抗体。
7、酪氨酸酶的定量检测
将实施例1中步骤(3)中制备好的1mLSERS探针和步骤(4)中500μL磁性基底和100μL不同浓度(500、100、50、10、5、1ng/mL)的抗原混合1h,磁洗2次，去除上清液，滴在铝板上进行SERS检测。图7加入不同浓度的目标抗原进行免疫反应，检测相应情况下的SERS光谱。从图7可以看出，在1ng/mL-500ng/mL范围内，探针分子(4MB)的SERS信号强度随着目标抗原的浓度增大而增大。因为抗原的浓度越大，连接有酪氨酸酶的抗体越多，伴随连接有SERS标签的金纳米粒子组装的越多。图8是4MB的SERS光谱在2220cm-1处的峰强度随着TYR的浓度变化的线性图。可以看出用该传感器检测酪氨酸酶的线性效果良好，检测限可达1ng/mL。
8、血清中酪氨酸酶的检测
取实施例1中步骤(3)中制备好的1mLSERS探针和步骤(4)中500μL磁性基底和100μL用不同浓度的酪氨酸酶溶液稀释的血清样品混合1h,磁洗2次，去除上清液，滴在铝板上进行SERS检测。浓度分别为为500、250、25、2.5、1ng/mL。血清取自健康青年。
表1显示说明根据相同的操作流程，人血清(Serum)中的加标实验说明本方法测定酪氨酸酶具有优异的回收率和重现性。
表1
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于，由下述方法制得：
(1)Au4MB@Au胶体的制备
取10mL纳米金溶胶，加入5-15μL浓度为0.1mol/L的4-巯基苯甲腈的乙醇溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，洗去未吸附在纳米金溶胶上的4-巯基苯甲腈的溶液，离心后的沉淀重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@4MB胶体；往10mL的制备好的Au@4MB胶体中加入100-250μL浓度为6*10-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，离心后的沉淀重新分散于5ml超纯水中，得到Au4MB@Au胶体，浓度为0.2nmol/L；
(2)SERS探针的制备
取1mL步骤(1)中制备好的Au4MB@Au胶体，加入5-40μL浓度为10-4mol/L的巯基-聚乙二醇-羧基溶液，搅拌后离心洗涤重新分散于1mLPBS缓冲溶液中，再加入50μL的浓度为10mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液用来活化胶体表面的羧基，搅拌30min后离心洗涤去除多余的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，重分散于1mL PBS缓冲溶液中，得到Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体；将20-70μL浓度为1.2*10-2mg/mL的酪氨酸酶抗体加入至1mLAu4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体中，25℃偶联2h后加入5μL质量分数为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h从而封闭Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体表面未反应的羧基基团，制得SERS探针；
(3)磁性基底的制备
取500μL浓度为0.5mg/mL的羧基化的磁珠加入50μL的浓度为10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，旋涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30分钟，磁性分离洗涤，去除上清液；接着加入20-70μL的酪氨酸酶的抗体，25℃偶联1.5-3h后加入5μL质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，离心管置于磁性分离器上分离去除上清液，得磁性基底；
(4)SERS传感器的制备
取1mL制备好的SERS探针和500μL制备好的磁性基底放置于5毫升离心管中超声5min混合，即得SERS传感器。
2.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金溶胶由以下方法制得：取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1-2mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾10-20min反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶。
3.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述HS-PEG-COOH的分子量为2000。
4.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述磁珠的粒径为1微米。
5.根据权利要求2所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述纳米金溶胶的粒径为25-40nm,紫外吸收波长为520nm。
6.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述Au4MB@Au核壳结构的粒径为35-50nm，紫外吸收波长为530nm。
7.应用一种如权利 要求1-6任一项所述三明治结构SERS传感器的制备方法制备的SERS传感器检测酪氨酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)建立工作曲线：配置不同浓度的酪氨酸酶样品溶液；将SERS传感器与不同浓度的酪氨酸酶室温下共培养1h，磁分离去除上清液后，将沉淀取出滴于铝板上进行SERS检测；记录传感器SERS信号强度，以传感器SERS信号下降幅度为纵坐标，酪氨酸酶浓度为横坐标作出相对应的工作曲线；
(2)将SERS传感器与待测样品共培养1h，磁分离去除上清液后，将沉淀取出滴于铝板上进行SERS检测，记录传感器SERS信号强度，计算SERS信号强度的下降幅度，对照工作曲线，计算得出血清中酪氨酸酶的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：所述拉曼的激发波长为785nm。
9.根据权利要求7所述的检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：SERS方法绘制的工作曲线方程为：Y＝38.06+24.8Log[X]，其中Y为4-巯基苯甲腈的拉曼强度；X为酪氨酸酶的浓度，最低检测限1ng/mL。
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