CN111443076B - 一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系及sers检测方法 - Google Patents

一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系及sers检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系及SERS检测方法，涉及草甘膦检测技术领域。本发明所述检测体系包括：酪氨酸酶、草甘膦、左旋多巴和PBS缓冲液。本发明所述检测方法，以草甘膦对于酪氨酸酶的抑制作用为原理，通过草甘膦对酪氨酸酶的抑制作用，利用SERS检测的方法对酪氨酸酶的底物左旋多巴(L‑DOPA)含量进行定量，从而得到抑制剂草甘膦的含量。本发明所述方法，具有检测时间短、成本低廉、检出限低等优点，有望实现对草甘膦分子快速灵敏的检测。

Description

一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系及SERS检测方法
技术领域
本发明属于草甘膦检测技术领域，具体涉及一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系及SERS检测方法。
背景技术
草甘膦是一种非选择性、无残留灭生性除草剂，对多年生根杂草非常有效，广泛用于橡胶、桑、茶、果园及甘蔗地。主要抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质合成受到干扰，导致植物死亡。
草甘膦是目前广泛使用的多类除草剂中的有效活性成分，在欧盟已被监管使用，同时世界卫生组织国际癌症研究机构将草甘膦列为2A类致癌物。目前草甘膦的检测方法主要有HPLC、GC、LC-MS/MS和电化学检测法等。但是上述方法都具有检出限高和灵敏度低的缺陷，而SERS检测方法具有灵敏度高、方法简单和成本低廉的优点，如何利用SERS检测草甘膦的含量，则成为一个新兴研究课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系及SERS检测方法，具有检测时间短、成本低廉、检出限低等优点，有望实现对草甘膦分子快速灵敏的检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系，所述检测体系包括：酪氨酸酶、草甘膦、左旋多巴和PBS缓冲液。
本发明还提供了一种利用上述检测体系的草甘膦SERS检测方法，包括以下步骤：(1)利用PBS缓冲液将草甘膦稀释成不同浓度的草甘膦溶液，与左旋多巴和酪氨酸酶混合后孵育3min，得反应混合液；
(2)将所述反应混合液与SERS基底纳米金和硝酸钠溶液混合后，进行SERS测试，以拉曼位移值为1447cm-1处的左旋多巴特征峰的差值作为纵坐标，以草甘膦浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，利用所述标准曲线测算草甘膦浓度。
优选的，步骤(1)中所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0.01M，pH值为7.0。
优选的，步骤(1)所述左旋多巴为利用0.01M的PBS缓冲液配制的左旋多巴溶液，所述左旋多巴溶液中左旋多巴的摩尔浓度为0.5mM。
优选的，所述左旋多巴溶液、草甘膦溶液和酪氨酸酶的体积比为150:200:10。
优选的，步骤(1)中还包括空白对照实验，在空白对照实验中所述反应混合液中加入的是相同体积但不含草甘膦的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0.01M，pH值为7.0。
优选的，步骤(2)所述反应混合液与SERS基底纳米金和硝酸钠溶液的体积比为1:50:3；
所述硝酸钠溶液的摩尔浓度为1M。
优选的，步骤(2)所述SERS基底纳米金的制备方法，包括：将氯金酸水溶液加热至回流后搅拌，与柠檬酸钠水溶液混合后持续回流搅拌30min，停止加热冷却，得SERS基底纳米金；
所述氯金酸水溶液中的氯金酸和柠檬酸钠水溶液中的柠檬酸钠的质量比为10:7。
优选的，所述氯金酸水溶液的质量百分含量为0.01wt％；所述柠檬酸钠水溶液的质量百分含量为1wt％。
优选的，步骤(2)所述标准曲线为：Y＝4733.35X+5651.75，R2＝0.9845。
本发明提供了一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系，所述检测体系包括酪氨酸酶、草甘膦、左旋多巴和PBS缓冲液，该体系检测草甘膦具有较高的灵敏度，较低的检测限。
本发明还提供了利用上述检测体系的草甘膦SERS检测方法，以草甘膦对于酪氨酸酶的抑制作用为原理，通过草甘膦对酪氨酸酶的抑制作用，利用SERS检测的方法对酪氨酸酶的底物左旋多巴(L-DOPA)含量进行定量，在进行所述检测时，底物左旋多巴有SERS信号，但是产物多巴醌没有SERS信号(图1)，因此不存在产物的干扰情况，从而得到抑制剂草甘膦的含量。本发明所述方法，与其它方法相比，所述方法具有检测时间短、成本低廉、检出限低等优点，有望实现对草甘膦分子快速灵敏的检测。
附图说明
图1为酪氨酸酶的底物左旋多巴和酪氨酸酶催化底物的产物多巴醌的SERS谱图，其中左旋多巴有很强的SERS信号，但是产物多巴醌并无SERS信号，当草甘膦抑制酪氨酸酶活性时，左旋多巴转化为多巴醌的效率低，从而通过加入草甘膦拉曼信号的差异来定量草甘膦；
图2为取拉曼位移值为1447cm-1处的L-DOPA特征峰的差值作为纵坐标，以草甘膦浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，线性范围为10ppm～100ppb；能检测到1447cm-1处的L-DOPA特征峰有最小差别的浓度为50ppb。
具体实施方式
本发明提供了一种基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系，所述检测体系包括：酪氨酸酶、草甘膦、左旋多巴和PBS缓冲液。本发明所述检测体系可用于检测草甘膦，且该体系检测草甘膦具有较高的灵敏度，较低的检测限。
本发明对所述检测体系中各原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售试剂即可。
本发明还提供了一种利用所述检测体系的草甘膦SERS检测方法，包括以下步骤：(1)利用PBS缓冲液将草甘膦稀释成不同浓度的草甘膦溶液，与左旋多巴和酪氨酸酶混合后孵育3min，得反应混合液；
(2)将所述反应混合液与SERS基底纳米金和硝酸钠溶液混合后，进行SERS测试，以拉曼位移值为1447cm-1处的左旋多巴特征峰的差值作为纵坐标，以草甘膦浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，利用所述标准曲线测算草甘膦浓度。
本发明利用PBS缓冲液将草甘膦稀释成不同浓度的草甘膦溶液，与左旋多巴和酪氨酸酶混合后孵育3min，得反应混合液。本发明所述PBS缓冲液的摩尔浓度优选为0.01M，pH值为7.0。本发明所述左旋多巴(L-DOPA)优选为利用0.01M的PBS缓冲液配制的左旋多巴溶液，所述左旋多巴溶液中左旋多巴的摩尔浓度优选为0.5mM。在本发明中，所述左旋多巴溶液、草甘膦溶液和酪氨酸酶的体积比优选为150:200:10。本发明在进行所述步骤时，优选还包括设置空白对照实验，所述空白对照实验中所述反应混合液中加入的是相同体积但不含草甘膦的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0.01M，pH值为7.0。本发明在进行所述混合后孵育前，优选向不同浓度的草甘膦溶液中加入新配的0.5mM的L-DOPA溶液，最后加入酪氨酸酶，于室温下孵育3min，再进行SERS测试。本发明对所述酪氨酸酶的来源并没有特殊限定，酶活达到70U/mL即可。
得反应混合液后，本发明将所述反应混合液与SERS基底纳米金和硝酸钠溶液混合后，进行SERS测试，以拉曼位移值为1447cm-1处的左旋多巴特征峰的差值作为纵坐标，以草甘膦浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，利用所述标准曲线测算草甘膦浓度。本发明所述反应混合液与SERS基底纳米金和硝酸钠溶液的体积比优选为1:50:3。本发明所述硝酸钠溶液的摩尔浓度优选为1M。
本发明对所述SERS基底纳米金的来源并没有特殊限定，优选通过热还原法进行制备，制备方法，优选包括以下步骤：将氯金酸水溶液加热至回流后搅拌，与柠檬酸钠水溶液混合后持续回流搅拌30min，停止加热冷却，得SERS基底纳米金；所述氯金酸水溶液中的氯金酸和柠檬酸钠水溶液中的柠檬酸钠的质量比为10:7。
本发明所述氯金酸水溶液的质量百分含量优选为0.01wt％；所述柠檬酸钠水溶液的质量百分含量优选为1wt％。本发明所述搅拌优选为磁力搅拌，为方便说明所述SERS基底纳米金的制备方法，本发明实施例中将200mL(0.01wt％)的氯金酸溶液置于250mL圆底烧瓶中，加热至回流并用磁力搅拌。将1.4mL(1wt％)的柠檬酸钠快速加入到氯金酸溶液中，保持回流搅拌30min，后停止加热冷却至室温。本发明所述SERS基底纳米金，可以解决当前直接进行草甘膦SERS检测时草甘膦的SERS信号几乎没有的问题，可将其用于检测草甘膦含量。
本发明实施例中，为方便说明所述SERS测试，优选取500μL所制备的SERS基底纳米金于2mL透明进样瓶中，加入上述反应混合液10μL混合均匀，再加入30μL 1M的硝酸钠溶液并立即进行SERS测试。本发明所述SERS测试时，优选设置功率为100％，积分时间3s。本发明依据SERS测试的结果绘制标准曲线，以拉曼位移值为1447cm-1处的左旋多巴特征峰的差值作为纵坐标，以草甘膦浓度的对数值为横坐标，所述标准曲线优选为：Y＝4733.35X+5651.75，R2＝0.9845。利用本发明所述方法和标准曲线，可测定的草甘膦的线性范围为10ppm～100ppb，LOD值为50ppb。
下面结合实施例对本发明提供生物基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系及SERS检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
使用的仪器和试剂：
RT2000便携式拉曼光谱仪(同方威视技术股份有限公司)；石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810B,上海亚太技术玻璃公司)用于蒸二次蒸馏水；电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)用于称量药品；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Electrothermal电热套加热套；氯金酸(sigma试剂公司)；酪氨酸酶(sigma试剂公司)；左旋多巴(L-DOPA，阿拉丁试剂公司)；草甘膦标品(Dr.Ehrenstorfer Gmbh)，柠檬酸钠(阿拉丁试剂公司)，硝酸钠(阿拉丁试剂公司)。
实施例1
SERS基底纳米金的制备：将200mL(0.01wt％)的氯金酸溶液置于250mL圆底烧瓶中，加热至回流并用磁力搅拌。将1.4mL(1wt％)的柠檬酸钠快速加入到氯金酸溶液中，保持回流搅拌30min，后停止加热冷却至室温；
酶抑制法快速检测草甘膦的实验流程：取200μL不同浓度的草甘膦溶液(用0.01MPBS，pH＝7.0稀释)，加入150μL新配0.5mM L-DOPA溶液(0.01M PBS，pH＝7.0)，最后加入10μL酪氨酸酶(70U/mL)，于室温下孵育3min，再进行SERS测试，每组分析物都需做一组空白对照，空白对照的实验方法即加入相同体积不含草甘膦的0.01MPBS，pH＝7.0溶液。
SERS信号的检测：取500μL所制备的纳米金于2mL透明进样瓶中，加入上述反应混合液10μL混合均匀，再加入30μL 1M的硝酸钠溶液并立即进行SERS测试(功率100％，积分时间3s)。
取拉曼位移值为1447cm-1处的L-DOPA特征峰的差值作为纵坐标，以草甘膦浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线(图2)，标准曲线的方程式：Y＝4733.35X+5651.75R2＝0.9845，线性范围为10ppm～100ppb，LOD值为50ppb。该方法对于草甘膦的代谢物氨甲基磷酸有很好的区别性。
对草甘膦和氨甲基磷酸进行特异性评价：在待测物草甘膦中加入不同浓度的氨甲基磷酸，结果并无太大的差别。加标回收试验：准备两份完全一致的样品，向其中一份添加标准物质(此处为1000ppb、500ppb和200ppb三个浓度的草甘膦)，随后，将这两份样品按相同的检测方法进行检测，依据两个样品检测结果和标准物质添加量计算加标回收率，根据回收率结果评价方法和操作的准确性(n大于5)。结果显示，对氨甲基磷酸的交叉反应为零，而对于水基质中草甘膦的加标回收率在76.2～110.7％。由此可知该方法具有较高的实用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种草甘膦SERS检测方法，其特征在于，所述草甘膦SERS检测方法基于酪氨酸酶抑制的草甘膦检测体系，所述检测体系包括：酪氨酸酶、草甘膦、左旋多巴和PBS缓冲液；
包括以下步骤：(1)利用PBS缓冲液将草甘膦稀释成不同浓度的草甘膦溶液，与左旋多巴和酪氨酸酶混合后孵育3min，得反应混合液；
(2)将所述反应混合液与SERS基底纳米金和硝酸钠溶液混合后，进行SERS测试，以拉曼位移值为1447cm-1处的左旋多巴特征峰的差值作为纵坐标，以草甘膦浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，利用所述标准曲线测算草甘膦浓度。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0.01M，pH值为7.0。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤(1)所述左旋多巴为利用0.01M的PBS缓冲液配制的左旋多巴溶液，所述左旋多巴溶液中左旋多巴的摩尔浓度为0.5mM。
4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述左旋多巴溶液、草甘膦溶液和酪氨酸酶的体积比为150:200:10。
5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤(1)中还包括空白对照实验，在空白对照实验中所述反应混合液中加入的是相同体积但不含草甘膦的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为0.01M，pH值为7.0。
6.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，步骤(2)所述反应混合液与SERS基底纳米金和硝酸钠溶液的体积比为1:50:3；
所述硝酸钠溶液的摩尔浓度为1M。
7.根据权利要求1或6所述检测方法，其特征在于，步骤(2)所述SERS基底纳米金的制备方法，包括：将氯金酸水溶液加热至回流后搅拌，与柠檬酸钠水溶液混合后持续回流搅拌30min，停止加热冷却，得SERS基底纳米金；
所述氯金酸水溶液中的氯金酸和柠檬酸钠水溶液中的柠檬酸钠的质量比为10:7。
8.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于，所述氯金酸水溶液的质量百分含量为0.01wt％；所述柠檬酸钠水溶液的质量百分含量为1wt％。
9.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤(2)所述标准曲线为：Y＝4733.35X+5651.75，R2＝0.9845。
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