CN111157512A - 一种用于检测酪氨酸酶活性的sers基底及利用该基底检测酪氨酸酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底及利用该基底检测酪氨酸酶活性的方法，利用三价铁离子与NTA形成螯合物Fe(NTA)，当体系中出现TYR时，催化氧化多巴胺变成多巴醌，多巴胺含量降低，抑制了Fe(NTA)DA络合物的形成，拉曼信号降低。利用Au^PB@Au NPs做为拉曼增强基底，普鲁士蓝(PB)做为核壳结构中的内标信号分子，该分子只在生物静默区有强的谱峰，无背景信号干扰，可以用于校准检测过程中的信号波动，Fe(NTA)DA的拉曼特征峰1480cm^‑1信号与普鲁士蓝2121cm^‑1信号强度的比值(I₁₄₈₀/₂₁₂₁)与酪氨酸酶活性之间存在着良好的线性关系，检测限较低，可达0.0003U/mL。

Description

一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底及利用该基底检测酪 氨酸酶活性的方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底及利用该基底检测酪氨酸酶活性的方法，属于表面增强拉曼分析检测的技术领域。

背景技术

酪氨酸酶(TYR)是广泛分布在微生物、动物、人和植物中的一种酚类氧化酶。酪氨酸酶的功能缺失或者异变也会造成人体某些其它隐性疾病的产生。酪氨酸酶是一种典型的多酚氧化酶，能催化多巴胺 (DA)的氧化作用变成多巴醌。三价铁离子与氨三乙酸三钠形成螯合物Fe(NTA)，DA与Fe(NTA)形成络合物Fe(NTA)DA,Fe(NTA) 不能与多巴醌形成络合物。

目前检测酪氨酸酶的方法有比色法，荧光法，电化学法和分光光度法。但是这些方法的检测灵敏度不够高，特异性低，色谱和荧光分析，受到繁琐的样品处理，复杂的探针合成或昂贵仪器的要求的限制。中国专利号(CN 10285423313 B)公开了一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法，但是这种方法易受到环境的干扰，检测的重现性较差。中国专利号(CN 109239255 A)公开了一种基于壳聚糖-铂纳米粒子催化显色体系的酪氨酸酶及其抑制剂的测定方法，该方法通过颜色的变化来检测酪氨酸酶，但是灵敏度不够高。

表面增强拉曼散射(SERS)技术因其高灵敏度，高选择性，非破坏性，操作简单，所需样品量少等优点而被广泛应用。但是目前 SERS检测存在着定量的问题，因为在检测过程增强胶体的聚集程度，仪器的波动等都会影响检测的准确性，因此需要开发一种SERS活性核-分子-壳纳米粒子，其中分子层夹在贵金属的核和壳之间，该分子显示稳定的SERS信号，因此可以做为内标定量检测。普鲁士蓝做为内标分子，因为它具有高信噪比，只在生物静默区有信号，无背景信号干扰，这样在生化分子的检测过程中避免内源性生物分子的信号的重叠。酪氨酸酶结构复杂，直接检测存在挑战，因此可以通过多巴胺变成多巴醌后拉曼信号的降低间接检测酪氨酸酶活性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底及利用该基底检测酪氨酸酶活性的方法。利用酪氨酸酶催化氧化多巴胺后所生成的多巴醌不能与AuPB@Au NPs-Fe(NTA)形成络合物，从而间接地检测酪氨酸酶的活性，该方法操作简单，灵敏度高，具有较高的特异性识别能力，该方法可以应用于定量检测Hela细胞裂解液中酪氨酸酶的活性。

本发明的技术方案如下：

一种无背景干扰的SERS检测酪氨酸酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)Au^PB@Au NPs的合成

取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1-1.5mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入到沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；取10mL纳米金胶溶液，加入10-20μL浓度为0.1mol/L的普鲁士蓝(PB)溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金胶上的普鲁士蓝溶液，重新悬浮于10mL 超纯水中，得Au@PB胶体；往10mL的制备好的Au@PB胶体中加入250μL浓度为6*10^-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5mL超纯水中，得到 Au^PB@Au胶体；

(2)Au^PB@Au-Fe(NTA)SERS的合成

首先取3mL九水硝酸铁溶液Fe(NO₃)₃.9H₂O(10^-3M)和3mL氨三乙酸三钠NTA(10^-3M)溶液按体积1:1混合后,往溶液中添加 (200μL,0.1mol/L)氢氧化钠溶液调节Fe(NTA)溶液的pH为7.0，混合液静置15min备用。将步骤(1)制备好的Au^PB@Au胶体与Fe (NTA)溶液按体积1:1混合后，混合液磁力搅拌30min，NTA的氨基与Au^PB@AuNPs的表面偶联，反应结束后离心洗涤除去未反应的 Fe(NTA)，去除上清液，剩下Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体备用。

(3)酪氨酸酶的检测

10^-3M多巴胺与不同浓度的酪氨酸酶溶液体积比(10:1)混合反应3min，取1.5μL步骤(2)制备好的Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体与1.5μL (DA与TYR)的反应产物，混合后滴于铝板上进行SERS检测，拉曼的激发波长为785nm。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明公开了一种无背景干扰的SERS检测酪氨酸酶活性的方法。利用三价铁离子与氨三乙酸三钠(NTA)形成螯合物Fe(NTA)， Fe(NTA)可以与多巴胺(DA)的酚羟基络合，形成的络合物可以与拉曼激光共振匹配，大大增强了拉曼信号。当体系中出现酪氨酸酶(TYR)时，催化氧化多巴胺变成成多巴醌，多巴胺含量降低，抑制了Fe(NTA)DA络合物的形成，拉曼信号降低。利用Au^PB@Au NPs 做为拉曼增强基底，普鲁士蓝(PB)做为核壳结构中的内标信号分子，该分子只在生物静默区有强的谱峰，无背景信号干扰，可以用于校准检测过程中的信号波动，Fe(NTA)DA的拉曼特征峰1480cm^-1信号与普鲁士蓝2121cm^-1信号强度的比值(I₁₄₈₀/₂₁₂₁)与酪氨酸酶活性之间存在着良好的线性关系，检测限较低，可达0.0003U/mL。该方法具有灵敏，操作简单，成本低，无背景信号干扰，定量检测的优点。同时，细胞裂解液中酪氨酸酶的加标回收率在93.3％-112.7％范围内。因此，本发明有望成为临床检测酪氨酸酶活性的一种有效方法。

2、本发明利用Au^PB@AuNPs做为SERS增强基底，Fe(NTA)与 DA形成Fe(NTA)DA络合物，该络合物可以放大DA的拉曼信号。由于酪氨酸酶催化氧化多巴胺产生多巴醌，在同一时间内，随着酪氨酸酶浓度增加，DA含量的降低，同一时间内消耗的DA增加，混合液中剩余的DA含量少，拉曼信号降低，所以可以通过DA间接检测 TYR的活性。该方法通过对DA信号放大，大大提高了TYR的检测限。

3、本发明研究的Au^PB@Au核壳结构具有如下优势：纳米金生物相容性好，对细胞毒性小；外面的金壳既可以增强内标分子的信号又可以保护内标分子不受外界环境，pH和温度等的影响。

4、本发明利用Fe(NTA)DA的特征峰1480cm^-1的拉曼强度与 Au^PB@Au核壳结构中内标分子普鲁士蓝的特征峰2121cm^-1的拉曼强度的比值(I₁₄₈₀/₂₁₂₁)定量检测酪氨酸酶，内标分子可以用来校准信号。

5、普鲁士蓝做为拉曼信号分子，在生物静默区(＞1800cm^-1) 有个特征峰,具有高信噪比，细胞或者血液在1800cm^-1波数前也存在特征峰，不会与细胞自身的谱峰重叠，造成背景干扰；

6、本发明所提出的方法具有快速、灵敏度高、样品消耗少等优点，并且可以在细胞这个复杂的生物体系中实现特异性检测且操作方便，灵敏度高，酪氨酸酶的最低检出限可达到0.0003U/mL。

附图说明

图1为本发明制备的SERS检测酪氨酸酶活性的方法的示意图；

图2为利用实施例1制备的Au^PB@Au NPs-Fe(NTA)检测不同浓度酪氨酸酶的归一化的表面增强拉曼光谱图；

图3是实施例1的I₁₄₈₀/₂₁₂₁与酪氨酸酶浓度的线性关系示意图以及I₁₄₈₀与酪氨酸酶浓度的关系图；

图4是实施例1中Au^PB@AuNPs-Fe(NTA)DA，Au^PB@Au NPs-Fe(NTA)-DA+TYR(300U/mL)，Au^PB@AuNPs-Fe(NTA)-DA+TYR(500U/mL)，Au^PB@Au NPs-Fe(NTA) 分别对应的拉曼光谱图；

图5是实施例1中细胞，血清，尿液和几种常规拉曼探针分子的表面增强拉曼光谱图；

图6是实施例1酪氨酸酶选择性测试图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

(1)Au^PB@Au NPs的合成

取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1.5mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；取10mL纳米金胶溶液，加入10μL浓度为0.1mol/L的普鲁士蓝(PB)溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金胶上的普鲁士蓝溶液，重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@PB胶体；往10mL的制备好的Au@PB胶体中加入250μL 浓度为6*10^-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入 2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5mL超纯水中，得到Au^PB@Au 胶体；

(2)Au^PB@Au-Fe(NTA)SERS的合成

首先取3mL九水硝酸铁溶液Fe(NO₃)₃.9H₂O(10^-3M)和3mL氨三乙酸三钠NTA(10^-3M)溶液按体积1:1混合后,往溶液中添加 (200μL，0.1M)氢氧化钠溶液调节Fe(NTA)溶液的pH为7.0，混合液静置15min备用。将步骤(1)制备好的Au^PB@Au胶体与 Fe(NTA)溶液按体积1:1混合后，混合液磁力搅拌30min，NTA的氨基与Au^PB@AuNPs的表面偶联，反应结束后离心洗涤除去未反应的Fe(NTA)，去除上清液，剩下Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体备用。

(3)酪氨酸酶的检测

10^-3mol/LDA与不同浓度的TYR溶液体积比(10:1)混合3min，取1.5μL步骤(2)制备好的Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体与1.5μL(DA与 TYR)的反应产物，混合后滴于铝板上进行SERS检测，拉曼的激发波长为785nm。

实施例2

一种无背景干扰的SERS检测酪氨酸酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)Au^PB@Au NPs的合成

取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入到沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；取10mL纳米金胶溶液，加入20μL浓度为0.1mol/L的普鲁士蓝(PB)溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金胶上的普鲁士蓝溶液，重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@PB胶体；往10mL的制备好的Au@PB胶体中加入250μL 浓度为6*10^-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入 2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5mL超纯水中，得到Au^PB@Au 胶体；

(2)Au^PB@Au-Fe(NTA)SERS的合成

首先取3mL九水硝酸铁溶液Fe(NO₃)₃.9H₂O(10^-3M)和3mL氨三乙酸三钠NTA(10^-3M)溶液按体积1:1混合后,往溶液中添加 (200μL,0.1mol/L)氢氧化钠溶液调节Fe(NTA)溶液的pH为7.0，混合液静置15min备用。将步骤(1)制备好的Au^PB@Au胶体与Fe (NTA)溶液按体积1:1混合后，混合液磁力搅拌30min，NTA的氨基与Au^PB@AuNPs的表面偶联，反应结束后离心洗涤除去未反应的 Fe(NTA)，去除上清液，剩下Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体备用。

(3)酪氨酸酶的检测

10^-3M多巴胺与不同浓度的酪氨酸酶溶液体积比(10:1)混合反应3min，取1.5μL步骤(2)制备好的Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体与1.5μL (DA与TYR)的反应产物，混合后滴于铝板上进行SERS检测，拉曼的激发波长为785nm。

实施例3

一种无背景干扰的SERS检测酪氨酸酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)Au^PB@Au NPs的合成

取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入到沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；取10mL纳米金胶溶液，加入10μL浓度为0.1mol/L的普鲁士蓝(PB)溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金胶上的普鲁士蓝溶液，重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@PB胶体；往10mL的制备好的Au@PB胶体中加入250μL 浓度为6*10^-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入 2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5mL超纯水中，得到Au^PB@Au 胶体；

(2)Au^PB@Au-Fe(NTA)SERS的合成

首先取3mL九水硝酸铁溶液Fe(NO₃)₃.9H₂O(10^-3M)和3mL氨三乙酸三钠NTA(10^-3M)溶液按体积1:1混合后,往溶液中添加 (200μL,0.1mol/L)氢氧化钠溶液调节Fe(NTA)溶液的pH为7.0，混合液静置15min备用。将步骤(1)制备好的Au^PB@Au胶体与Fe (NTA)溶液按体积1:1混合后，混合液磁力搅拌30min，NTA的氨基与Au^PB@AuNPs的表面偶联，反应结束后离心洗涤除去未反应的 Fe(NTA)，去除上清液，剩下Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体备用。

(3)酪氨酸酶的检测

10^-3M多巴胺与不同浓度的酪氨酸酶溶液体积比(10:1)混合反应3min，取1.5μL步骤(2)制备好的Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体与1.5μL (DA与TYR)的反应产物，混合后滴于铝板上进行SERS检测，拉曼的激发波长为785nm。

图1是一种无背景干扰的SERS检测酪氨酸酶活性的方法的示意图，Au^PB@AuNPs做为SERS增强基底，Fe(NTA)与DA的酚羟基络合形成Fe(NTA)DA络合物，该络合物可以放大DA的拉曼信号。由于酪氨酸酶催化氧化多巴胺产生多巴醌，羟基变成羰基，因此不能与 Fe(NTA)形成络合物。在同一时间内，随着酪氨酸酶浓度增加，DA 含量的降低，同一时间内消耗的DA增加，混合液中剩余的DA含量少，拉曼信号降低。

图2是用实施例1制备的Au^PB@AuNPs-Fe(NTA)检测不同浓度酪氨酸酶的归一化的拉曼光谱图，酪氨酸酶浓度分别为10U/mL， 1U/mL，0.1U/mL，0.01U/mL,0.001U/mL,0U/mL。从图中可以看出酪氨酸酶浓度越高，1480cm^-1特征峰拉曼强度越低。图3是对应的线性关系图，发现单独利用特征峰1480cm^-1的强度与酪氨酸酶浓度做关系图，发现信号在波动，不存在线性关系，而利用I₁₄₈₀/₂₁₂₁与酪氨酸酶浓度做关系图，发现他们的线性关系良好。说明Au^PB@Au核壳结构内标分子PB可以用来校准信号，实现酪氨酸酶的定量检测。

1、酪氨酸酶检测的可行性分析

为了证明该方法的可行性，采用实施例1的样品首先检测了Au^PB@Au NPs-Fe(NTA)DA， Au^PB@AuNPs-Fe(NTA)-DA+TYR(300U/mL)，Au^PB@Au NPs-Fe(NTA)-DA+TYR(500U/mL)，Au^PB@Au NPs-Fe(NTA)的拉曼光谱图如图4所示，Au^PB@Au NPs做为检测基底，无背景信号干扰，当修饰上Fe(NTA)DA的时候，出现了拉曼特征峰，当出现酪氨酸酶的活性为500U/mL的时候，特征峰急剧降低，这是因为酪氨酸酶将体系中的多巴胺氧化成多巴醌，导致多巴胺的量降低，说明该方法可以用于酪氨酸酶的检测；其次，检测了血清、尿液、细胞、各种常用的拉曼探针分子和普鲁士蓝的SERS光谱图如图5所示，发现普鲁士蓝只有在2121cm^-1有个明显的特征峰，相比于其他几个常用的拉曼探针分子，普鲁士蓝避免了和细胞谱峰的重叠，因此在实际应用中具有可行性；最后，将实施例1中提出的一种无背景干扰的SERS用于酪氨酸酶特异性的检测，将酪氨酸酶替换成半胱氨酸，葡萄，谷氨酸，色氨酸和酪氨酸，其他条件保持不变，分别检测拉曼光谱，如图6所示，发现半胱氨酸，葡萄糖，谷氨酸，色氨酸和酪氨酸不会和多巴胺反应，因此I₁₄₈₀/₂₁₂₁的值不会发生变化，另一方面，按照实施例1的方法，往DA与TYR的反应体系中分别加入半胱氨酸,葡萄糖,谷氨酸,色氨酸和酪氨酸，I1480/2121的值降低，因为体系中存在酪氨酸酶会消耗体系中的DA，而这些氨基酸则不会影响I₁₄₈₀/₂₁₂₁。综上所述，说明该方法具备酪氨酸酶检测的可行性。

2、Hela细胞中TYR回收率的检测

在DMEM培养基(含10％胎牛血清(FBS)，青霉素(100单位/mL)和链霉素(100μg/mL))培养HeLa(人宫颈癌细胞系)细胞，并传代接种，在培养皿中，于37℃和5％CO₂下培养过夜，制备用于 SERS测定的细胞裂解液，将Hela细胞收集并以3000r/min的速度离心15分钟，然后用PBS(10mM)洗涤一次。然后以3000r/min的速度离心5分钟，去除上清液，将1mL RIPA裂解液放入细胞沉淀物中，上下吸几次以裂解细胞，并将其收集在1.5mL离心管中。将不同浓度的TYR加入Hela细胞裂解液中，然后按照实施例1中的检测步骤检测Hela细胞裂解物中TYR的回收率。浓度分别为为10、5、1、 0.5U/mL如表1所示:

表1显示说明根据相同的操作流程，Hela细胞裂解液的加标实验说明本方法测定酪氨酸酶具有优异的回收率。回收率：测量浓度与实际浓度的比率。通过下表可知，利用本发明检测的酪氨酸酶具有高的重现性，且误差较小，实际Hela细胞样品中酪氨酸酶的加标回收率在92.21％-117.41％范围,回收率高说明利用表面增强拉曼光谱的方法检测Hela细胞中的酪氨酸酶是可行的。

Claims (9)

1.一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底，其特征在于，由以下步方法制得：。

(1)Au^PB@Au NPs的合成

取10mL纳米金胶溶液，加入10-20μL浓度为0.1mol/L的普鲁士蓝(PB)溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@PB胶体；往10mL的制备好的Au@PB胶体中加入250μL浓度为6*10^-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5mL超纯水中，得到Au^PB@Au胶体；

(2)Fe(NTA)溶液的合成

首先取浓度为10^-3M的九水硝酸铁溶液和浓度为10^-3M的氨三乙酸三钠溶液按体积1:1混合后,往溶液中添加pH调节剂调节Fe(NTA)溶液的pH为7.0，混合液静置，得Fe(NTA)溶液；

(3)Au^PB@Au-Fe(NTA)SERS基底的合成

将步骤(1)制备好的Au^PB@Au胶体与步骤(2)制备的Fe(NTA)溶液按体积1:1混合后，搅拌混合后，离心洗涤除去未反应的Fe(NTA)，去除上清液，剩下Au^PB@Au-Fe(NTA)胶体备用。

2.根据权利要求1所述一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底，其特征在于，所述纳米金胶溶液的制备方法如下：取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1-1.5mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入到沸腾的上述氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶。

3.根据权利要求1所述一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底，其特征在于：所述步骤(2)的pH调节剂为浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液。

4.根据权利要求1所述一种用于检测酪氨酸酶活性的SERS基底，其特征在于：步骤(3)的搅拌时间为至少30min。

5.一种利用权利要求1-4任一项制备的SERS基底检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：

S1、制备不同浓度的酪氨酸酶溶液标准溶液，加入多巴胺进行共培养，接着加入Au^PB@Au-Fe(NTA)SERS基底混匀后，进行拉曼检测；记录Fe(NTA)DA的拉曼特征峰1480cm^-1信号与普鲁士蓝2121cm^-1信号强度的比值(I₁₄₈₀/₂₁₂₁)为纵坐标，酪氨酸酶活性为横坐标作出相对应的工作曲线；

S2、检测待测样品中酪氨酸酶的回收率(％)：将所述步骤S1中所述酪氨酸酶的标准溶液替换为待测样品的溶液，按照所述步骤S1所述方法检测所述待测样品，对照工作曲线，计算得出细胞裂解液中酪氨酸酶的回收率。

6.根据权利要求5所述一种检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：所述工作曲线为Y＝0.163Log[C]+4.414,其中Y为I₁₄₈₀/₂₁₂₁；C为酪氨酸酶的浓度。

7.根据权利要求6所述一种检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：所述酪氨酸酶的最低检测限0.0003U/mL。

8.根据权利要求7所述一种检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：所述步骤S1中所述底物多巴胺的浓度为10^-3M，多巴胺与酪氨酸酶的体积比为10:1，共培养时间为3min。

9.根据权利要求8所述一种检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：所述步骤S2中检测待测样品为Hela细胞裂解液。

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