CN109342391A - 基于可循环使用sers传感器的酪氨酸酶活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法。其包括如下步骤：(a)提供表面增强拉曼散射(SERS)传感器，该传感器为一自组装电极，该电极上具有SERS活性的纳米金颗粒膜层，在纳米金颗粒膜层上具有拉曼信号分子；(b)建立酪氨酸酶活性检测指纹图谱及标准曲线；(c)获取所述SERS传感器与样品溶液中的酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱；(d)将步骤(c)获得的样品溶液的表面增强拉曼光谱与所述指纹图谱进行比较，并进行定性定量分析。(e)将检测后的传感器利用电化学调控实现可循环利用。本发明优点是，克服现有检测方法的技术不足，快速、灵敏地检测酪氨酸酶的活性并且传感器可循环使用有望实现对酪氨酸酶的自动化检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学分析领域，具体地说，是一种基于表面增强拉曼散射(SERS)效应的可循环使用SERS传感器用于酪氨酸酶活性检测的方法。
背景技术
酪氨酸酶作为一种重要的氧化还原酶，在人体内黑色素的合成过程中起着至关重要的作用。在人体中，非正常水平的酪氨酸酶将引发白癜风，雀斑和帕金森氏综合征等疾病，并且酪氨酸酶是黑色素瘤的标志物之一。因此，开发有效的检测酪氨酸酶活性的方法将显著提升酪氨酸酶相关疾病的早期诊断水平并促进深入了解酪氨酸酶的生理功能。
目前用于检测酪氨酸酶的方法主要有：比色法、电化学法、高效液相色谱法和荧光法等，然而，这些方法或灵敏度不佳难以胜任低浓度样品检测，或仪器昂贵，成本较高，或容易受到污染需要频繁校准。相比之下，荧光法的灵敏度和空间分辨率较高，但检测常常受到生物样品自身荧光背景干扰以及光漂白、光毒性的影响。
表面增强拉曼散射(SERS，Surface-enhanced Raman Scattering)是一种能够提供物质结构及化学组成信息的分析技术，它具有高灵敏度、高选择性、快速响应、抗光漂白、抗光毒性等优异的分析性能。这些综合优势使表面增强拉曼光谱成为广泛应用于生物分析的检测策略，例如蛋白鉴定、DNA检测和细胞分析等。但由于蛋白分子较为复杂，表面增强拉曼光谱谱图的解析较为困难，致使其直接检测选择性受到限制。另外，生命体中的酪氨酸酶因其分子较为复杂难以直接获取特征表面增强拉曼光谱信号，因此相关的表面增强拉曼光谱检测研究较为少见。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其能够充分发挥表面增强拉曼光谱的技术优势、克服现有检测方法的技术不足，快速、灵敏和具有选择性地检测血清中酪氨酸酶的活性。
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，包括如下步骤：(a)提供一表面增强拉曼散射传感器，所述表面增强拉曼散射传感器为一自主装电极，在所述电极上具有表面增强拉曼活性的纳米金颗粒膜层，在所述纳米金颗粒膜层上具有拉曼信号分子；(b)建立酪氨酸酶活性检测指纹图谱及标准曲线：将所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性的酪氨酸酶的标准溶液中若干时间，取出并干燥后用拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得所述表面增强拉曼散射传感器与不同活性的酪氨酸酶的标准溶液反应后的表面增强拉曼光谱，作为指纹图谱，并建立特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线；(c)获取所述表面增强拉曼散射传感器与样品溶液中的酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱：将所述表面增强拉曼散射传感器置于具有酪氨酸酶的样品溶液中若干时间，取出并干燥后用拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得所述表面增强拉曼散射传感器与样品溶液反应后的表面增强拉曼光谱，其中所述表面增强拉曼散射传感器置于具有酪氨酸酶的样品溶液中的时间与步骤(b)中所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性的酪氨酸酶的标准溶液中的时间相同；(d)将步骤(c)获得的样品溶液的表面增强拉曼光谱与所述指纹图谱进行比较，定性分析该样品溶液中是否存在酪氨酸酶，并将表面增强拉曼光谱的特征峰的相对强度与所述标准曲线进行比较，定量分析得到样品溶液中的酪氨酸酶的活性；(e)将检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器利用电化学调控实现可循环利用：对检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器施加一恒定电位，并持续若干时间，以对所述表面增强拉曼散射传感器进行调节，实现对表面增强拉曼散射传感器的回收利用。
在一实施例中，所述表面增强拉曼散射传感器的制备方法包括如下步骤：(a1)制备具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底：配制质量分数为0.05％～0.1％的氯金酸溶液，加热至沸腾；取质量分数为1％～2％的柠檬酸钠缓慢滴加至所述氯金酸溶液中，并保持煮沸，煮沸时间大于15分钟；静置并冷却至室温，得到具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底；(a2)制备所述表面增强拉曼散射传感器：浓缩所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底，得到浓缩的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶；将浓缩后的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶滴加在一功能化的电极上，所述纳米颗粒金胶在所述电极上形成具有表面增强拉曼活性的纳米金颗粒膜层；将一拉曼信号分子溶液滴加在所述纳米金颗粒膜层上，形成所述表面增强拉曼散射传感器。
在一实施例中，在步骤(a2)中，浓缩所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底的方法为：将所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底置于离心装置中离心，去除上层清液，得到浓缩的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶。
在一实施例中，在步骤(a2)中，制备功能化的电极的方法为：将ITO电极浸泡在0.5mM～1mM硅烷化试剂的丙酮溶液中大于24小时，并干燥，得到功能化的电极。
在一实施例中，在步骤(a2)中，所述拉曼信号分子为4-巯基邻苯二酚分子。
在一实施例中，4-巯基邻苯二酚的制备方法包括如下步骤：在惰性气氛下，将一定量的3,4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷却至零摄氏度以下；向冷却的3,4-二甲氧基苯基甲硫醇中加入一定量的三溴化硼，反应10～12小时，反应物的质量比为1:2～1:4；分离有机相，干燥，得到4-巯基邻苯二酚。
在一实施例中，步骤(e)中对检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器施加一恒定电位的方法为：将使用后的表面增强拉曼散射传感器作为工作电极，将所述工作电极、一对电极及一参考电极组成三电极体系；对所述工作电极施加一恒电位，并持续100s～120s，以对所述表面增强拉曼散射传感器进行调节，所述恒电位的范围为-0.3V～-0.5V；调节后，冲洗及干燥所述表面增强拉曼散射传感器，使所述表面增强拉曼散射传感器恢复至未使用前的状态。
在一实施例中，所述样品溶液为血清或者含有酪氨酸酶抑制剂的酪氨酸酶体系。
本发明的优点在于，将纳米结构与拉曼信号分子相结合来制备表面增强拉曼光谱传感器，其将具有表面增强拉曼光谱活性和与待测物反应的性能集于传感器一身，可产生灵敏清晰的表面增强拉曼光谱信号，则只需要观察传感器与目标检测物反应前后产生的光谱变化即可实现检测，充分发挥表面增强拉曼光谱的技术优势，克服现有检测方法的技术不足，快速、灵敏和具有选择性地检测血清中酪氨酸酶的活性，还可以方便地评价酪氨酸酶抑制剂，可用于相关药物筛选。
本发明还具有如下优点：(1)操作过程简单，无需价格昂贵的仪器，成本低；(2)所制备的传感器可回收，可用于循环检测酪氨酸酶活性；(3)有利于在偏远地区和资源有限的环境中应用点护理诊断(POC)的快速检测。
附图说明
图1是本发明基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法的步骤示意图；
图2是具有表面增强拉曼活性的红色纳米颗粒金胶的透射电镜图；
图3A是表面增强拉曼散射传感器的结构示意图；
图3B是所述表面增强拉曼散射传感器的扫描电镜图；
图4是所述表面增强拉曼散射传感器与酪氨酸酶反应前的表面增强拉曼光谱指纹图谱；
图5是所述表面增强拉曼散射传感器与多个不同活性的酪氨酸酶标准溶液反应后的表面增强拉曼光谱指纹图谱；
图6是所述表面增强拉曼散射传感器与不同活性的酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱指纹图谱的特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线；
图7是血清内酪氨酸酶与所述表面增强拉曼散射传感器反应后的表面增强拉曼光谱图；
图8是采用电化学恒电位调控后的所述表面增强拉曼散射传感器的表面增强拉曼光谱图；
图9是所述表面增强拉曼散射传感器与加入苯甲酸的酪氨酸酶体系反应的表面增强拉曼光谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法的具体实施方式做详细说明。
图1是本发明基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法的步骤示意图。请参阅图1，本发明基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法包括如下步骤：
步骤S10，提供一表面增强拉曼散射传感器，所述表面增强拉曼散射传感器为一自主装电极，在所述电极上具有表面增强拉曼活性的纳米金颗粒膜层，在所述纳米金颗粒膜层上具有拉曼信号分子。
所述表面增强拉曼散射传感器的制备方法很多种，只要能够形成所述表面增强拉曼散射传感器的结构即可。下文举例说明所述表面增强拉曼散射传感器的一种制备方法，其包括如下步骤：
首先，制备具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底。具体过程如下：
(1)配制质量分数为0.05％～0.1％的氯金酸溶液，加热至沸腾。
所述沸腾指的是正在加热的溶液在自然环境中呈沸腾状，而由于不同海拔高度溶液沸腾的温度不同，本文对此不进行限定。
(2)取质量分数为1％～2％的柠檬酸钠缓慢滴加至所述氯金酸溶液中，并保持煮沸，煮沸时间大于15分钟。
所述还原剂溶液与所述贵金属酸溶液的反应时间根据具体反应情况而定，例如，所述还原剂溶液与所述贵金属酸溶液的反应时间为所述还原剂能够将贵金属酸溶液中的贵金属离子全部还原的时间。
(3)将反应后溶液静置并冷却至室温，得到具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底。
其次，制备所述表面增强拉曼散射传感器。具体过程如下：
(1)浓缩所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底，得到浓缩的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶。
其包括如下步骤：将所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底置于离心装置中离心，例如，将所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底置于离心管中对称放入离心机高速离心若干时间，离心后，去除上层清液，得到高浓缩的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶。
(2)将浓缩后的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶滴加在一功能化的电极上，所述纳米颗粒金胶在所述电极上形成具有表面增强拉曼活性的纳米金颗粒膜层。
所述电极包括但不限于ITO电极。其中功能化的目的在于提高电极与纳米颗粒金胶的结合性能，对于ITO电极而言，其功能化的方法为，将ITO电极浸泡在0.5mM～1mM硅烷化试剂的丙酮溶液中大于24小时，并干燥，得到功能化的ITO电极。其中，硅烷化试剂包括但不限于3-巯丙基三甲氧基硅烷。进一步，在浸泡步骤前，还包括一对所述电极进行清洗及干燥的步骤，以提供洁净的电极。其中，将浓缩后的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶滴加在功能化的电极后静置若干时间，例如24小时，所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶在所述电极表面平铺，形成一致密的纳米金颗粒膜层。
(3)将一拉曼信号分子溶液滴加在所述纳米金颗粒膜层上，形成所述表面增强拉曼散射传感器。
其中，所述拉曼信号分子包括但不限于4-巯基邻苯二酚分子。以下列举4-巯基邻苯二酚的一种制备方法，其包括如下步骤：
在惰性气氛下，将一定量的3,4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷却至零摄氏度以下，例如，在氮气保护下将3,4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷却至-10℃。向冷却的3,4-二甲氧基苯基甲硫醇中加入一定量的三溴化硼，反应若干时间，例如，反应10～12小时，反应物的质量比为1:2～1:4；分离有机相，干燥，得到4-巯基邻苯二酚。
下面列举所述表面增强拉曼散射传感器的制备方法的一实施例。
取一片干净的ITO电极分别用去离子水和丙酮超声清洗30分钟，用氮气吹干；将ITO电极浸泡入含有1.0mM硅烷化试剂的丙酮溶液中功能化24小时；用丙酮洗涤，氮气吹干；取1～2mL具有表面增强拉曼活性的贵金属纳米颗粒基底置于离心管中对称放入离心机高速离心5分钟，去除上层清液，保留下层高浓度金胶；取2.5～3μL下层高浓度金胶滴加至功能化后的ITO电极上过夜静置，直至形成致密的金膜；将2.5～3μL的拉曼信号分子滴加在金膜上，组装成所述表面增强拉曼散射传感器。
步骤S11，建立酪氨酸酶活性检测指纹图谱及标准曲线。
将所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性的酪氨酸酶的标准溶液中若干时间。具体地说，提供多个已知酪氨酸酶活性的含有酪氨酸酶的溶液作为标准溶液，将所述表面增强拉曼散射传感器置于该些标准溶液中若干时间。取出并干燥后用拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得所述表面增强拉曼散射传感器与不同活性的酪氨酸酶的标准溶液反应后的表面增强拉曼光谱，作为指纹图谱，并建立特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线。
步骤S12，获取所述表面增强拉曼散射传感器与样品溶液中的酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱。
将所述表面增强拉曼散射传感器置于具有酪氨酸酶的样品溶液中若干时间，取出并干燥后用拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得所述表面增强拉曼散射传感器与样品溶液反应后的表面增强拉曼光谱。其中所述表面增强拉曼散射传感器置于具有酪氨酸酶的样品溶液中的时间与步骤S11中所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性的酪氨酸酶的标准溶液中的时间相同。所述样品包括但不限于为血清或者含有酪氨酸酶抑制剂的酪氨酸酶体系。
步骤S13，将步骤S12获得的样品溶液的表面增强拉曼光谱与步骤S11获得的所述指纹图谱进行比较，定性分析样品溶液中是否存在酪氨酸酶，将表面增强拉曼光谱的特征峰的相对强度与步骤S11获得的所述标准曲线进行比较，定量分析得到样品溶液中的酪氨酸酶的活性。
本发明基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法将纳米结构与拉曼信号分子相结合来制备表面增强拉曼光谱传感器，其将具有表面增强拉曼光谱活性和与待测物反应的性能集于传感器一身，可产生灵敏清晰的表面增强拉曼光谱信号，则只需要观察传感器与目标检测物反应前后产生的光谱变化即可实现检测。其中，所述表面增强拉曼散射传感器可事先制备，在需要检测时使用即可，该种检测方法有利于在偏远地区和资源有限的环境中应用点护理诊断(POC)的快速检测，并有望实现对酪氨酸酶的可自动化检测。
另外，该方法不仅可以快速、灵敏和具有选择性地检测样品中酪氨酸酶的活性，还可以在电化学恒电位的调控下，实现所述表面增强拉曼散射传感器的回收再利用。本发明还包括步骤S14：将检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器利用电化学调控实现可循环利用。具体地说，对检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器施加一恒定电位，并持续若干时间，以对所述表面增强拉曼散射传感器进行调节，实现对表面增强拉曼散射传感器的回收利用。对检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器施加一恒定电位方法包括如下步骤：
将使用后的表面增强拉曼散射传感器作为工作电极，将所述工作电极、一对电极及一参考电极组成三电极体系。使用后的表面增强拉曼散射传感器指的是执行上文步骤S11及步骤S12的操作后的表面增强拉曼散射传感器，所述对电极包括但不限于贵金属电极，例如铂电极，所述参考电极包括但不限于Ag/AgCl参比电极。
对所述工作电极施加一恒定电位，并持续持续100～120s，以对所述表面增强拉曼散射传感器进行调节，所述恒电位的范围为-0.3V～-0.5V。例如，对所述工作电极施加-0.3V恒定电位，并持续120s。
调节后，冲洗及干燥所述表面增强拉曼散射传感器，使所述表面增强拉曼散射传感器恢复至未使用前的状态。例如，调节后的表面增强拉曼散射传感器再利用去离子水冲洗、氮气吹干，恢复至未使用前的状态。
经过该电化学恒电位处理，所述表面增强拉曼散射传感器可再次用于酪氨酸酶活性检测，实现所述表面增强拉曼散射传感器的回收再利用。其中，对同一表面增强拉曼散射传感器可多次采用电化学恒电位方法进行调整，这个过程重复多次可评价表面增强拉曼散射传感器的可回收性。
下面列举本发明基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法的实施例。
实施例1
1、制备表面增强拉曼散射传感器，具体包括如下步骤：
(1)制备具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底。
配制0.05％的三水合四氯金酸溶液100mL，置于干净的烧杯中加热至100℃。取0.1g的柠檬酸钠置于10mL的超纯水中充分溶解后缓慢滴加至上述溶液中，持续煮沸15分钟后静置冷却至室温，得到具有表面增强拉曼活性的红色纳米颗粒金胶。图2是具有表面增强拉曼活性的红色纳米颗粒金胶的透射电镜图，从图2可以看出，所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶粒径均一，为较好的表面增强拉曼基底。
(2)制备用于酪氨酸酶活性检测的表面增强拉曼散射传感器。
取一片干净的ITO电极分别用去离子水和丙酮超声清洗30分钟后，用氮气吹干。随后，将ITO电极浸泡入含有1.0mM 3-巯丙基三甲氧基硅烷的丙酮溶液中功能化24小时，然后用丙酮洗涤，氮气吹干。取步骤(1)获得的金胶1mL置于离心管中对称放入离心机高速离心5分钟，去除上层清液，取下层高浓度金胶2.5μL滴加至功能化后的ITO电极上过夜静置，直至形成致密的金膜。将2.5μL,10mM的4-巯基邻苯二酚滴加在金膜上，组装成用于血清中酪氨酸酶活性检测的可回收表面增强拉曼散射传感器。图3A是表面增强拉曼散射传感器的结构示意图，图3B是所述表面增强拉曼散射传感器的扫描电镜图。从图3A及图3B可以看出，在ITO电极10上具有一致密的金膜11。
(3)建立酪氨酸酶活性检测指纹图谱及标准曲线。
将步骤(2)获得的所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性下的酪氨酸酶中反应3分钟，取出后用氮气吹干并用便捷式拉曼光谱仪对传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得其用于定性分析的表面增强拉曼光谱指纹图谱，建立特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线，用于定量分析。其中，图4是所述表面增强拉曼散射传感器与酪氨酸酶标准溶液反应前的表面增强拉曼光谱指纹图谱，图5是所述表面增强拉曼散射传感器与多个不同活性的酪氨酸酶标准溶液反应后的表面增强拉曼光谱指纹图谱，其中，标准溶液的活性标记在图示的右侧。图6为所述表面增强拉曼散射传感器与不同活性的酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱指纹图谱的特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线。
(4)获取所述表面增强拉曼散射传感器与血清中酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱。
将步骤(2)获得的所述表面增强拉曼散射传感器置于血清溶液中反应3分钟，取出后用氮气吹干并用便捷式拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测。图7为血清内酪氨酸酶与所述表面增强拉曼散射传感器反应前后的表面增强拉曼光谱图。
(5)对照与分析
将步骤(4)获得的表面增强拉曼光谱与步骤(3)获得的表面增强拉曼光谱指纹图谱以及特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线进行比较，可初步确定该血清中的酪氨酸活性为0.38U/mL。
(6)通过电化学调控实现所述表面增强拉曼散射传感器的循环利用
步骤(3)及步骤(4)中使用后的所述表面增强拉曼散射传感器利用电化学恒电位技术实现回收利用。将使用后的所述表面增强拉曼散射传感器作为工作电极、铂丝作为对电极、Ag/AgCl电极作为参考电极组成的三电极体系，在电化学工作站对工作电极施加-0.3V恒定电位120s进行调节，调节后的传感器再利用去离子水冲洗后氮气吹干，这个过程重复多次后，使用后的所述表面增强拉曼散射传感器恢复至使用前的状态，可用于酪氨酸酶活性检测。图8为采用电化学恒电位调控后的所述表面增强拉曼散射传感器的表面增强拉曼光谱图。从图8可以看出，指纹图谱恢复到拉曼信号分子的指纹图谱，说明该表面增强拉曼散射传感器被回收。
实施例2
1、制备表面增强拉曼散射传感器，具体包括如下步骤：
(1)制备具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底。
配制0.05％的三水合四氯金酸溶液100mL，置于干净的烧杯中加热至100℃。取0.1g的柠檬酸钠置于10mL的超纯水中充分溶解后缓慢滴加至上述溶液中,持续煮沸15分钟后静置冷却至室温，得到具有表面增强拉曼活性的红色纳米颗粒金胶。
(2)制备用于酪氨酸酶活性检测的表面增强拉曼散射传感器。
取一片干净的ITO电极分别用去离子水和丙酮超声清洗30分钟后，用氮气吹干。随后，将ITO电极浸泡入含有1.0mM 3-巯丙基三甲氧基硅烷的丙酮溶液中功能化24小时，然后用丙酮洗涤，氮气吹干。取步骤(1)获得的金胶1mL置于离心管中对称放入离心机高速离心5分钟，去除上层清液，取下层高浓度金胶2.5μL滴加至功能化后的ITO电极上过夜静置，直至形成致密的金膜。将2.5μL,10mM的4-巯基邻苯二酚滴加在金膜上，组装成用于血清中酪氨酸酶活性检测的可回收表面增强拉曼散射传感器。
(3)建立酪氨酸酶活性检测指纹图谱及标准曲线。
将步骤(2)获得的所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性下的酪氨酸酶中反应3分钟，取出后用氮气吹干并用便捷式拉曼光谱仪对传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得其用于定性分析的表面增强拉曼光谱指纹图谱，建立特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线，用于定量分析。
(4)利用所述表面增强拉曼散射传感器实现对酪氨酸酶抑制剂的筛查与检测
将步骤(2)获得的所述表面增强拉曼散射传感器置于4mM的苯甲酸和10U/mL酪氨酸酶混合溶液中反应3分钟，取出后用氮气吹干，并用便捷式拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测。图9为所述表面增强拉曼散射传感器与加入苯甲酸的酪氨酸酶体系反应的表面增强拉曼光谱。将该图与步骤(3)中的10U/mL的指纹图谱进行对比，可以看出酪氨酸酶的活性被抑制。
(5)通过电化学调控实现所述表面增强拉曼散射传感器的循环利用
步骤(3)及步骤(4)中使用后的所述表面增强拉曼散射传感器利用电化学恒电位技术实现回收利用。将使用后的所述表面增强拉曼散射传感器作为工作电极、铂丝作为对电极、Ag/AgCl电极作为参考电极组成的三电极体系，在电化学工作站对工作电极施加-0.3V恒定电位120s进行调节，调节后的传感器再利用去离子水冲洗后氮气吹干，这个过程重复多次后，使用后的所述表面增强拉曼散射传感器恢复至使用前的状态，可用于酪氨酸酶活性检测。
实施例3
(1)制备具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底。
配制0.1％的三水合四氯金酸溶液100mL，置于干净的烧杯中加热至95℃。取0.2g的柠檬酸钠置于10mL的超纯水中充分溶解后缓慢滴加至上述溶液中，持续煮沸20分钟，静置冷却至室温，得到具有表面增强拉曼活性的红色纳米颗粒金胶。
(2)制备用于酪氨酸酶活性检测的表面增强拉曼散射传感器
取一片干净的ITO电极分别用去离子水和丙酮超声清洗30分钟，用氮气吹干。随后，将ITO电极浸泡入含有1.0mM 3-巯丙基三甲氧基硅烷的丙酮溶液中功能化24小时，然后用丙酮洗涤，氮气吹干。取步骤(1)获得的金胶1mL置于离心管中对称放入离心机高速离心5分钟，去除上层清液，得到下层高浓度金胶；将3μL下层高浓度金胶滴加至功能化后的ITO电极上过夜静置，直至形成致密的金膜。将3μL，5mM的4-巯基邻苯二酚滴加在金膜上，组装成用于血清中酪氨酸酶活性检测的可回收表面增强拉曼光谱传感器。
(3)建立酪氨酸酶活性检测标准曲线
将步骤(2)获得的表面增强拉曼散射传感器置于不同活性下的酪氨酸酶中反应5分钟，取出后用氮气吹干，并用便捷式拉曼光谱仪对传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得其用于定性分析的表面增强拉曼光谱指纹图谱，建立特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线，用于定量分析。
(4)获取表面增强拉曼散射传感器与血清中酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱
将步骤(2)获得的表面增强拉曼散射传感器置于血清溶液中反应5分钟，取出后用氮气吹干并用便捷式拉曼光谱仪对传感器进行表面拉曼光谱的检测。
(5)对照与分析
将步骤(4)获得的表面增强拉曼光谱与步骤(3)获得的表面增强拉曼光谱指纹图谱以及特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线进行比较，可初步确定该血清中的酪氨酸活性为0.46U/mL。
(6)通过电化学调控实现所述表面增强拉曼散射传感器的循环利用
步骤(3)及步骤(4)中使用后的所述表面增强拉曼散射传感器利用电化学恒电位技术实现回收利用。将使用后的所述表面增强拉曼散射传感器作为工作电极、铂丝作为对电极、Ag/AgCl电极作为参考电极组成的三电极体系，在电化学工作站对工作电极施加-0.3V恒定电位120s进行调节，调节后的传感器再利用去离子水冲洗后氮气吹干，这个过程重复多次后，使用后的所述表面增强拉曼散射传感器恢复至使用前的状态，可用于酪氨酸酶活性检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)提供一表面增强拉曼散射传感器，所述表面增强拉曼散射传感器为一自主装电极，在所述电极上具有表面增强拉曼活性的纳米金颗粒膜层，在所述纳米金颗粒膜层上具有拉曼信号分子；
(b)建立酪氨酸酶活性检测指纹图谱及标准曲线：
将所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性的酪氨酸酶的标准溶液中若干时间，取出并干燥后用拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得所述表面增强拉曼散射传感器与不同活性的酪氨酸酶的标准溶液反应后的表面增强拉曼光谱，作为指纹图谱，并建立特征峰相对强度-酪氨酸酶活性的对数的标准曲线；
(c)获取所述表面增强拉曼散射传感器与样品溶液中的酪氨酸酶反应后的表面增强拉曼光谱：
将所述表面增强拉曼散射传感器置于具有酪氨酸酶的样品溶液中若干时间，取出并干燥后用拉曼光谱仪对所述表面增强拉曼散射传感器进行表面拉曼光谱的检测，获得所述表面增强拉曼散射传感器与样品溶液反应后的表面增强拉曼光谱，其中所述表面增强拉曼散射传感器置于具有酪氨酸酶的样品溶液中的时间与步骤(b)中所述表面增强拉曼散射传感器置于不同活性的酪氨酸酶的标准溶液中的时间相同；
(d)将步骤(c)获得的样品溶液的表面增强拉曼光谱与所述指纹图谱进行比较，定性分析该样品溶液中是否存在酪氨酸酶，并将表面增强拉曼光谱的特征峰的相对强度与所述标准曲线进行比较，定量分析得到样品溶液中的酪氨酸酶的活性；
(e)将检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器利用电化学调控实现可循环利用：
对检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器施加一恒定电位，并持续若干时间，以对所述表面增强拉曼散射传感器进行调节，实现对表面增强拉曼散射传感器的回收利用。
2.根据权利要求1所述的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射传感器的制备方法包括如下步骤：
(a1)制备具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底：
配制质量分数为0.05％～0.1％的氯金酸溶液，加热至沸腾；
取质量分数为1％～2％的柠檬酸钠缓慢滴加至所述氯金酸溶液中，并保持煮沸，煮沸时间大于15分钟；
静置并冷却至室温，得到具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底；
(a2)制备所述表面增强拉曼散射传感器：
浓缩所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底，得到浓缩的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶；
将浓缩后的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶滴加在一功能化的电极上，所述纳米颗粒金胶在所述电极上形成具有表面增强拉曼活性的纳米金颗粒膜层；
将一拉曼信号分子溶液滴加在所述纳米金颗粒膜层上，形成所述表面增强拉曼散射传感器。
3.根据权利要求2所述的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，在步骤(a2)中，浓缩所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底的方法为：将所述具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶基底置于离心装置中离心，去除上层清液，得到浓缩的具有表面增强拉曼活性的纳米颗粒金胶。
4.根据权利要求2所述的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，在步骤(a2)中，制备功能化的电极的方法为：
将ITO电极浸泡在0.5mM～1mM硅烷化试剂的丙酮溶液中大于24小时，并干燥，得到功能化的电极。
5.根据权利要求2所述的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，在步骤(a2)中，所述拉曼信号分子为4-巯基邻苯二酚分子。
6.根据权利要求5所述的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，4-巯基邻苯二酚的制备方法包括如下步骤：
在惰性气氛下，将一定量的3,4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷却至零摄氏度以下；
向冷却的3,4-二甲氧基苯基甲硫醇中加入一定量的三溴化硼，反应10～12小时，反应物的质量比为1:2～1:4；
分离有机相，干燥，得到4-巯基邻苯二酚。
7.根据权利要求1所述的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，步骤(e)中对检测酪氨酸酶活性后的表面增强拉曼散射传感器施加一恒定电位的方法为：
将使用后的表面增强拉曼散射传感器作为工作电极，将所述工作电极、一对电极及一参考电极组成三电极体系；
对所述工作电极施加一恒电位，并持续100s～120s，以对所述表面增强拉曼散射传感器进行调节，所述恒电位的范围为-0.3V～-0.5V；
调节后，冲洗及干燥所述表面增强拉曼散射传感器，使所述表面增强拉曼散射传感器恢复至未使用前的状态。
8.根据权利要求1所述的基于可循环使用SERS传感器的酪氨酸酶活性检测方法，其特征在于，所述样品为血清样品或者含有酪氨酸酶抑制剂的酪氨酸酶溶液体系。
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