CN110699422B - 一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法 - Google Patents

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    • G01N2333/90212—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)

Abstract

本发明中，基于金纳米簇(AuNCs)的荧光对物质的氧化还原状态依赖性建立了新型荧光增强型生物测定体系。AuNCs的荧光被铁氰化物明显淬灭，而不受其相应的亚铁氰化物的影响。通过利用乳酸脱氢酶(LDH)/心肌黄酶的酶级联催化反应来催化转化铁氰化物变成亚铁氰化物，开启了金纳米簇的荧光。与文献所报道的基于金纳米簇的猝灭法酶检测体系相比，该方法具有明显的优势，检测乳酸的线性范围为5×10‑7‑5×10‑ 3M，检测限低至0.09μM。

Description

一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法
技术领域
本发明涉及一种分析检测技术,属于分析检测技术领域。
背景技术
描述与本发明最接近的现有技术的状况和存在的问题。
贵金属纳米团簇，例如金纳米簇(AuNCs)，具有强发光性，良好的光稳定性，高生物相容性和大的斯托克斯位移等特征[XieJ.；ZhengY.；YingJ.Y.J.Am.Chem.Soc.2009,131,888-889；LuY.；ChenW.Chem.Soc.Rev.2012,41,3594-3623]，使其广泛应用于生物传感、生物成像和纳米医学等领域[ChenL.Y.；WangC.W.；YuanZ.；ChangH.T.Anal.Chem.2015,87,216-229；DoaneT.L；BurdaC.Chem.Soc.Rev.2012,41,2885-2911]。AuNCs与不同天然酶(主要是氧化还原酶和水解酶)的联合应用已被证明是检测生物分子的良好平台。例如，酶催化反应产生的H2O2或醌类物质是AuNCs的有效淬灭剂，可用来检测各种酶催化反应，包括葡萄糖氧化酶[JinL.；ShangL.；GuoS.；FangY.；WenD.；WangL.；YinJ.；DongS.Biosens.Bioelectron.2011,26,1965-1969]，胆固醇氧化酶[ChenX.；BakerG.A.Analyst2013,138,7299-302]，酪氨酸酶[TengY.；JiaX.；LiJ.；WangE.Anal.Chem.2015,87,4897-4902]或乙酰胆碱酯酶/胆碱氧化酶的酶级联[LiH.；GuoY.；XiaoL.；ChenB.Biosens.Bioelectron.2014,59,289-292]进行酶的活性/底物/抑制剂的检测。另外，酶催化所诱导释放的金属离子(Cu2+或Fe3+)也可以作为AuNCs的猝灭剂，用于检测碱性磷酸酶[ChenY.；LiW.,；WangY.；YangX.；ChenJ.；JiangY.；YuC.；LinQ.J.Mater.Chem.C2014,2,4080-4085]和焦磷酸酶[DengH.H.；WangF.F.；ShiX.Q.；PengH.P.；LiuA.L.；XiaX.H.；ChenW.Biosens.Bioelectron.2016,83,1-8]的活性。AuNCs还可以通过碱性磷酸酶/酪氨酸酶的级联反应生成儿茶酚诱导硼酸修饰的AuNCs的荧光猝灭来检测碱性磷酸酶的活性[LiuQ.；LiH.；JinR.；LiN.；YanX.；SuX.Sens.Actuators,B:Chem.2019,281,175-181]。研究还表明，胰蛋白酶消化蛋白质模板可导致AuNCs的荧光猝灭，从而可以检测胰蛋白酶[HuL.；HanS.；ParveenS.；YuanY.；ZhangL.；XuG.Biosens.Bioelectron.2012,32,297-299]。虽然应用较多，但报道的这些基于AuNCs的酶传感体系仍然局限于有限数量的天然酶，并且基本采用荧光猝灭机制进行测定，这具有较大的局限性：一方面，信号猝灭分析通常具有低灵敏度和高的背景；另一方面，它们很有可能产生假阳性信号，因为溶剂或其它基质可能很容易导致荧光猝灭。探索基于金纳米簇的、具有高灵敏度和高准确性的新型信号增强型酶检测无疑具有很大的吸引力。
为了提高酶生物检测的灵敏度和选择性，研究人员探索了一些合成化合物(称为人工底物)来取代酶的天然底物。例如，已知铁氰化物/亚铁氰化物氧化还原对具有优异的电子转移能力，并已广泛应用作各种氧化还原酶的人工底物，包括葡萄糖氧化酶(GOx)[SharmaD.；Lim Y.；LeeY.；ShinH.Anal.Chim.Acta2015,889,194-202]，辣根过氧化物酶(HRP)[
Figure BDA0002252807820000021
N.；Ruiz G.；ReviejoJ.A.；PingarrónJ.M.Anal.Chem.2001,73,1190-1195]，心肌黄酶[GrosP.；ComtatM.Biosens.Bioelectron.2005,20,204-210]等，用于构建电化学中的生物传感器。然而，据我们所知，铁氰化物/亚铁氰化物介导的生物催化反应与荧光探针相结合用于新型酶生物分析尚未报道。该发明中，我们研究了铁氰化物和亚铁氰化物与AuNCs的相互作用，用于构建信号增强型荧光生物传感平台。我们发现AuNCs和铁氰化物之间存在光致电子转移(PET)和内部过滤效应(IFE)，使得铁氰化物对AuNCs存在显著的荧光猝灭。然而，AuNCs的光致发光几乎不受亚铁氰化物的影响。因此，上述现象，我们能够通过将AuNCs与LDH/心肌黄酶的酶级联反应来建立新的荧光生物测定体系：通过铁氰化物向亚铁氰化物的生物催化转化来进行检测乳酸的高灵敏检测，并发现乳酸的检测限低至0.09μM。该工作的创新与优势是在荧光生物分析中首次使用了铁氰化物/亚铁氰化物作为底物，与现有技术的AuNCs荧光酶检测体系相比，它可以实现信号增强型的高度灵敏、选择性检测。
发明内容
技术问题：本发明要解决的技术问题，要达到的目标。
我们基于金纳米簇(AuNCs)对物质的氧化还原状态依赖性提出了新型的信号增强型酶生物测定体系。AuNCs的荧光明显被铁氰化物淬灭，同时不受其相应的亚铁氰化物的影响。因此，通过使用乳酸脱氢酶(LDH)/心肌黄酶的酶级联来催化转化铁氰化物为亚铁氰化物，从而开启了检测系统的荧光，实现了乳酸的灵敏检测。
技术方案：本发明完整的技术手段和方法。
本发明的目的可通过如下技术措施来实现：
a、金纳米簇的合成：在剧烈搅拌下将HAuCl4溶液与表面包覆剂溶液混合后，向其加入0.2mL一定浓度的NaOH溶液，并在37℃剧烈搅拌下反应一定时间；所得产物用半透膜在超纯水中透析24小时，储存在4℃下备用；
b、乳酸的荧光检测：首先，在0.2M的pH＝7.5的磷酸缓冲中，将1.0mM的氧化型辅酶，6.0mg/mL的乳酸脱氢酶和不同浓度的乳酸溶液混合并在37℃下孵育30分钟；然后，将1.0mg/mL的心肌黄酶和1.0mM的铁氰化钾加入上述溶液中并在37℃下继续反应30分钟；最后，加入40μL的金纳米簇并用0.2MpH＝5的磷酸缓冲稀释至1.0mL，在400nm的激发波长下测量溶液的荧光强度；
本发明的目的还可通过如下技术措施来实现：
金纳米簇制备时所述的表面包覆剂选自牛血清白蛋白(BSA)或谷胱甘肽(GSH)；制备金纳米簇材料时加入的NaOH溶液的浓度为0.8-1.5M，搅拌反应时间为22-26小时；所选用的氧化型辅酶选自氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)。
有益效果：本发明所带来的好处，所达到的指标。
目前报道的基于金纳米簇的荧光酶检测体系大多采用荧光猝灭方式进行检测，不仅背景信号大灵敏度低，而且易产生假阳性信号。该荧光增强检测不仅利用了金纳米簇的优异光学性质，而且避免了猝灭法检测的弊端，具有灵敏度高、准确性好的优势。
附图说明
说明各附图所表示的含义
图1：(A)AuNCs的紫外-可见吸收(左线，左轴)和荧光发射(右线，右轴)光谱。(B)AuNCs的TEM图像。插图：其中一个AuNCs样品的尺寸信息。(C)TEM图像中随机选择的100个AuNCs样品颗粒的粒度信息。
图2：a线代表单独AuNCs的荧光发射光谱；b线代表AuNCs被50μM的铁氰化钾淬灭后的荧光发射光谱；c线代表通过酶级联反应介导的生物催化体系(10mM乳酸)恢复后的AuNCs荧光发射光谱。
图3：(A)荧光增量(F/F0，F0和F分别是不存在和存在乳酸时的AuNCs的荧光强度)与乳酸浓度之间的关系；(B)荧光增量与乳酸的浓度对数之间的线性关系图。
图4：检测乳酸的选择性图。
具体实施方式
根据权利要求所包含的内容举例说明
实施例1：
a、在剧烈搅拌下将8mM的HAuCl4溶液与30mg/mL的BSA溶液混合后，向其加入0.2mL1.2M的NaOH溶液，并在37℃剧烈搅拌下反应24h；将产物用半透膜在超纯水中透析24小时，储存在4℃下备用；
b、乳酸的荧光检测：首先，在0.2M的pH＝7.5的磷酸缓冲中，将1.0mM的氧化型辅酶Ⅰ，6.0mg/mL的乳酸脱氢酶和不同浓度的乳酸溶液混合并在37℃下孵育30分钟；然后，将1.0mg/mL的心肌黄酶和1.0mM的铁氰化钾加入上述溶液中并在37℃下继续反应30分钟；最后，加入40μL的金纳米簇并用0.2MpH＝5的磷酸缓冲稀释至1.0mL，在400nm的激发波长下测量溶液的荧光强度。
实施例2：
a、在剧烈搅拌下将8mM的HAuCl4溶液与30mg/mL的GSH溶液混合后，向其加入0.2mL1.0M的NaOH溶液，并在37℃剧烈搅拌下反应24h；将产物用半透膜在超纯水中透析24小时，储存在4℃下备用；
b、乳酸的荧光检测：首先，在0.2M的pH＝7.5的磷酸缓冲中，将1.0mM的氧化型辅酶Ⅱ，6.0mg/mL的乳酸脱氢酶和不同浓度的乳酸溶液混合并在37℃下孵育30分钟；然后，将1.0mg/mL的心肌黄酶和1.0mM的铁氰化钾加入上述溶液中并在37℃下继续反应30分钟；最后，加入40μL的金纳米簇并用0.2MpH＝5的磷酸缓冲稀释至1.0mL，在400nm的激发波长下测量溶液的荧光强度。

Claims (5)

1.一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法，其特征在于：
a、金纳米簇的合成：在剧烈搅拌下将HAuCl4溶液与表面包覆剂溶液混合后，向其加入0.2mL一定浓度的NaOH溶液，并在37℃剧烈搅拌下反应一定时间；所得产物用半透膜在超纯水中透析24小时，储存在4℃下备用；
b、乳酸的荧光检测：首先，在0.2M的pH＝7.5的磷酸缓冲中，将1.0mM的氧化型辅酶，6.0mg/mL的乳酸脱氢酶和不同浓度的乳酸溶液混合并在37℃下孵育30分钟；然后，将1.0mg/mL的心肌黄酶和1.0mM的铁氰化钾加入上述溶液中并在37℃下继续反应30分钟；最后，加入40μL的金纳米簇并用0.2M pH＝5的磷酸缓冲稀释至1.0mL，在400nm的激发波长下测量溶液的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法，其特征在于制备金纳米簇材料时选用的表面包覆剂来自牛血清白蛋白或谷胱甘肽。
3.根据权利要求1所述的一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法，其特征在于制备金纳米簇材料时加入的NaOH溶液的浓度为0.8-1.5M。
4.根据权利要求1所述的一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法，其特征在于制备金纳米簇材料时的搅拌反应时间为22-26小时。
5.根据权利要求1所述的一种基于金纳米簇荧光增强的乳酸检测方法，其特征在于乳酸的荧光检测中所选用的氧化型辅酶选自氧化型辅酶Ⅰ或氧化型辅酶Ⅱ。
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荧光金纳米团簇及其在生命分析中的应用;施小琼等;《世界复合医学》;20150930;第1卷(第3期);第262-271页 *

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