CN102338779B - 检测奶酪中山梨酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测奶酪中山梨酸含量的方法，该方法使用了气相色谱-质谱联用仪进行检测，包括以下步骤：(i)制备具有不同山梨酸含量的山梨酸标准溶液，利用气相色谱-质谱联用仪对其检测，从而生成山梨酸含量与峰面积之间对应的标准曲线；(ii)称取一定重量的奶酪，对其进行预处理从而形成待测奶酪样品，利用气相色谱-质谱联用仪在与步骤(i)相同的气相色谱-质谱条件下对其进行检测，得到待测奶酪样品的检测峰面积；和(iii)将步骤(ii)中获得的待测奶酪样品的检测峰面积与步骤(i)中得到的所述标准曲线进行比对，确定待测奶酪样品中的山梨酸含量。该方法消耗有机溶剂少，提取时间短，操作简单方便，检测准确率高、抗干扰能力强。

Description

检测奶酪中山梨酸含量的方法

技术领域

本发明涉及化学成份的检测的技术领域，具体来说，涉及检测奶酪中山梨酸含量的方法。

背景技术

山梨酸是一种常用的食品防腐剂，与其钾盐的防腐效果相同，它对多种微生物细胞的呼吸酶系的活性有抑制作用，并对微生物的细胞膜生长有阻碍作用，从而达到抑制微生物的繁殖。由于它既能抑制多种微生物的繁殖，又具有很好的杀菌作用，被广泛用于罐头、果酱、酱油、食醋、汽水以及各类肉食品中。山梨酸是各国允许使用，而且历史比较悠久的食品防腐剂。

国家标准《GB 21703-2010乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定》中用反相液相色谱法来测定山梨酸的含量。该方法的预处理为先在100mL容量瓶中称取液体乳20g，或者在100mL容量瓶中称取固体样品3g，加10mL水全部溶解。然后加入25mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，在70℃水浴中处理15min。冷却后，用0.5mol/L硫酸溶液将pH调节到8，然后加人2mL 92g/L亚铁氰化钾溶液和2mL 183g/L乙酸锌溶液。剧烈振摇，静置15min，混合后冷却到室温，再用甲醇定容，静置15min，上清液经过滤膜过滤。收集滤液作为试样溶液，用于液相色谱仪测定。

该方法需要使用甲醇45mL～65mL，会对环境造成一定污染，同时处理样品时间长，操作较为复杂。

该方法通常是先对具有确定山梨酸含量的工作液进行标定，然后再用同样的方法处理和测试被测样品，根据这两次测量的结果来推算被测样品中的山梨酸含量。但这方法测量精度不高，由于一次测量的数值可能会受到一些不确定因素的干扰，因此根据该工作液的数值确定的样品中山梨酸含量可能并不准确。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测奶酪中山梨酸含量的方法，它采用气相色谱-质谱联用仪检测待测奶酪样品中的山梨酸峰面积，并将此峰面积与预先制定出的山梨酸含量与峰面积之间对应的标准曲线比对来确定奶酪中的山梨酸含量。该方法采用了新颖的预处理过程，使得操作更为简便，精度较高，并提高了检测时的抗干扰能力。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测奶酪中山梨酸含量的方法，该方法使用了气相色谱-质谱联用仪进行检测，包括以下步骤：(i)制备具有不同山梨酸含量的山梨酸标准溶液，利用气相色谱-质谱联用仪在适当的气相色谱和质谱条件下对其检测，从而生成山梨酸含量与峰面积之间对应的标准曲线；(ii)称取一定重量的奶酪，对其进行预处理从而形成待测奶酪样品，利用气相色谱-质谱联用仪在与步骤(i)相同的气相色谱-质谱条件下对其进行检测，得到待测奶酪样品的检测峰面积；和(iii)将步骤(ii)中获得的待测奶酪样品的检测峰面积与步骤(i)中得到的所述标准曲线进行比对，确定待测奶酪样品中的山梨酸含量。

在检测奶酪中山梨酸含量的方法的再一种示意性实施方式中，步骤(i)中的山梨酸标准溶液的制备方法如下：(a)分别取200.0μg/mL的山梨酸标准溶液0.1mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL到离心管中；(b)在所述离心管中加入蒸馏水至5mL，再加入6mol/L的1mL盐酸溶液和2mL分析纯二氯甲烷，用旋涡混合器混合1min，用离心机在3000rpm～4000rpm条件下离心5～10min；(c)用注射器吸取1mL下清液经过滤膜过滤到进样小瓶，从而获得10.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL、80.0μg/mL和100.0μg/mL的山梨酸标准溶液。

在检测奶酪中山梨酸含量的方法的另一种示意性实施方式中，气相色谱条件为：色谱柱：毛细管色谱柱，固定相为亚硝基对苯二甲酸改性聚乙二醇或相当者，色谱柱规格为30m×0.25mm×0.2μm或30m×0.32mm×0.2μm；进样口温度：250～300℃；进样方式：分流，分流比为40∶1到50∶1；载气：高纯氦气；流速：毛细管色谱柱内径为0.25mm的流速为1.0～1.4mL/min，毛细管色谱柱内径为0.32mm的流速为1.8～2.5mL/min；升温程序如下：初温为140℃维持1～2min，然后以10～15℃/min升到175～190℃后，保持4～7min，程序共8～14min。质谱条件为：电离方式：电子轰击电离(EI)；电离能量：70eV；离子源温度：200～220℃；传输线温度：250～280℃；溶剂延迟时间：3.0～5.5min；进样量：1μL；扫描模式：选择离子检测(SIM)方式，定性离子m/z 41、67、97、112，定量离子m/z 97。

在检测奶酪中山梨酸含量的方法的一种示意性实施方式中，步骤(ii)中的预处理进一步包括如下步骤：(a)称取3～5g分析纯海砂到50mL离心管，然后称取0.1～1.5g奶酪样品置于离心管中，加入1～2g分析纯乙酸锌，用玻璃棒充分搅拌，使奶酪均匀混合在海砂中；(b)加入蒸馏水溶解并转移到25mL容量瓶中，定容至刻度后转移到50mL离心管中；(c)用旋涡混合器充分混合；(d)用离心机在3000rpm～4000rpm条件下离心5～10min；(e)过滤水层，吸取5mL滤液于一个的离心管中，加入6mol/L盐酸溶液1mL，2mL二氯甲烷；和(f)用旋涡混合器混合1min，用离心机在3000rpm～4000rpm条件下离心5～10min。

上述检测奶酪中山梨酸含量的方法采用了气相色谱-质谱联用仪，对制备出的不同山梨酸含量的山梨酸标准溶液进行检测，得出山梨酸含量与峰面积之间的对应关系的标准曲线，并将检测出的待测奶酪样品的山梨酸峰面积与该标准曲线比对，从而得出待测奶酪样品中的山梨酸含量。与国标GB 21703-2010中仅通过一次检测即得出对照值的方法相比，这种方法利用多个检测点的数据拟合成了标准曲线，最终的检测精度更高。

上述检测方法中采用的气相色谱-质谱条件使用了较佳参数，组合使用了SCAN(全扫描)模式和SIM(选择离子)模式，能获得更高的检测精度，并且在检测中的干扰因素较小，基本不会负面影响检测结果。具体的说，进样口温度的选择能保证样品瞬间汽化，选择的较佳分流比也可以保证样品能被检测到，并且还不至于污染气质的离子源。不同色谱柱的流速大小，则是按照色谱柱厂家提供的数据进行整理得出的较优数据。另外，升温程序还能保证在较短的时间内分离样品，节省时间。传输线温度可以保证汽化的样品在进入离子源时不液化，溶剂延迟时间则与程序升温的时间对应。

另外，该检测方法对乳酪的预处理也更为简便，消耗了更少有机溶剂，操作时间短，便，并尽可能多地排除了干扰因子。

附图说明

以下附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围，其中：

图1是根据本发明的一个实施方式，气相色谱-质谱仪处于SCAN模式时，得到的100.0μg/mL山梨酸标准溶液的总离子流色谱图；

图2是根据本发明的一个实施方式，在气相色谱-质谱仪处于SCAN模式时，得到的100.0μg/mL山梨酸标准溶液的质谱图；

图3是根据本发明的一个实施方式，在气相色谱-质谱仪处于SIM模式时，得到的100.0μg/mL山梨酸标准溶液的总离子流色谱图；

图4是在气相色谱-质谱仪处于SIM模式时，得到的100.0μg/mL山梨酸标准溶液的质谱图；

图5是根据本发明的一个实施方式，在气相色谱-质谱仪处于SIM模式时的一种山梨酸标准溶液中山梨酸含量与峰面积间对应关系的标准曲线图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式。需要指出的是，本发明中所提到的各具体数值，并非完全数学意义上的数字，凡是符合化学工程意义上的数值都是适用的。

本发明实施例中采用的实验仪器与试剂如下：

450GC-300MS气相色谱-质谱联用仪购自美国瓦里安(VARIAN)公司；

色谱柱：毛细管色谱柱，固定相为亚硝基对苯二甲酸改性聚乙二醇或相当者，色谱柱规格为30m×0.25mm×0.2μm或30m×0.32mm×0.2μm；

离心管：规格是10～15mL以及50mL，上述离心管的规格是根据离心机的尺寸来选择，本领域技术人员应了解，所有能达到检测目的的离心管规格都落入本发明的保护范围内；

山梨酸标准液：取自国家标准物质研究中心，浓度1.0g/L，编号：GBW(E)100022；

山梨酸标准工作液：浓度为200.0μg/mL，制备方法是取浓度为1.0g/L的山梨酸标准液1mL，用蒸馏水定容到5mL；

盐酸溶液：浓度为6mol/L，制备方法是取50mL优级纯盐酸溶液，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中；

海砂：属于分析纯；

乙酸锌：属于分析纯；

二氯甲烷：属于色谱纯。

本发明实施例中采用的仪器检测条件将在下文描述。

气相色谱条件：

进样口温度：250～300℃，进样口温度要保证样品能被汽化，上述温度范围选择可以保证样品瞬间汽化，在检测过程中无什么区别；

进样方式：分流，分流比为40∶1到50∶1，该分流比是较优数据，可以保证样品被检测到，同时还不至于污染气质的离子源；

载气：高纯氦气；

流速：毛细管色谱柱内径为0.25mm的流速为1.0～1.4mL/min，毛细管色谱柱内径为0.32mm的流速为1.8～2.5mL/min，针对不同色谱柱选定的流速大小，是按照色谱柱厂家提供的数据进行整理得出的较优数据；

升温程序如下：初温为140℃维持1～2min，然后以10～15℃/min升到175～190℃后，保持4～7min，程序共8～14min，相对而言，程序升温是较灵活的一项，此处提供的数据只是作为其中一种可能的实施方式，不过用此程序升温条件，可以保证在较短的时间内分离样品，节省时间。

质谱条件：

电离方式：电子轰击电离(EI)；

电离能量：70eV；

离子源温度：200～220℃，在实际操作过程中，气质的离子源温度默认为200℃，有时为了减少离子源被污染，可以提高20℃；

传输线温度：250～280℃，传输线温度是保证汽化的样品在进入离子源时不液化，此范围内的任何温度范围都可以达到要求；

溶剂延迟时间：3.0～5.5min，溶剂延迟时间是与程序升温的时间对应的，采用最快的程序升温(约8min)，溶剂延迟时间为3.0min，采用最慢的程序升温(约14min)，溶剂延迟时间为5.5min；

进样量：1μL；

扫描模式：选择离子检测(SIM)方式，定性离子m/z 41、67、97、112，定量离子m/z 97。

下面将结合一个具体实施例对检测奶酪中山梨酸含量的检测方法进行具体描述。

山梨酸标准溶液的制备

下文将说明每mL二氯甲烷中山梨酸含量分别为10.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg和100.0μg的山梨酸标准溶液的制备方法。

取200.0μg/mL的山梨酸标准工作液0.1mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL分别置于到一个15mL离心管中，分别在离心管中加入蒸馏水至5.0mL，再加入先前配得的1.0mL盐酸溶液(浓度6mol/L)和2mL二氯甲烷，用旋涡混合器混合1min，用离心机在3000rpm条件下离心10min；用注射器吸取各离心管下清液经过滤膜过滤到进样小瓶，此即为制得的1mL二氯甲烷中分别含10.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL、80.0μg/mL和100.0μg/mL山梨酸的山梨酸标准溶液。

山梨酸标准溶液标准曲线的确定

本发明使用了300-MS气相色谱-质谱联用仪作为检测设备，其工作条件如下：

气相色谱条件：

进样口温度：250～300℃；

进样方式：分流，分流比为40∶1；

载气：高纯氦气；

流速：毛细管色谱柱内径为0.25mm的流速为1.0mL/min；

升温程序如下：初温为140℃维持1min，然后以15℃/min升到185℃后，保持6min，程序共10min。

质谱条件：

电离方式：电子轰击电离(EI)；

电离能量：70eV；

离子源温度：200℃；

传输线温度：250℃；

溶剂延迟时间：3.0min；

进样量：1μL；

扫描模式：选择离子检测(SIM)方式，定性离子m/z 41、67、97、112，定量离子m/z 97。

按照上述制备山梨酸标准溶液的条件，根据上述条件调节气相色谱-质谱联用仪，待状态稳定后，用气相色谱-质谱法对制备出的具有不同山梨酸含量的山梨酸标准溶液分别进行分析，再根据所标定的数值确定山梨酸含量与峰面积对应的标准曲线，此即为山梨酸标准溶液标准曲线。

图1是在气相色谱-质谱仪处于SCAN模式时，取上述山梨酸标准溶液100.0μg/mL得到的总离子流色谱图；图2是在气相色谱-质谱仪处于SCAN模式时，取上述山梨酸标准溶液100.0μg/mL得到的质谱图；图3是在气相色谱-质谱仪处于SIM模式时，取上述山梨酸标准溶液100.0μg/mL得到的总离子流色谱图；图4是在气相色谱-质谱仪处于SIM模式时，取上述山梨酸标准溶液100.0μg/mL得到的质谱图。

值得一提的是，在SCAN模式下，被测物只要在质谱中有响应都会在工作站中形成峰，有时杂质峰的响应会超过被测物的响应，或者会对被测物造成干扰。SIM模式是在SCAN模式后选择被测物的几个特征离子来进行检测，这样就会将被测物中的干扰去掉。如图1和图3所示，图1为SCAN模式，其中基线很高，被测物的峰型很差；图3为SIM模式，峰型尖锐且对称。在本实施例中，先用SCAN模式找出被测物的保留时间和离子碎片，然后用SIM模式进行检测，避免了干扰。

图5是在气相色谱-质谱联用仪处于SIM模式时的一种山梨酸标准溶液标准曲线图，横坐标表示所吸取的山梨酸标准溶液中所含的山梨酸的质量(所取的点分别是每毫升二氯甲烷中含有山梨酸10.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg、100.0μg)，纵坐标是相应山梨酸质量测得的峰面积。

得出的标准曲线的相关数据如下：

初始线性曲线拟合，线性方程：y＝+6822.7310×-5.5765e+4；

偏差：2.44％。

利用本发明的上述方法确定出的山梨酸含量标准曲线，可以很方便地对奶酪中的山梨酸含量进行检测。下文将详细说明奶酪中山梨酸含量的检测方法。

奶酪中山梨酸含量的检测

首先，称取3g海砂到50mL离心管，在离心管中称取0.3g奶酪样品，加入1g乙酸锌，用玻璃棒充分搅拌，使奶酪均匀混合在海砂中，加入蒸馏水溶解并转移到25mL容量瓶中，定容至刻度后转移到50mL离心管中，用旋涡混合器充分混合，用离心机在3000rpm条件下离心10min。

然后，过滤水层，吸取5.0mL滤液于一个15mL的离心管中，加入6mol/L盐酸溶液1.0mL，2.0mL二氯甲烷，用旋涡混合器混合1min，用离心机在3000rpm条件下离心10min。

最后，用1mL注射器吸取下清液经过滤膜过滤到进样小瓶，此即为制得的待测奶酪样品。将上述待测奶酪样品注入到300-MS气相色谱-质谱联用仪中，在与山梨酸标准溶液相同的检测条件下，得到峰面积，与标准曲线相对比，从而获得其中的山梨酸含量(μg)。

式样中山梨酸含量X，以质量分数(mg/kg)表示，按下式计算：

$X=\frac{\mathrm{Cs}}{\mathrm{mi}}\×5$

式中：Cs表示从标准曲线中查得试样中山梨酸的含量(μg)，mi表示试样的质量(g)。在此实施例中，Cs为20.4μg，mi为0.3005g，由上式计算得339.4mg/kg。

用气相色谱-质谱联用仪对上述待测液进行测量，随后将测量的结果与所确定的山梨酸含量标准曲线进行比对，确定待测液的山梨酸含量。这样，就可以根据待测液的山梨酸含量计算出奶酪中的山梨酸含量。

以上选择的海砂、乙酸锌的克数可以根据所取的奶酪样品发生变化，比如说当取1g奶酪样品时，海砂与乙酸锌应相应增加，如取海砂5g和乙酸锌2g。离心机也可以在提供的条件内选定不同的值。这些都是本领域技术人员可以理解并且能够实现的，在此不作赘述。

如上所述，在检测奶酪中山梨酸含量的方法中，通过制备一系列具有不同山梨酸含量的山梨酸标准溶液，可以提高山梨酸含量标准曲线的准确度，减少测量中的干扰。同样在检测奶酪中山梨酸含量的方法中，采用气相色谱-质谱联用仪测定奶酪中的山梨酸，具有消耗有机溶剂少、提取时间短、操作简单方便、检测准确率高、抗干扰能力强等特点，很好的满足了实验室检测量大的需要。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.检测奶酪中山梨酸含量的方法，该方法使用了气相色谱-质谱联用仪进行检测，所述方法包括以下步骤：

(i)制备具有不同山梨酸含量的山梨酸标准溶液，利用所述气相色谱-质谱联用仪对其检测，从而生成山梨酸含量与峰面积之间对应的标准曲线；

(ii)称取一定重量的奶酪，对其进行预处理从而形成待测奶酪样品，利用所述气相色谱-质谱联用仪在与步骤(i)相同的气相色谱-质谱条件下对其进行检测，得到所述待测奶酪样品的检测峰面积；和

(iii)将步骤(ii)中获得的所述待测奶酪样品的检测峰面积与步骤(i)中得到的所述标准曲线进行比对，确定所述待测奶酪样品中的山梨酸含量；

其特征在于，所述步骤（ii）中的所述预处理包括如下步骤：

(a)称取3~5g分析纯海砂到50mL离心管，然后称取0.1~1.5g奶酪样品置于离心管中，加入1~2g分析纯乙酸锌，用玻璃棒充分搅拌，使奶酪均匀混合在海砂中；

(b)加入蒸馏水溶解并转移到25mL容量瓶中，定容至刻度后转移到50mL离心管中；

(c)用旋涡混合器充分混合，

(d)用离心机在3000rpm~4000rpm条件下离心5~10min；

(e)过滤水层，吸取5mL滤液于一个的离心管中，加入6mol/L盐酸溶液1mL，2mL分析纯二氯甲烷；

(f)用旋涡混合器混合1min，用离心机在3000rpm~4000rpm条件下离心5~10min。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(i)中的所述山梨酸标准溶液的制备方法如下：

(a)分别取200.0μg/mL的山梨酸标准溶液0.1mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL到离心管中；

(b)在所述离心管中加入蒸馏水至5.0mL，再加入6.0mol/L的1.0mL盐酸溶液和2.0mL分析纯二氯甲烷，用旋涡混合器混合1min，用离心机在3000rpm~4000rpm条件下离心5~10min；

(c)用注射器吸取1mL下清液经过滤膜过滤到进样小瓶，从而获得10.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL、80.0μg/mL和100.0μg/mL的山梨酸标准溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述气相色谱-质谱联用仪的气相色谱条件为：

色谱柱：毛细管色谱柱，固定相为亚硝基对苯二甲酸改性聚乙二醇，色谱柱规格为30m×0.25mm×0.2μm或30m×0.32mm×0.2μm；

进样口温度：250~300℃；

进样方式：分流，分流比为40:1到50:1；

载气：高纯氦气；

流速：毛细管色谱柱内径为0.25mm的流速为1.0~1.4mL/min，毛细管色谱柱内径为0.32mm的流速为1.8~2.5mL/min；

升温程序如下：初温为140℃维持1~2min，然后以10~15℃/min升到175~190℃后，保持4~7min，程序共8~14min。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述气相色谱-质谱联用仪的质谱条件为：

电离方式：电子轰击电离（EI）；

电离能量：70eV；

离子源温度：200~220℃；

传输线温度：250~280℃；

溶剂延迟时间：3.0~5.5min；

进样量：1μL；

扫描模式：选择离子检测方式，定性离子m/z41、67、97、112，定量离子m/z97。

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