CN103760266A

CN103760266A - 一种用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法

Info

Publication number: CN103760266A
Application number: CN201410020013.5A
Authority: CN
Inventors: 董宁; 彭琳婧; 戴煦
Original assignee: Shenzhen Centre Testing Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Centre Testing Technology Co Ltd
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明涉及一种用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法，包括以下步骤：称取适量样品，选择合适的溶剂，利用柱前衍生、旋转蒸发浓缩等步骤对样品进行前处理；用连接荧光检测器的高效液相色谱仪对尿素衍生物进行检测，有机流动相和无机流动相采用可变比例，流速设定为1mL/min，进样量设定为10uL,色谱柱选择C₁₈色谱柱，柱温40℃-50℃，荧光检测器的检测波长：λ_ex=208nm,λ_em=308nm。采用本发明所述检测方法具有简便、快速、回收率高等特点。

Description

一种用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵酒中尿素含量的检测方法，特别是涉及一种用连接荧光检测器的高效液相色谱技术检测检测发酵酒中尿素含量的方法。

背景技术

在发酵饮料中，氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，IARC group2A，简称EC）是一种潜在的具有遗传毒性和致癌性的风险物种，它是由精氨酸经过酵母菌细胞内精氨酸酶-尿酶（AU）路径分解产生的。国际上，联合国粮农组织（FAO）已于2002年将其纳入重点监控物种，不少国家出于对本国消费者健康和行业利益的考虑，分别制定了饮料酒中氨基甲酸乙酯的限量标准，这无疑加大了贸易摩擦的可能。与此同时，在我国发酵酒类饮料之中，啤酒、葡萄酒的EC含量通常较低，而黄酒由于制作过程中通常不采用蒸馏的方式，致使其中氨基甲酸乙酯的含量普遍较高。尿素是产生氨基甲酸乙酯的重要前驱物质，尿素和乙醇之间的反应是黄酒中氨基甲酸乙酯生成的主要途径。资料显示，尿素含量为18mg/L的加饭酒中潜在氨基甲酸乙酯含量可达1200μg/L。尿素已成为黄酒生产中涉及食品安全的重要监测指标之一。因此，为降低黄酒中氨基甲酸乙酯的水平，对尿素含量进行控制是一个关键和有效的措施。这不仅密切关系到人们的生命健康，也严重影响到中国酒类产品的出口。研究发酵酒中尿素准确、快速的测定方法，对氨基甲酸乙酯质量控制具有十分重要的意义。

目前，检测尿素的常规方法主要为分光光度法、比色法、脲酶法等化学分析法，应用从原有的临床医学扩展到土壤、饲料、牛奶与饮料酒检测等领域。化学分析法灵敏度相对较低，黄酒中存在着与尿素结构和性质类似的氨基酸及铵离子等物质，对测定结果影响较大。二乙酰-肟分光光度法利用样品中的尿素与显色试剂在沸水浴中发色10-15min后比色测定，但比色测定误差随着尿素含量的增加而增大。同时测得结果中包含瓜氨酸，且酒中糖类和发色温度对结果影响较大；AOAC推荐的关于食品及其容器中尿素的标准检测方法，是通过测定尿素与9-羟基占吨反应生成的二黄质基脲溶于50%硫酸溶液所形成的黄色溶液的吸光度，进而确定尿素的含量。但结果很容易受到未反应的9-羟基占吨的影响，同时该方法重现性较差，自动化程度不高；日本采用比色法利用流动注射分析（FIA）系统来定量酒类中尿素的含量，美国则基于同样原理研制出了酒类尿素比色法定量检测试剂盒。但此方法成本较高，不适合作为行业标准推广使用。英国的P.Herbert、Shona Clark等人还建立了利用高效液相色谱测定葡萄酒中尿素含量的方法。国内也有报道利用尿素在λ=203nm下紫外吸收的特征，采用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法测定黄酒中的尿素含量，但低波段检测对所用试剂级别要求较高，且易受干扰而造成基线不稳。

综上所述，现有的尿素检测技术手段在发酵酒领域的应用都存在着某种程度的问题，为了保障中国发酵酒行业的健康发展，使其迅速接近并达到国际上关于酒类EC含量控制的要求，本发明提供一种准确，高效和低经济成本的发酵酒中尿素检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提出一种用常规的连接荧光检测器的高效液相色谱技术检测发酵酒中尿素含量的方法。

本发明解决所述技术问题可以通过采用以下技术方案来实现：

包括以下步骤：

①称取适量样品，选择乙醇作为溶剂进行定容，稀释5倍，取稀释后的样品溶液置于带塞试管中；

②加入盐酸溶液、9-羟基占吨溶液混匀，在室温避光的条件下进行衍生，时间为30min-50min；

③利用旋转蒸发仪浓缩，形成浓缩溶液；

④浓缩溶液用与乙醇进行定容，过0.45um有机滤膜，形成前处理后的待测溶液；

⑤利用连接荧光检测器的高效液相色谱仪对待测溶液进行检测，有机流动相和无机流动相采用可变比例设定：0-16分钟有机流动相50%，无机流动相50%，16-30分钟有机流动相100%，无机流动相0%，流速设定为1.0mL/min，进样量设定为10uL，色谱柱选择C₁₈色谱柱，柱温40℃-50℃，荧光检测器的检测波长：λ_ex=208nm,λ_em=308nm。

优选方案为：

所述有机流动相为乙腈，无机流动相为水；

衍生时加入的盐酸溶液浓度为1.5mol/L，9-羟基占吨溶液为0.03mol/L，样品溶液、盐酸溶液和9-羟基占吨溶液的比例为4:1:4；

衍生时间为30min；

柱温为45℃。

本发明的技术效果在于：

1、提出一种用常规的连接荧光检测器的高效液相色谱技术检测发酵酒中尿素含量的方法；

2、前处理方法简便、快速、回收率高；

3、通过选择合适的色谱柱、柱温、合适的流速和流动相比例，能使样品中的发尿素衍生物得到最优化的分离。

附图说明

图1是本发明实施例1所检测的尿素衍生物的色谱图；

具体实施方式

以下结合附图所示之最佳实施例作进一步详述。

实验条件：高效液相色谱仪和荧光检测器，所用试剂均为色谱纯。高效液相色谱仪和荧光检测器中有机流动相为乙腈，无机相为水，比例设定随时间可变，具体为0-16分钟有机流动相50%，无机流动相50%，16-30分钟有机流动相100%，无机流动相0%；流速设定为1mL/min;进样量设定为10ul；色谱柱选择C₁₈色谱柱，柱温45℃；荧光检测器的检测波长：λ_ex=208nm,λ_em=308nm。计算机系统记录色谱图形，以目标物的峰面积作为目标物的响应值，对样品进行分析。

制作标准曲线：以乙醇为配制标准溶液的溶剂，配制尿素系列标准溶液，按所述实验条件进行高效液相色谱仪和荧光检测器联用分析检测。图1为尿素衍生物的色谱图。以总目标峰面积对浓度作图，根据标准溶液的3次平行测量结果，建立尿素的标准曲线，横坐标代表尿素标准溶液的浓度，纵坐标代表液相色谱峰面积响应值，所得标准曲线的函数关系为 _y=68.29x+19.113，其中_y代表液相色谱峰面积响应值，x代表尿素标准溶液的浓度，其线性相关系数为R²=0.9977,这表明该标准曲线具有较好的线性相关性。

应用上述试验条件和标准曲线所作的具体实施例如下：

实施例1

准确吸取样品2.0mL，于10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度。取稀释后的样品溶液2mL置于带塞试管中，加入0.5mL盐酸溶液（浓度为1.5mol/L）、2mL9-羟基占吨溶液（浓度为0.03mol/L）混匀，放置于室温避光的条件下进行衍生，时间为30min。如此操作三次，合并衍生后的溶液至100mL圆底烧瓶内，通过旋转蒸发仪将溶液浓缩至5mL左右，形成浓缩溶液，将浓缩溶液转移至10mL容量瓶内，用乙醇定容至刻度，过0.45um有机滤膜，形成前处理后的待测溶液，进行液相色谱测试。对样品作了五个平行样品，依照衍生方法，对发酵酒样品进行加标衍生，根据尿素对照品的加入量计算回收率，测定结果见表1。由表1可知，样品的加标回收率达到85%以上，并在85～110%之间。

表1发酵酒加标回收率结果

实施例2

将衍生时间设定为50min，其他条件同实施例1，所得平行样的相对标准偏差<8%，重复性测试的相对标准偏差<5%，样品的加标回收率在85%-110%之间。

实施例3

将柱温设定为40℃，其他条件同实施例1，结果出峰时间略有变化，其他不变，所得平行样的相对标准偏差<8%，重复性测试的相对标准偏差<5%，样品的加标回收率在85%-110%之间。

实施例4

将柱温设定为50℃，其他条件同实施例1，结果出峰时间略有变化，其他不变,所得平行样的相对标准偏差<8%，重复性测试的相对标准偏差<5%，样品的加标回收率在85%-110%之间。

实施例5

用甲醇作有机流动相，其他条件同实施例1，所得平行样的相对标准偏差<8%，重复性测试的相对标准偏差<5%，样品的加标回收率在85%-110%之间。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围;因此,凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的涵盖范围。

Claims

1.一种用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法，其特征在于：包括以下步骤，

③利用旋转蒸发仪浓缩，形成浓缩溶液；

⑤利用连接荧光检测器的高效液相色谱法对待测溶液进行检测，有机流动相和无机流动相采用可变比例设定：0-16分钟有机流动相50%，无机流动相50%，16-30分钟有机流动相100%，无机流动相0%，流速设定为1.0mL/min，进样量设定为10uL，色谱柱选择C₁₈色谱柱，柱温40℃-50℃，荧光检测器的检测波长：λ_ex=208nm,λ_em=308nm。

2.如权利要求1所述的用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法，其特征在于：所述有机流动相为乙腈，无机流动相为水。

3.如权利要求1所述的用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法，其特征在于：衍生时加入的盐酸溶液浓度为1.5mol/L，9-羟基占吨溶液为0.03mol/L，样品溶液、盐酸溶液和9-羟基占吨溶液的比例为4:1:4。

4.如权利要求1所述的用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法，其特征在于：衍生时间为30min。

5.如权利要求1所述的用高效液相色谱法检测发酵酒中尿素含量的方法，其特征在于：柱温为45℃。