CN105628815B - 一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯EC的方法，具体来说是涉及一种基于气相色谱—串联质谱仪测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法，包括内标溶液、标准工作溶液和样品溶液的制备，气相色谱‑串联质谱仪分析，以及测定结果的计算等步骤。本发明采用目标物的氘代物为内标物进行定量，经优化后的检测方法响应灵敏、定量分析准确，有效地减少了因样品基质复杂带来的干扰，所采用的分析仪器条件使得目标物具有较好的信号响应，并且具有较好的线性相关性，检出限为0.0259 ng/g，重复性（RSD）为9.10%，加标回收率在84.87%～105.43%之间，说明本方法的灵敏度高，重复性和回收率较好，适合于发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的定量分析。

Description

一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法
技术领域
本发明公开了一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)的方法，具体来说是涉及一种基于气相色谱—串联质谱仪测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法，属于食品理化指标检测技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯，又称尿烷，广泛存在于各种发酵食品中，是一种潜在的致癌物质，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等多种疾病,世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)将其归为2A类致癌物，联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)食品添加剂联合专家委员会(JECFA)第64次会议建议,为了保障人类身体健康,应尽可能降低发酵饮料和食品中氨基甲酸乙酯的含量。
已经报道的氨基甲酸乙酯含量的测定主要集中于面包、酸牛奶、酱油等发酵食品以及葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等酒精饮料等食品行业，采用的方法有气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、红外光谱法等。国家进出口检验检验局针对出口的黄酒、蒸馏酒中的氨基甲酸乙酯制定了气相色谱法的检测标准(SN/T 0285-93)，此标准采用液液萃取法，费时、费力，而且检测时采用外标法，存在定量不够准确等缺点，因此，随着前处理和检测技术的提高，此行业标准也亟需进一步的优化和改进。
现有研究结果表明，氨基甲酸乙酯是一种多位点致癌物，可导致肺癌、肝癌、皮肤癌和淋巴癌等多种癌症，在生物体内的代谢途径主要有两条，一条是酯酶代谢，另一条主要与细胞色素P450有关，进入生物体后，约0.5％左右的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化为乙烯基-氨基-甲酸乙酯，随后形成乙烯基-氨基-甲酸乙酯环氧化物，该种环氧化物在体内形成DNA加聚物，造成DNA双链损坏，从而导致细胞癌变，约0.1％的氨基甲酸乙酯被细胞色素P450氧化后形成的物质能够导致DNA双链复制时错配，从而造成基因的严重缺失或突变。因此，自上世纪六七十年代发现在发酵食品及酒精饮料中含有氨基甲酸乙酯以来，许多文献都报道了酒精饮料及发酵食品中氨基甲酸乙酯含量的检测方法。
无论是国外还是国内的研究者，建立的分析方法多为气相色谱/质谱联用，或者是液相色谱-荧光检测器法。由于氨基甲酸乙酯的含量一般为ppm甚至ppb级别，含量较低，且酒精饮料或者发酵食品的成分较为复杂，基质干扰非常严重，因此，试样都需经过复杂的前处理以及衍生化过程。气相色谱/质谱联用法一般是采用两种或两种以上不同类型的固相萃取小柱或者固相萃取与基质分散萃取相结合对样品进行净化，然后使用大量的溶剂洗脱萃取液中的氨基甲酸乙酯，洗脱液浓缩后再行测定，实验中使用大量的有机溶剂，分析成本较高，且耗时繁琐，难以实现大量样品的批量测定。采用液相色谱-荧光检测器法时，试样需经过衍生化过程，反应要求在酸性，且在避光条件下进行，更为重要的是，该方法的重复性和准确度不够高，可用于样品的筛查，但难以实现对样品中氨基甲酸乙酯的准确测定。
液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)是近年来发展起来的一种色谱/质谱联用技术。两种方法由于具有样品前处理简单、操作方便、清洁实验等明显优势，已广泛应用于环境监测、化工、冶金、地质、水文、土壤、电子工业、食品饮料、临床化验等科学研究领域。在发酵食品及酒精饮料中EC的测定领域，研究者也尝试采用这两种分析技术建立了检测方法。为此，本专利创新采用GC-MS/MS对发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯行量化分析。
发明内容
本发明旨在克服现有的技术缺陷，提供一种采用气相色谱-串联质谱仪测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯含量的方法，该方法能准确检测发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的含量，测定结果准确、灵敏度高，基质干扰少。
具体来说，本发明采用了以下技术方案：
一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)内标溶液的制备：以D5-氨基甲酸乙酯D5-EC为内标物，使用乙腈为溶剂，制备内标溶液；
(2)标准工作溶液的制备：以氨基甲酸乙酯EC标准品为目标物，使用乙腈为溶剂，经逐级稀释制备成标准储备溶液，然后分别加入一定量的内标溶液，制备成标准工作溶液；
(3)样品溶液的制备：准确称取一定质量的食物样品，加一定体积的水进行超声萃取，得到萃取液；然后使用C18固相萃取柱进行净化，得到净化液；再以二氯甲烷为溶剂，使用硅藻土固相萃取柱对净化液进行反萃取，得到淋洗液；最后对淋洗液进行浓缩，得样品溶液；
(4)气相色谱-串联质谱仪分析：用气相色谱-串联质谱仪GC-MS/MS对标准工作溶液和样品溶液进行检测分析；
(5)标准工作曲线的绘制及样品结果的计算。
在以上方法中，所述的内标溶液的制备包括以下步骤：
(1)内标储备液：准确称取0.5g D5-EC，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度；
(2)内标溶液：准确移取0.1mL内标储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。
另外，所述的标准工作溶液的制备包括以下步骤：
(1)一级标准储备液：准确称取0.5g EC，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度；
(2)二级标准储备液：准确移取0.1mL一级标准储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度；
(3)标准工作溶液：分别准确移取二级标准储备液15μL、30μL、60μL、120μL、240μL、480μL和960μL，至100mL的容量瓶中，再分别准确加入500μL内标溶液，用乙腈稀释并定容至刻度，得系列标准工作溶液。
进一步，所述的样品溶液的制备包括以下步骤：
(1)样品萃取：准确称取10g食物样品，于100mL锥形瓶中，并加入40mL超纯水和200μL内标溶液，使用漩涡混合器将样品分散均匀，再置于超声波发生器内超声萃取20min，得到萃取溶液；
(2)萃取液净化：预先对规格为2g/10mL的C18SPE小柱进行活化，即先加入10mL甲醇，抽干，然后再加入10mL超纯水，快速抽下，并使C18小柱上筛板留有少量水，待准备好C18SPE小柱后，移入10mL萃取液，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，待小柱上筛板留有少量溶液时，再加入10mL混合溶剂9mL超纯水+1mL甲醇进行淋洗，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，收集淋洗液，视为净化液；
(3)净化液反萃取：预先对填料为20g的硅藻土SPE小柱进行活化，即移入50mL二氯甲烷进行淋洗活化，尽量抽干，待SPE小柱准备好后，将上述净化液全部移入SPE小柱，用一浓缩瓶接收淋洗液；然后再用70mL二氯甲烷多次对小柱进行淋洗，依靠二氯甲烷密度比水大的特征，自行滴下，收集所有留下来的液体，视为淋洗液；
(4)淋洗液浓缩：在55℃、常压条件下，对淋洗液浓缩到1mL左右，得到样品进样溶液。
其中，所述的GC-MS/MS分析，其仪器分析条件为：采用规格为30m×0.25mm×0.25μm的HP-INNOWAX毛细管色谱柱；载气为氦气，恒流速度为1.0mL/min；进样方式：进样量为1μL，脉冲不分流，进样脉冲压力为25psi，时间为1min；进样口温度为240℃；传输线温度为260℃；升温程序为初始温度为50℃，以5℃/min的速率升高至150℃，再以10℃/min的速率升高至240℃,保持5min，
其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式；离子源温度：230℃；四极杆温度：均为150℃；碰撞气：氮气，流速1.5mL/min，载气氦气流速为2.25mL/min；多反应监测MRM模式，详细参数列于下表：
目标物的MRM参数情况
进一步在以上方法中，所述的标准曲线绘制及结果计算如下：以标准工作溶液中EC与D5-EC浓度之比为横坐标，以色谱图中EC与D5-EC峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线，将相同条件下测得的样品溶液中EC与D5-EC色谱峰面积比，代入标准工作曲线，根据下列公式求得发酵食品中痕量EC的含量：
式中：
W——发酵食品中EC的含量，单位为微克每千克μg/kg；
A——EC的峰面积；
As——D5-EC的峰面积；
b——标准工作曲线的截距；
Ms——添加内标的质量，单位为微克μg；
a——标准工作曲线的斜率；
M——发酵食品的质量，单位为支。
有益效果：本发明的检测方法对样品处理方法及色谱质谱分析条件进行了优化确认。与现有技术相比，本发明具有如下优良效果：
(1)本发明方法创新使用气相色谱-串联质谱仪测定发酵食品中痕量EC的含量，解决了发酵食品中EC水平低，以及复杂基质对目标物的分析干扰严重等因素的影响。
(2)本发明方法针对EC极性较强的特点，选择C18反相萃取小柱为净化手段，使得干扰基质成分保留在C18小柱上，含EC的水溶液得以净化，并结合使用硅藻土SPE小柱，从含EC的水溶液反萃取出痕量目标物EC。方法思路新颖，创新性强。
(3)本发明方法利用内标法定量，可以不用精准定容，且可以减少由前处理方法重现性和仪器精密度问题带来的误差。
(4)本发明采用目标物的氘代物为内标物进行定量，经优化后的检测方法响应灵敏、定量分析准确，有效地减少了因样品基质复杂带来的干扰，所采用的分析仪器条件使得目标物具有较好的信号响应，并且具有较好的线性相关性，检出限为0.0259ng/g，重复性(RSD)为9.10％，加标回收率在84.87％～105.43％之间，说明本方法的灵敏度高，重复性和回收率较好，适合于发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的定量分析。
附图说明
图1为本发明测定方法的流程图；
图2为标准工作溶液中EC和D5-EC的离子对色谱图；
图3为典型发酵食品溶液中EC和D5-EC的离子对色谱图。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种快速灵敏，能准确检测发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的含量的方法，本发明方法采用了基于气相色谱-串联质谱仪的方法来测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的含量，结果准确、灵敏度高，基质干扰少。
本发明的测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法包括以下步骤：
(1)内标溶液的制备：以D5-氨基甲酸乙酯(以下简称为D5-EC)为内标物，使用乙腈为溶剂，制备内标溶液。
(2)标准工作溶液的制备：以氨基甲酸乙酯(以下简称为EC)标准品为目标物，使用乙腈为溶剂，经逐级稀释制备成标准储备溶液，然后分别加入一定量的内标溶液，制备成标准工作溶液。
(3)样品溶液的制备：准确称取一定质量的食物样品，加一定体积的水进行超声萃取，得到萃取液；然后使用C18固相萃取柱进行净化，得到净化液；再以二氯甲烷为溶剂，使用硅藻土固相萃取柱对净化液进行反萃取，得到淋洗液；最后对淋洗液进行浓缩，得样品溶液。
(4)气相色谱-串联质谱仪分析：用气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS)对标准工作溶液和样品溶液进行检测分析。
(5)标准工作曲线的绘制及样品结果的计算。
所述的内标溶液的制备，具体包括以下步骤：(1)内标储备液：准确称取0.5g D5-EC，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。(2)内标溶液：准确移取0.1mL内标储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。
所述的标准工作溶液的制备，具体包括以下步骤：(1)一级标准储备液：准确称取0.5g EC，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。(2)二级标准储备液：准确移取0.1mL一级标准储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。(3)标准工作溶液：分别准确移取二级标准储备液15μL、30μL、60μL、120μL、240μL、480μL和960μL，至100mL的容量瓶中，再分别准确加入500μL内标溶液，用乙腈稀释并定容至刻度，得系列标准工作溶液。
所述的样品溶液的制备，具体包括以下步骤：(1)样品萃取：准确称取10g食物样品，于100mL锥形瓶中，并加入40mL超纯水和200μL内标溶液，使用漩涡混合器将样品分散均匀，再置于超声波发生器内超声萃取20min，得到萃取溶液。(2)萃取液净化：预先对C18SPE小柱(规格为2g/10mL)进行活化，即先加入10mL甲醇，抽干，然后再加入10mL超纯水，快速抽下，并使C18小柱上筛板留有少量水。待准备好C18SPE小柱后，移入10mL萃取液，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，待小柱上筛板留有少量溶液时，再加入10mL混合溶剂(9mL超纯水+1mL甲醇)进行淋洗，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，收集淋洗液，视为净化液。(3)净化液反萃取：预先对硅藻土SPE小柱(填料为20g)进行活化，即移入50mL二氯甲烷进行淋洗活化，尽量抽干。待SPE小柱准备好后，将上述净化液全部移入SPE小柱，用一浓缩瓶接收淋洗液；然后再用70mL二氯甲烷多次对小柱进行淋洗，依靠二氯甲烷密度比水大的特征，自行滴下，收集所有留下来的液体，视为淋洗液。(4)淋洗液浓缩：在55℃、常压条件下，对淋洗液浓缩到1mL左右，得到样品进样溶液。
所述的GC-MS/MS分析，其仪器分析条件为：采用HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管色谱柱；载气为氦气，恒流速度为1.0mL/min；进样方式：进样量为1μL，脉冲不分流，进样脉冲压力为25psi，时间为1min；进样口温度为240℃；传输线温度为260℃；升温程序为初始温度为50℃，以5℃/min的速率升高至150℃，再以10℃/min的速率升高至240℃,保持5min。其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式；离子源温度：230℃；四极杆温度：均为150℃；碰撞气：氮气，流速1.5mL/min，载气(氦气)流速为2.25mL/min；多反应监测(MRM)模式，详细参数列于下表。
目标物的MRM参数情况
所述的标准曲线绘制及结果计算如下：以标准工作溶液中EC与D5-EC浓度之比为横坐标，以色谱图中EC与D5-EC峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线。将相同条件下测得的样品溶液中EC与D5-EC色谱峰面积比，代入标准工作曲线，根据下列公式求得发酵食品中痕量EC的含量。
式中：
W——发酵食品中EC的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A——EC的峰面积；
As——D5-EC的峰面积；
b——标准工作曲线的截距；
Ms——添加内标的质量，单位为微克(μg)；
a——标准工作曲线的斜率；
M——发酵食品的质量，单位为支。
以下将进一步结合具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
本实施例对发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的检测方法如下(所述检测方法的流程图如图1所示)：
(1)内标溶液的制备
①内标储备液：准确称取0.5200g D5-EC，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。②内标溶液：准确移取0.1mL内标储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，其中D5-EC的浓度为5.2μg/mL。
(2)标准工作溶液的制备
①一级标准储备液：准确称取0.5000g EC，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。②二级标准储备液：准确移取0.1mL一级标准储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。③标准工作溶液：分别准确移取二级标准储备液15μL、30μL、60μL、120μL、240μL、480μL和960μL，至100mL的容量瓶中，再分别准确加入500μL内标溶液，用乙腈稀释并定容至刻度，得系列标准工作溶液。其中EC的浓度范围为0.75～48ng/mL。
(3)样品溶液的制备
①样品萃取：分别以市销的葡萄酒、酸奶、酱油为分析对象，准确称取10g样品(精确至0.0001g)，于100mL锥形瓶中，并加入40mL超纯水和200μL内标溶液，使用漩涡混合器将样品分散均匀，再置于超声波发生器内超声萃取20min，得到萃取溶液。②萃取液净化：预先对C18SPE小柱(规格为2g/10mL)进行活化，即先加入10mL甲醇，抽干，然后再加入10mL超纯水，快速抽下，并使C18小柱上筛板留有少量水。待准备好C18SPE小柱后，移入10mL萃取液，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，待小柱上筛板留有少量溶液时，再加入10mL混合溶剂(9mL超纯水+1mL甲醇)进行淋洗，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，收集淋洗液，视为净化液。③净化液反萃取：预先对硅藻土SPE小柱(填料为20g)进行活化，即移入50mL二氯甲烷进行淋洗活化，尽量抽干。待SPE小柱准备好后，将上述净化液全部移入SPE小柱，用一浓缩瓶接收淋洗液；然后再用70mL二氯甲烷多次对小柱进行淋洗，依靠二氯甲烷密度比水大的特征，自行滴下，收集所有留下来的液体，视为淋洗液。④淋洗液浓缩：在55℃、常压条件下，对淋洗液浓缩到1mL左右，得到样品进样溶液。
(4)气相色谱-串联质谱分析
分别取7个不同浓度的标准工作溶液和样品待测溶液进行气相色谱-串联质谱分析(所述标准工作溶液、典型样品溶液中目标物和内标物的色谱图如图2～图3所示)。
其仪器分析条件为：采用HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管色谱柱；载气为氦气，恒流速度为1.0mL/min；进样方式：进样量为1μL，脉冲不分流，进样脉冲压力为25psi，时间为1min；进样口温度为240℃；传输线温度为260℃；升温程序为初始温度为50℃，以5℃/min的速率升高至150℃，再以10℃/min的速率升高至240℃,保持5min。其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式；离子源温度：230℃；四极杆温度：均为150℃；碰撞气：氮气，流速1.5mL/min，载气(氦气)流速为2.25mL/min；多反应监测(MRM)模式，详细参数列于下表。
目标物的MRM参数情况
(5)标准曲线绘制及结果计算
首先，以标准工作溶液中EC与D5-EC浓度之比为横坐标，以色谱图中EC与D5-EC峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线。取最低浓度的标准工作溶液，做9次平行检测分析，计算其标准偏差，以3倍的标准偏差对应的浓度，换算得出方法的检出限。与标准工作曲线相对应的回归方程、相关系数、检出限等数据见下表。
分析方法的工作曲线和检出限
化合物 浓度范围(ng/mL) 回归方程 相关系数 检出限(ng/g)
喹啉 0.75－48 Y＝1.1014X+0.0103 0.9999 0.0259
然后，将相同条件下测得的样品溶液中EC与D5-EC色谱峰面积比，代入标准工作曲线，根据下列公式求得发酵食品中痕量EC的含量。
式中：
W——发酵食品中EC的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A——EC的峰面积；
As——D5-EC的峰面积；
b——标准工作曲线的截距；
Ms——添加内标的质量，单位为微克(μg)；
a——标准工作曲线的斜率；
M——发酵食品的质量，单位为支。
本实施例中葡萄酒、酸奶、酱油等不同发酵食品中氨基甲酸乙酯含量检测结果见下表：
发酵食品检测结果(μg/kg)
样品名称 氨基甲酸乙酯
葡萄酒 18.5
酸奶 1.16
酱油 7.2
实施例2
本实施例对本发明的精密度和加标回收率的检测方法如下：
以实施例1中所用的酸奶样品为分析对象，分别进行了日内精密度实验，日内精密度实验为相同样品在同一条件下平行测定6次(同一批次处理)，分别计算6次平行测定结果的相对标准偏差(RSD)，测定结果见下表。表中结果显示，本实验方法的日内重复性的RSD<10％，对于痕量物质的定量分析来说，表明方法具有良好的精密度。
方法的精密度结果
以重复性试验所用酸奶样品为分析对象，按照上述样品前处理方法进行处理，加入其释放量相当的低、中、高三个不同含量的标样，进行基质加标试验，结果见下表。从表中可以看出，样品的加标回收率在84.87％～105.43％之间，说明方法具有较好的准确性。
表5方法的加标回收率结果
本实施例所用到的标准溶液仅以其中的一个浓度为例进行说明的，其它浓度值所制备的标准溶液经气相色谱-串联质谱仪分析所获得的标准曲线及回归方程与上述实施例相同，在此不在一一列举。所举实施例只是为了更好的理解本发明方法，并不具有任何限制作用，即上述方法或者等同上述情况的方法均包含在本发明的技术方案的保护范围中。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (4)

1.一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)内标溶液的制备：以D5-氨基甲酸乙酯为内标物，使用乙腈为溶剂，制备内标溶液；
(2)标准工作溶液的制备：以氨基甲酸乙酯标准品为目标物，使用乙腈为溶剂，经逐级稀释制备成标准储备溶液，然后分别加入一定量的内标溶液，制备成标准工作溶液；
(3)样品溶液的制备：准确称取一定质量的食物样品，加一定体积的水进行超声萃取，得到萃取液；然后使用C18固相萃取柱进行净化，得到净化液；再以二氯甲烷为溶剂，使用硅藻土固相萃取柱对净化液进行反萃取，得到淋洗液；最后对淋洗液进行浓缩，得样品溶液；
(4)气相色谱-串联质谱仪分析：用气相色谱-串联质谱仪GC-MS/MS对标准工作溶液和样品溶液进行检测分析；
(5)标准工作曲线的绘制及样品结果的计算，
其中，所述的样品溶液的制备包括以下步骤：
(3a)样品萃取：准确称取10g食物样品，于100mL锥形瓶中，并加入40mL超纯水和200μL内标溶液，使用漩涡混合器将样品分散均匀，再置于超声波发生器内超声萃取20min，得到萃取溶液；
(3b)萃取液净化：预先对规格为2g/10mL的C18 SPE小柱进行活化，即先加入10mL甲醇，抽干，然后再加入10mL超纯水，快速抽下，并使C18小柱上筛板留有少量水，待准备好C18SPE小柱后，移入10mL萃取液，使其保持1滴/秒的速度滴下，待小柱上筛板留有少量溶液时，再加入10mL混合溶剂9mL超纯水+1mL甲醇进行淋洗，使其保持1滴/秒的速度滴下，收集淋洗液，视为净化液；
(3c)净化液反萃取：预先对填料为20g的硅藻土SPE小柱进行活化，即移入50mL二氯甲烷进行淋洗活化，尽量抽干，待SPE小柱准备好后，将上述净化液全部移入SPE小柱，用一浓缩瓶接收淋洗液；然后再用70mL二氯甲烷多次对小柱进行淋洗，依靠二氯甲烷密度比水大的特征，自行滴下，收集所有留下来的液体，视为淋洗液；
(3d)淋洗液浓缩：在55℃、常压条件下，对淋洗液浓缩到1mL，得到样品进样溶液；
另外，所述的GC-MS/MS分析，其仪器分析条件为：采用规格为30m×0.25mm×0.25μm的HP-INNOWAX毛细管色谱柱；载气为氦气，恒流速度为1.0mL/min；进样方式：进样量为1μL，脉冲不分流，进样脉冲压力为25psi，时间为1min；进样口温度为240℃；传输线温度为260℃；升温程序为初始温度为50℃，以5℃/min的速率升高至150℃，再以10℃/min的速率升高至240℃,保持5min，
其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式；离子源温度：230℃；四极杆温度：均为150℃；碰撞气：氮气，流速1.5mL/min，载气氦气流速为2.25mL/min；多反应监测MRM模式，详细参数为：
化合物氨基甲酸乙酯：母离子62、产物离子44、碰撞能量20eV；
化合物D5-氨基甲酸乙酯：母离子64、产物离子44、碰撞能量15eV。
2.根据权利要求1所述的测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，所述的内标溶液的制备包括以下步骤：
(1)内标储备液：准确称取0.5g D5-氨基甲酸乙酯，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度；
(2)内标溶液：准确移取0.1mL内标储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度。
3.根据权利要求1所述的测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，所述的标准工作溶液的制备包括以下步骤：
(1)一级标准储备液：准确称取0.5g氨基甲酸乙酯，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度；
(2)二级标准储备液：准确移取0.1mL一级标准储备液，于100mL的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度；
(3)标准工作溶液：分别准确移取二级标准储备液15μL、30μL、60μL、120μL、240μL、480μL和960μL，至100mL的容量瓶中，再分别准确加入500μL内标溶液，用乙腈稀释并定容至刻度，得系列标准工作溶液。
4.根据权利要求1所述的测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，所述的标准曲线绘制及结果计算如下：以标准工作溶液中氨基甲酸乙酯与D5-氨基甲酸乙酯浓度之比为横坐标，以色谱图中氨基甲酸乙酯与D5-氨基甲酸乙酯峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线，将相同条件下测得的样品溶液中氨基甲酸乙酯与D5-氨基甲酸乙酯色谱峰面积比，代入标准工作曲线，根据下列公式求得发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的含量：
W = ( A A s - b ) &times; M s a &times; M
式中：
W——发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量，单位为微克每千克μg/kg；
A——氨基甲酸乙酯的峰面积；
As——D5-氨基甲酸乙酯的峰面积；
b——标准工作曲线的截距；
Ms——添加内标的质量，单位为微克μg；
a——标准工作曲线的斜率；
M——发酵食品的质量，单位为支。
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