CN113567566A - 一种氨基甲酸乙酯的检测方法 - Google Patents

一种氨基甲酸乙酯的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测油脂中氨基甲酸乙酯的方法，该方法包括如下步骤：（1）萃取油脂中的氨基甲酸乙酯；（2）氨基甲酸乙酯与占吨醇溶液发生衍生反应；（3）对氨基甲酸乙酯的衍生物进行检测，并计算氨基甲酸乙酯的含量。通过该方法能实现油脂中氨基甲酸乙酯的准确检出，解决了目标峰与相邻峰的干扰以及基线漂移问题，为油脂产品的质量控制以及确保产品的安全性提供了一种可靠的检测方法。

Description

一种氨基甲酸乙酯的检测方法
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种油脂中氨基甲酸乙酯的分析检测方法。
背景技术
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称EC)又名尿烷，世界卫生组织国际癌症研究机构将其归为一种2A类致癌物，是烟草叶及香烟中含有的天然成分，也是发酵食品(如面包，酸奶等)和发酵饮料(葡萄酒，中国黄酒，苹果酒等)在发酵和储藏过程中产生的一种化学污染物。研究表明，氨基甲酸乙酯的形成主要与前体物质尿素有关，并且尿素可与乙醇自发反应生成氨基甲酸乙酯。
由于在乙醇溶剂体系中使用尿素包合法是工业上广泛用于去除油脂中包含的饱和及单不饱和脂肪酸，富集多不饱和脂肪酸的重要手段。并且本申请发明人发现在油脂的生产纯化过程中，尿素和乙醇共同存在时具有在大生产条件下导致氨基甲酸乙酯产生的高风险。因此为了对油脂产品中的氨基甲酸乙酯进行质量控制，确保相关产品的安全性，开发一种检测油脂中氨基甲酸乙酯的方法十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测油脂中氨基甲酸乙酯的方法，为油脂及相关产品的安全性提供一种可靠的分析检测技术手段。
本发明为解决技术问题采用如下技术方案：
一种油脂中氨基甲酸乙酯的检测方法，包括如下步骤：
(1)萃取油脂中的氨基甲酸乙酯，得氨基甲酸乙酯提取液；
(2)将氨基甲酸乙酯提取液在酸性条件下与占吨醇发生衍生反应生成如式1所示化合物后进行检测，
Figure BDA0002848255730000011
在多种实施例中，油脂选自海洋生物来源的油脂；在某些实施例中，油脂选自鱼油、虾油或藻油中的一种或几种；在某些实施例中，油脂中包含含量为80％(A/A)以上的ω-3脂肪酸或ω-3脂肪酸烷基酯；其中，在一些实施例中，ω-3脂肪酸包含含量为80％(A/A)以上的DHA和/或EPA；其中，在一些实施例中，ω-3脂肪酸烷基酯包含含量为80％(A/A)以上的DHA和/或EPA的烷基酯。
在多种实施例中，步骤(1)使用的溶剂为疏水性有机溶剂和水；其中，在某些实施例中，使用的疏水性有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、异辛烷、环己烷中的一种或几种；其中，在某些实施例中，使用的疏水性有机溶剂为正己烷、异辛烷中的一种或两种；其中，在一些实施例中，使用的疏水性有机溶剂为异辛烷。
在多种实施例中，步骤(1)包括：取样品适量，精密称定，使用疏水性有机溶剂溶解后，加入纯化水萃取，收集水层，得氨基甲酸乙酯提取液；在一些实施例中，步骤(1)包括：取样品适量，精密称定，使用异辛烷溶解后，加入纯化水萃取，收集水层，得氨基甲酸乙酯提取液。
在多种实施例中，衍生反应步骤使用的溶剂为乙腈与甲醇的混合溶剂，所述乙腈与甲醇的体积比为98:2-83:17；在某些实施例中，乙腈与甲醇体积比为98:2、95:5、90:10或83:17中的一种；在一些实施例中，乙腈与甲醇体积比为95:5。
在多种实施例中，衍生反应步骤在酸性条件下进行，所述酸性条件为pH值＜7的条件；在某些实施例中，所述酸性条件为pH值＜4的条件；在一些实施例中，所述酸性条件为pH值＜2的条件。
在多种实施例中，衍生反应步骤在酸性条件下进行，所述酸性条件由盐酸提供。
在多种实施例中，衍生反应在避光条件下进行。
在多种实施例中，衍生反应步骤的反应温度为20-60℃；在某些实施例中，衍生反应步骤的反应温度为20-40℃；在一些实施例中，衍生反应步骤的反应温度为30℃。
在多种实施例中，检测方法采用高效液相色谱法进行检测，它包括以下步骤：
a、供试品溶液的制备；
b、对照品溶液的制备；
c、采用高效液相色谱仪对供试品溶液和对照品溶液进行检测；
d、采用外标法计算油脂中氨基甲酸乙酯的含量。
在某些实施例中，步骤c中，色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱；在某些实施例中，步骤c中，色谱柱为Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)、Ther mo-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)或其他效能相当的色谱柱；在一些实施例中，步骤c中，色谱柱为Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。
在某些实施例中，步骤c中，检测波长为240-243nm；在一些实施例中，步骤c中，检测波长为241nm。
在某些实施例中，步骤c中，流速为0.8-1.2mL/min，在一些实施例中，步骤c中，流速为1.0mL/min。
在某些实施例中，步骤c中，流动相由A和B组成，其中A为乙腈，B为0.01-0.02mol/L的乙酸铵溶液，梯度洗脱程序设置如下：
0min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50；
2min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50；
18min，流动相A与流动相B的体积比为90-99:1-10；
23min，流动相A与流动相B的体积比为90-99:1-10；
25min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50；
30min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50；
在一些实施例中，步骤c中，流动相由A和B组成，其中A为乙腈，B为0.01mol/L的乙酸铵溶液，梯度洗脱程序设置如下：
Figure BDA0002848255730000031
在某些实施例中，步骤c中，进样量为50-200μL；在一些实施例中，步骤c中，进样量为100μL。
其中具体地，步骤c中，高效液相色谱检测条件如下：
色谱柱：Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；
检测器：紫外检测器；
波长：241nm；
流速：1.0mL/min；
流动相由A和B组成，其中A为乙腈，B为0.01mol/L的乙酸铵溶液，梯度洗脱程序设置如下：
Figure BDA0002848255730000041
进样量：100μL。
本发明中提及的“A/A”为面积百分比，是本领域可以理解的表征含量的方式之一。
本发明中提及的“ω-3脂肪酸烷基酯”，表示游离的ω-3脂肪酸与烷基醇反应后得到的酯类产物，例如可以是ω-3脂肪酸甲酯、ω-3脂肪酸乙酯、ω-3脂肪酸丁酯、ω-3脂肪酸甘油酯。
本发明中提及的“DHA和/或EPA的烷基酯”表示游离的DHA和/或EPA与烷基醇反应后得到的酯类产物，例如可以是DHA和/或EPA甲酯、DHA和/或EPA乙酯、DHA和/或EPA丁酯、DHA和/或EPA甘油酯。
本发明中提及的“水”是指分析领域通常所使用的分析用水，例如可以是蒸馏水、纯化水、超纯水。
本发明中无论在具体数值之前是否有“约”表示，都是指具体数值的可以在本领域认可的范围内波动，例如具体数值的±1％、±0.5％、±0.2％或±0.1％内波动。
本发明提供的检测油脂中氨基甲酸乙酯的方法，是在大量筛选优化所述分析检测条件的基础上完成，以下列举研究过程中的部分实验内容。
一、油脂预处理条件的选择
由于油脂中成分复杂，导致氨基甲酸乙酯的检测难度增加，在进行氨基甲酸乙酯的含量测定前需对样品进行预处理。本发明采用液液萃取的方法对样品进行预处理，萃取溶剂的选择是液液萃取至关重要的因素。本申请发明人利用异辛烷溶解样品，加入不同的萃取溶剂进行萃取，萃取溶剂为乙腈、水或两者的混合溶剂。采用如下色谱条件，考察不同的萃取溶剂对整个分析方法的影响。
a、供试品溶液的制备
取油脂约2g，精密称定，加异辛烷2mL溶解，精密量取2mL萃取溶剂，加入上述溶液中，充分振摇后，静置分液，收集下层溶液，得氨基甲酸乙酯提取液，备用。精密量取氨基甲酸乙酯提取液0.5mL，依次加入占吨醇溶液0.5mL，盐酸溶液100μL，避光反应后，进样分析。
b、对照品溶液的制备
取氨基甲酸乙酯适量，精密称定，用萃取溶剂溶解并稀释成约0.05μg/mL的溶液，得对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5mL，依次加入占吨醇溶液0.5mL，盐酸溶液100μL，避光反应后，进样分析。
所述盐酸溶液的制备为取盐酸适量，加水稀释成1.2mol/L的盐酸溶液；所述占吨醇溶液的制备为取占吨醇适量，加乙腈溶解并稀释成1mg/mL的溶液。
c、高效液相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；
检测器：紫外检测器；
波长：241nm；
流速：1.0mL/min；
流动相由A和B组成，其中A为乙腈，B为0.01mol/L的乙酸铵溶液，梯度洗脱程序设置如下：
Figure BDA0002848255730000051
进样量：100μL。
d、记录色谱图中氨基甲酸乙酯衍生物峰作为目标峰与相邻峰的分离度，结果如表1所示。
表1不同萃取溶剂对高效液相检测结果的影响
Figure BDA0002848255730000061
萃取溶剂筛选结果表明采用纯化水作为萃取溶剂所得氨基甲酸乙酯提取液经衍生反应后，色谱图中氨基甲酸乙酯衍生物峰与相邻峰分离度显著优于乙腈或不同体积比乙腈与纯化水的混合溶剂萃取的样品。乙腈或不同体积比乙腈与纯化水的混合溶剂作为萃取溶剂时目标峰与相邻峰未完全分离影响含量测定。因此选择水作为萃取溶剂，萃取油脂中的氨基甲酸乙酯。
确定水为萃取溶剂后，在样品前处理和检测条件一致的前提下，仅改变溶解油脂的疏水性有机溶剂，观察疏水性有机溶剂对整个分析方法的影响，记录色谱图中氨基甲酸乙酯衍生物峰作为目标峰与相邻峰的分离度。疏水性有机溶剂为正己烷、异辛烷或两者的混合溶剂，结果如表2所示。
表2不同疏水性有机溶剂对高效液相检测结果的影响
Figure BDA0002848255730000062
结果表明，使用疏水性有机溶剂为正己烷、异辛烷或两者的混合溶剂溶解油脂，再用水进行萃取，收集水层进行衍生反应后，高效液相色谱仪检测的色谱图中氨基甲酸乙酯衍生物峰与相邻峰分离度均为1.3。
二、衍生反应步骤中溶剂的选择
本申请发明人通过进一步对实验条件的优化发现，衍生反应步骤中的溶剂是影响氨基甲酸乙酯衍生物色谱峰强度和基线稳定性的重要因素，只采用乙腈作溶剂时，检出的氨基甲酸乙酯衍生物的色谱峰以及相邻的副产物的色谱峰响应均略高，导致氨基甲酸乙酯衍生物出峰位置处基线漂移，影响结果准确性。在适当加入甲醇后，检测峰位置处基线漂移和杂质干扰明显减小。在样品前处理和检测条件一致的前提下，仅改变衍生反应步骤中的溶剂，观察溶剂对整个分析方法的影响，记录色谱图以及峰面积的变化。
a、供试品溶液的制备
取样品约2g，精密称定，加异辛烷2mL溶解，精密量取2mL纯化水，加入上述溶液中，充分振摇后，静置分液，收集水层溶液，得氨基甲酸乙酯提取液，备用。精密量取氨基甲酸乙酯提取液0.5mL，依次加入占吨醇溶液0.5mL，盐酸溶液100μL，避光反应后，进样分析。
b、对照品溶液的制备
取氨基甲酸乙酯适量，精密称定，用纯化水溶解并稀释成约0.05μg/mL的溶液，得对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5mL，依次加入占吨醇溶液0.5mL，盐酸溶液100μL，避光反应后，进样分析。
所述盐酸溶液的制备为取盐酸适量，加水稀释成1.2mol/L的盐酸溶液；所述占吨醇溶液的制备为取占吨醇适量，加不同比例的乙腈和甲醇的混合溶剂溶解并稀释成1mg/mL的溶液。
c、高效液相色谱仪的色谱条件：与上述“一、油脂预处理条件的选择”中步骤c中的色谱条件相同。
d、记录色谱图中氨基甲酸乙酯衍生物峰作为目标峰的峰面积以及与相邻峰的分离度，结果如表3所示。
表3衍生反应步骤中的溶剂对高相液相检测结果的影响
Figure BDA0002848255730000071
Figure BDA0002848255730000081
对衍生反应步骤中的溶剂研究结果表明，随着甲醇的加入，基线漂移和相邻峰干扰减小。但是随着甲醇量的增加，检出峰峰面积降低，峰宽变宽，分离度降低，也达不到检测的效果。乙腈与甲醇的体积比为98:2-83:17检测结果良好，进一步地，衍生反应步骤在溶剂选择为乙腈:甲醇的体积比为95:5的混合溶剂时，分离度为1.8，检测结果最优。
三、准确度考察
为进一步验证水作为萃取溶剂和衍生反应步骤中的乙腈与甲醇的体积比为98:2-83:17作为溶剂对检测结果准确性的影响，利用高效液相色谱仪测定加标供试品溶液与对照品溶液，并通过外标法计算加标供试品溶液中氨基甲酸乙酯的回收率。
a、加标供试品溶液的制备：取样品适量，采用标准加样法制备成含氨基甲酸乙酯0.1μg/g、0.2μg/g、0.3μg/g的加标样品，编号为1、2、3，每个加标样品平行制备3份，随后按上述“二、衍生反应步骤中溶剂的选择”中步骤a供试品溶液的制备，将加标样品制备为加标供试品溶液。其中，占吨醇溶液的溶剂为乙腈与甲醇的混合溶剂，乙腈与甲醇的体积比分别为98:2、95:5、83:17。
b、对照品溶液的制备：按上述“二、衍生反应步骤中溶剂的选择”中步骤b对照品溶液的制备方法，制备对照品溶液。其中，占吨醇溶液的溶剂为乙腈与甲醇的混合溶剂，乙腈与甲醇的体积比分别为98:2、95:5、83:17。
c、高效液相色谱仪的色谱条件：与上述“一、油脂预处理条件的选择”中步骤c中的色谱条件相同。
d、采用外标法计算氨基甲酸乙酯回收率，考察方法的准确度。结果如表4所示。
表4氨基甲酸乙酯准确度考察结果
Figure BDA0002848255730000082
Figure BDA0002848255730000091
结果表明，当占吨醇溶液的溶剂为乙腈:甲醇＝98:2时，回收率在94.19％-101.99％之间，RSD为4.24％；当占吨醇溶液的溶剂为乙腈:甲醇＝95:5时，回收率在93.18％-100.50％之间，RSD为3.93％；当占吨醇溶液的溶剂为乙腈:甲醇＝83:17时，回收率在94.07％-102.68％之间，RSD为4.53％。以上实验结果的回收率均在75％-120％之间，RSD≤8.0％，满足要求。由此可知，使用水萃取油脂中的氨基甲酸乙酯，经占吨醇衍生反应后进行分析，其中占吨醇溶液的溶剂为乙腈与甲醇的体积比为98:2-83:17的混合溶剂，采用HPLC检测油脂中的氨基甲酸乙酯，该方法的准确度较好。
本发明提供了一种检测油脂中氨基甲酸乙酯的方法，具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种检测油脂中氨基甲酸乙酯的方法，能够准确地对油脂中的氨基甲酸乙酯进行定性、定量研究，解决了油脂及相关产品的质量控制问题，确保相关产品的安全性。
2、本发明提供了一种利用高效液相色谱检测油脂中氨基甲酸乙酯的方法，该检测方法具有设备简单，操作简便，分离度好，准确度高，节约成本的优点，方便检测方法的转移也能满足本领域对氨基甲酸乙酯的检测需求。
3、本发明提供了一种油脂中氨基甲酸乙酯的预处理方法，该预处理方法简单，步骤少，采用液液萃取的方式提取油脂中的氨基甲酸乙酯，选择疏水性有机溶剂溶解油脂，水作为萃取溶剂，具有良好的萃取效果，排除了杂质的干扰，保证检测结果的准确性。
4、本发明发现选择乙腈和甲醇的混合溶液为衍生溶剂，使得检出峰峰位漂移和相邻峰干扰明显减小，保证检测结果的准确性。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。应当理解，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他方案变体，都属于本发明保护的范围。
实施例1-4油脂中氨基甲酸乙酯的含量测定
a、供试品溶液的制备
取样品约2g，精密称定，加疏水性有机溶剂2mL溶解，混匀，精密量取2mL纯化水，加入上述溶液中，充分振摇后，静置分液，收集水层溶液，得氨基甲酸乙酯提取液，备用。精密量取氨基甲酸乙酯提取液0.5mL，依次加入1mg/mL的占吨醇溶液0.5mL，1.2mol/L的盐酸溶液100μL，避光反应后，进样分析。
b、对照品溶液的制备
取氨基甲酸乙酯适量，精密称定，用纯化水溶解并稀释成约0.05μg/mL的溶液，得对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5mL，依次加入1mg/mL的占吨醇溶液0.5mL，1.2mol/L的盐酸溶液100μL，避光反应后，进样分析。
c、高效液相色谱仪的条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
检测器：紫外检测器；
波长：241nm；
流速：1.0mL/min；
流动相由A和B组成，其中A为乙腈，B为0.01mol/L的乙酸铵溶液，梯度洗脱程序设置如下：
Figure BDA0002848255730000101
进样量：100μL。
d、采用外标法计算油脂中氨基甲酸乙酯的含量，并记录氨基甲酸乙酯衍生物峰与相邻峰的分离度。
实施例1色谱柱为：Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。样品为按照市售产品
Figure BDA0002848255730000111
的组成制备得到的样品。疏水性有机溶剂为正己烷。占吨醇溶液制备为：取占吨醇适量，加乙腈与甲醇体积比为98:2的混合溶剂溶解并稀释成1mg/mL的溶液。
实施例2色谱柱为：Thermo-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。样品为按照市售产品
Figure BDA0002848255730000112
的组成制备得到的样品。疏水性有机溶剂为异辛烷，占吨醇溶液制备为：取占吨醇适量，加乙腈与甲醇体积比为83:17的混合溶剂溶解并稀释成1mg/mL的溶液。
实施例3色谱柱为：Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。样品为按照市售产品
Figure BDA0002848255730000113
藻油的组成制备得到的样品。疏水性有机溶剂为正己烷，占吨醇溶液制备为：取占吨醇适量，加乙腈与甲醇体积比为95:5的混合溶剂溶解并稀释成1mg/mL的溶液。
实施例4色谱柱为：Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。样品为按照市售产品
Figure BDA0002848255730000114
藻油的组成制备得到的样品。疏水性有机溶剂为异辛烷，占吨醇溶液制备为：取占吨醇适量，加乙腈与甲醇体积比为83:17的混合溶剂溶解并稀释成1mg/mL的溶液。
结果如表5所示。
表5实施例1-4氨基甲酸乙酯的含量及氨基甲酸乙酯衍生物峰与相邻峰的分离度结果
实施例 含量(μg/g) 分离度
1 0.103 1.5
2 0.098 1.5
3 0.096 1.8
4 0.100 1.6

Claims (10)

1.一种油脂中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)萃取油脂中的氨基甲酸乙酯，得氨基甲酸乙酯提取液；
(2)将氨基甲酸乙酯提取液在酸性条件下与占吨醇发生衍生反应生成如式1所示化合物后进行检测，
Figure FDA0002848255720000011
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述油脂选自海洋生物来源的油脂，优选自鱼油、虾油或藻油中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述油脂中包含含量为80％(A/A)以上的ω-3脂肪酸或ω-3脂肪酸烷基酯。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述ω-3脂肪酸包含含量为80％(A/A)以上的DHA和/或EPA；所述ω-3脂肪酸烷基酯包含含量为80％(A/A)以上的DHA和/或EPA的烷基酯。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)所使用的溶剂为疏水性有机溶剂和水。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述疏水性有机溶剂选自正己烷、异辛烷中的一种或两种，优选为异辛烷。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：取样品适量，精密称定，使用异辛烷溶解后，加入纯化水萃取，收集水层，得氨基甲酸乙酯提取液。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生反应步骤使用的溶剂为乙腈与甲醇的混合溶剂，其中所述乙腈与甲醇的体积比为98:2-83:17。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述乙腈与甲醇的体积比为95:5。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括采用高效液相色谱法检测的步骤，其中色谱检测条件如下：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
检测器：紫外检测器；
波长：240-243nm；
流速：0.8-1.2mL/min；
流动相由A和B组成，其中A为乙腈，B为0.01-0.02mol/L的乙酸铵溶液，梯度洗脱程序设置如下：
0min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50；
2min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50；
18min，流动相A与流动相B的体积比为90-99:1-10；
23min，流动相A与流动相B的体积比为90-99:1-10；
25min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50；
30min，流动相A与流动相B的体积比为50-60:40-50。
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