CN114904297A - 改进型spe柱及基于其的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改进型SPE柱，包括：SPE柱管、设置在SPE柱管内的上筛板和下筛板以及由上至下依次填充在上筛板和下筛板之间的固相萃取填料层和除水填料层。本发明还公开了一种酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其采用该改进型SPE柱对样品进行前处理，然后利用气相色谱质谱联用的方法进行检测。本发明提供的改进型SPE柱通过在硅藻土填料下层增加了用于除水的无水硫酸钠，在洗脱目标物的同时就完成了洗脱液除水的操作，可大大提高实验效率，降低人工移液操作，减少误差的发生；本发明提供的检测方法能提高样本富集倍数，降低目标物的检出限；SPE柱中通过增加除水填料，降低了样品中的水进入气相色谱柱的风险，可延长色谱柱寿命。
Description
技术领域
本发明涉及发酵食品中风险物检测筛查技术领域，特别涉及一种改进型SPE柱及基于其的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法。
背景技术
白酒、黄酒等酒类的酿造存在发酵过程，而酿酒部分辅料中的含氮化合物会在发酵、蒸馏、老化等过程中生成氨基甲酸乙酯(EC)，氨基甲酸乙酯是一种具有潜在致癌作用的化合物，其成为酒中潜在的食品安全风险。
为准确测定酒中氨基甲酸乙酯的含量，出台有国家标准《GB/T5009.223-2014食品中氨基甲酸乙酯的测定》及行业标准《SN/T 0285-2012出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法气相色谱-质谱法》，其中《GB/T5009.223-2014》中样品处理方法为加入氯化钠进行盐析操作，再将样品上样至碱性硅藻土固相萃取柱(SPE)上，经过淋洗后，将目标物用5％乙酸乙酯-乙醚溶液洗脱，再将洗脱液流经装有无水硫酸钠的玻璃漏斗进行脱水，再氮吹浓缩。国标方法涉及使用过漏斗的方式进行样品脱水，这种方式严重影响大批量样品的操作。行业标准《SN/T 0285-2012》则使用加入氯化钠的方式进行盐析反应，再使用二氯甲烷进行液液萃取，将二氯甲烷层转移至浓缩瓶进行减压浓缩至近干，然后加入乙腈复溶样品，再加入正己烷进行液液萃取操作，转移乙腈层溶液并加入乙二胺-N-丙基填料(PSA)至溶液中进行杂质吸附，再使用有机相滤膜进行样品过滤，最后进行检测，整个实验流程比国标方法更是繁琐。
为简化实验流程，各大酒厂则自主研发了酒中氨基甲酸乙酯的测定方法，例如宜宾五粮液股份有限公司公开了“专利CN102944636B蒸馏酒中氨基甲酸乙酯的高效液相色谱-质谱检测方法”，此方法使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去样品中的乙醇，再使用水定容、过滤之后使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进样检测，此方法操作步骤少，但使用旋转蒸发仪则意味着样品通量会很低，同时这种前处理方法无法除去酒中的糖类、有机酸等干扰物质，不利于目标物的定量；而贵州茅台酒股份有限公司公开的专利“CN107238673B一种超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱检测白酒中氨基甲酸乙酯含量的方法”，方法中首先将酒样进行氮吹至乙醇除净，再使用水定容样品，然后使用滤膜进行样品过滤，样品检测则使用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱分析。该方法为了简化样品处理方法，最终均使用LC-MS/MS进行样品检测，而LC-MS/MS仪器价格高昂，不利于方法的推广应用。
所以现在有必要提供一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种改进型SPE柱及基于其的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法。本发明提出的检测方法，采用了可兼容高通量样品的前处理方法，同时检测仪器则使用价格较为亲民的GC-MS。本发明提供了一种基于硅藻土填料的改进型SPE柱，硅藻土是一种具有多孔结构的填料，其孔内壁富有薄液膜，将样品载样至填料上之后，样品则可以与液膜结合，再加入与水不相容的试剂进行目标物洗脱，则可以形成微观上的液液萃取，故可称为固相支持液液萃取法(Solid SupportedLiquid/Liquid Extraction，SLE)，SLE法能够提供一个理想的液液分配的支撑表面，可以代替大部分传统的液液萃取方法，通过装填在SPE柱管中，更容易实现萃取的自动化。与传统的液液萃取相比，具有更高的萃取效率和回收率，可避免乳化现象，萃取时间缩短一半以上。由于酒样中含有大量水，样品经硅藻土净化之后仍会有部分水穿透填料进入洗脱液中，本发明在硅藻土填料下层增加了用于除水的无水硫酸钠，在洗脱目标物的同时就完成了洗脱液除水的操作，可大大提高实验效率，同时降低人工移液操作，减少误差的发生。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种改进型SPE柱，包括：SPE柱管、设置在所述SPE柱管内的上筛板和下筛板以及由上至下依次填充在所述上筛板和下筛板之间的固相萃取填料层和除水填料层。
优选的是，所述固相萃取填料层中的填料为硅藻土，所述除水填料层中的填料为无水硫酸钠。
本发明还提供一种酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其采用如上所述的改进型SPE柱对样品进行前处理，然后利用气相色谱质谱联用的方法进行检测。
优选的是，该酒中氨基甲酸乙酯的检测方法包括以下步骤：
1)将样品加入如上所述的改进型SPE柱中，进行前处理，得到测试样品；
2)利用气相色谱质谱联用的方法对测试样品进行定量检测，经标准曲线的计算得到样品中氨基甲酸乙酯的含量，其中色谱柱为：DA-INOWAX。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)将样品加入改进型SPE柱中；
1-2)静置，使样品和改进型SPE柱中的填料充分接触浸润；
1-3)使用二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物；
1-4)收集洗脱液，并用氮气吹干部分洗脱液；
1-5)使用二氯甲烷对步骤1-4)得到的洗脱液进行定容，涡旋处理，得到测试样品。
优选的是，所述洗脱液中二氯甲烷与乙醚的体积比为9:1～6:4。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)称取1-4g样品加入改进型SPE柱中；
1-2)静置2-10min，使样品和改进型SPE柱中的填料充分接触浸润；
1-3)使用3-12mL二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物，洗脱过程中控制流速为0.5-2mL/min；
1-4)收集洗脱液，并于30℃用氮气将洗脱液吹至0.05-0.2mL；
1-5)使用二氯甲烷对步骤1-4)得到的洗脱液进行定容，涡旋15-60S，得到测试样品。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)称取2g样品加入改进型SPE柱中；
1-2)静置5min，使样品和改进型SPE柱中的填料充分接触浸润；
1-3)使用6mL二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物，其中，所述洗脱液中二氯甲烷与乙醚的体积比为6:4，洗脱过程中控制流速为1mL/min；
1-4)收集洗脱液，并于30℃用氮气将洗脱液吹至0.1mL；
1-5)使用二氯甲烷将步骤1-4)得到的洗脱液定容至0.5mL，涡旋30S，得到测试样品。
优选的是，所述步骤2)中气相色谱条件为：
载气：氦气；载气流速1mL/min；进样方式：不分流进样，进样量1μL。
优选的是，所述步骤2)中质谱条件为：
接口温度：240℃；
电离方式：EI，电子能量：70eV；
离子源温度：230℃；
四级杆温度：150℃；
扫描模式：SIM模式，监测离子：62,74,89；其中定量离子为62。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种改进型SPE柱，通过在硅藻土填料下层增加了用于除水的无水硫酸钠，在洗脱目标物的同时就完成了洗脱液除水的操作，可大大提高实验效率，同时降低人工移液操作，减少误差的发生；
本发明还提供了一种基于该改进型SPE柱的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，该方法能提高样本富集倍数，降低目标物的检出限；改进型SPE柱中通过增加除水填料，降低了样品中的水进入气相色谱柱的风险，可延长色谱柱寿命。
附图说明
图1为本发明的改进型SPE柱的结构示意图；
图2为本发明的实施例中的标准溶液色谱图；
图3为本发明的实施例中的酒样品加标色谱图；
图4为本发明的实施例中的酒样品色谱图；
图5为本发明的实施例中的氨基甲酸乙酯的标准曲线图。
附图标记说明：
1—改进型SPE柱，2—SPE柱管；3—上筛板；4—下筛板；5—固相萃取填料层；6—除水填料层；7—SPE柱出口。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
参照图1，本实施例的一种改进型SPE柱1，包括：SPE柱管2、设置在SPE柱管2内的上筛板3和下筛板4以及由上至下依次填充在上筛板3和下筛板4之间的固相萃取填料层5和除水填料层6，SPE柱管2底部具有SPE柱出口7。
其中，固相萃取填料层5中的填料为硅藻土，除水填料层6中的填料为无水硫酸钠。
由于酒样中含有大量水，样品经硅藻土净化之后仍会有部分水穿透填料进入洗脱液中，本发明中在硅藻土填料下层增加了用于除水的无水硫酸钠，在洗脱目标物的同时就完成了洗脱液除水的操作，可大大提高实验效率，同时降低人工移液操作，减少误差的发生。
实施例2
本实施例提供一种酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其采用实施例1的改进型SPE柱1对样品进行前处理，然后利用气相色谱质谱联用的方法进行检测，包括以下步骤：
1)将样品加入如权利要求1-2中任意一项的改进型SPE柱1中，进行前处理，得到测试样品：
1-1)称取1-4g样品加入改进型SPE柱1中；
1-2)静置2-10min，使样品和改进型SPE柱1中的填料充分接触浸润；
1-3)使用3-12mL二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物，洗脱过程中控制流速为0.5-2mL/min；洗脱液中二氯甲烷与乙醚的体积比为9:1～6:4；
1-4)收集洗脱液，并于30℃用氮气将洗脱液吹至0.05-0.2mL；
1-5)使用二氯甲烷对步骤1-4)得到的洗脱液进行定容，涡旋15-60S，得到测试样品。
2)利用气相色谱质谱联用的方法对测试样品进行定量检测，经标准曲线的计算得到样品中氨基甲酸乙酯的含量，其中色谱柱为：DA-INOWAX。
实施例3
本实施例在实施例2的基础上进一步提高更为详细的实施例。
试剂来源说明
(1)氨基甲酸乙酯(sigma)；
(2)二氯甲烷(色谱纯，康科德科技有限公司)；
(3)乙酸乙酯(色谱纯，康科德科技有限公司)；
(4)正己烷(色谱纯，康科德科技有限公司)；
(5)甲基叔丁基醚(色谱纯，康科德科技有限公司)；
(6)乙醚(色谱纯，康科德科技有限公司)。
试剂配制
准确称取约0.1g(精确至0.0001g)氨基甲酸乙酯标准品于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到标准储备液。用甲醇逐级稀释储备液，得到浓度分别为20、10、5、1、0.1、0.05(单位为μg/mL)标准工作溶液。
一种酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其采用实施例1的改进型SPE柱1对样品进行前处理，然后利用气相色谱质谱联用的方法进行检测，包括以下步骤：
1、样品前处理：
1-1、称取2g样品加入改进型SPE柱1中；
1-2、静置5min，使样品和改进型SPE柱1中的填料充分接触浸润；
1-3、使用6mL二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物，其中，洗脱液中二氯甲烷与乙醚的体积比为6:4，洗脱过程中控制流速为1mL/min；
1-4、收集洗脱液，并于30℃用氮气将洗脱液吹至0.1mL；
1-5、使用二氯甲烷将步骤1-4)得到的洗脱液定容至0.5mL，涡旋30S，得到测试样品。
2、建立标准曲线
将标准工作溶液进行气相色谱串联质谱法检测，建立氨基甲酸乙酯的标准曲线，参照图5，为氨基甲酸乙酯的标准曲线图，得到线性方程为y＝2.19e+005*x+4.40e+003(相关系数为0.999)，其中y为峰面积，x为目标物浓度(μg/mL)。
3、气相色谱串联质谱法检测
(1)气相色谱条件：
色谱柱：DA-INOWAX(30m*0.25mm*0.25um)；
载气：高纯氦气；
载气流速1mL/min；
程序升温：60℃(5min)3.5℃/min 150；
进样方式：不分流进样，进样量1μL。
(2)质谱条件为：
接口温度：240℃；
电离方式：EI，电子能量：70eV；
离子源温度：230℃；
四级杆温度：150℃；
扫描模式：SIM模式，监测离子：62,74,89；其中定量离子为62。
参照图2，为标准溶液色谱图(浓度为0.2μg/mL)，参照图3为酒样品加标色谱图(加标浓度为0.2μg/mL)，参照图4为酒样品色谱图。
实施例4
本实施例对实施例3中的酒中氨基甲酸乙酯检测方法的相关条件进行了优化并对该方法的精密度进行了验证。
1、洗脱液组成及洗脱体积的优化，如下表1：
表1洗脱液优化数据
| 洗脱体积/mL | 洗脱液组成(v/v) | 氨基甲酸乙酯峰面积 |
| 10 | 二氯甲烷 | 288150 |
| 10 | 乙酸乙酯 | 172739 |
| 10 | 乙醚 | 220781 |
| 10 | 甲基叔丁基醚 | 129043 |
| 10 | 正己烷 | 85641 |
| 10 | 二氯甲烷/乙醚(1/9) | 239808 |
| 10 | 二氯甲烷/乙醚(9/1) | 283451 |
| 10 | 二氯甲烷/乙醚(7/3) | 279012 |
| 10 | 二氯甲烷/乙醚(6/4) | 274198 |
| 10 | 二氯甲烷/乙醚(5/5) | 245981 |
| 8 | 二氯甲烷/乙醚(6/4) | 278901 |
| 6 | 二氯甲烷/乙醚(6/4) | 278751 |
| 5 | 二氯甲烷/乙醚(6/4) | 260901 |
本实施例中尝试了液液萃取常用的萃取试剂，二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚、正己烷等溶液，实验中发现二氯甲烷对目标物的洗脱效率最高，但二氯甲烷较难氮气吹干，同时发现沸点低、易挥发的乙醚对氨基甲酸乙酯的萃取效率也较理想，因此采用二氯甲烷与乙醚组合进行目标物萃取，经过对比试验，发现二氯甲烷/乙醚比例由9/1至6/4时，萃取效率差异不大，当两者比例为5/5时，萃取效率明显降低，为兼顾洗脱效率与洗脱液易挥发性，最终选用二氯甲烷/乙醚(6/4，v/v)作洗脱液的优化选择方案，同时试验还优化了洗脱剂的体积，最终确定洗脱体积为6mL。
2、精密度
本实施例中，分别称取17份2g酒样，其中5份分别加入浓度为0.4μg/mL标准工作液50μL，5份分别加入浓度为4μg/mL标准工作液50μL，另外5份分别加入浓度为15μg/mL标准工作液50μL，余下2份酒样作为空白，按照上述样品处理方法进行样品处理，将得到的样品采用实施例3的方法进行检测，结果如表1所示。
表2加标回收率及精密度
| 加标浓度/μg/mL | NO.1 | NO.2 | NO.3 | NO.4 | NO.5 | 平均回收率 | RSD(n＝5) |
| 0.01 | 90.50％ | 89.70％ | 104.90％ | 96.70％ | 95.20％ | 95.40％ | 6.39％ |
| 0.1 | 89.90％ | 101.10％ | 95.40％ | 86.90％ | 91.20％ | 92.90％ | 5.93％ |
| 3.75 | 85.80％ | 95.70％ | 88.10％ | 92.70％ | 95.50％ | 91.56％ | 4.86％ |
可以看出，本发明的方法能获得校稿的精密度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种改进型SPE柱，其特征在于，包括：SPE柱管、设置在所述SPE柱管内的上筛板和下筛板以及由上至下依次填充在所述上筛板和下筛板之间的固相萃取填料层和除水填料层。
2.根据权利要求1所述的改进型SPE柱，其特征在于，所述固相萃取填料层中的填料为硅藻土，所述除水填料层中的填料为无水硫酸钠。
3.一种酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，其采用如权利要求1-2中任意一项所述的改进型SPE柱对样品进行前处理，然后利用气相色谱质谱联用的方法进行检测。
4.根据权利要求3所述的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)将样品加入如权利要求1-2中任意一项所述的改进型SPE柱中，进行前处理，得到测试样品；
2)利用气相色谱质谱联用的方法对测试样品进行定量检测，经标准曲线的计算得到样品中氨基甲酸乙酯的含量，其中色谱柱为：DA-INOWAX。
5.根据权利要求4所述的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)将样品加入改进型SPE柱中；
1-2)静置，使样品和改进型SPE柱中的填料充分接触浸润；
1-3)使用二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物；
1-4)收集洗脱液，并用氮气吹干部分洗脱液；
1-5)使用二氯甲烷对步骤1-4)得到的洗脱液进行定容，涡旋处理，得到测试样品。
6.根据权利要求5所述的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，所述洗脱液中二氯甲烷与乙醚的体积比为9:1～6:4。
7.根据权利要求6所述的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)称取1-4g样品加入改进型SPE柱中；
1-2)静置2-10min，使样品和改进型SPE柱中的填料充分接触浸润；
1-3)使用3-12mL二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物，洗脱过程中控制流速为0.5-2mL/min；
1-4)收集洗脱液，并于30℃用氮气将洗脱液吹至0.05-0.2mL；
1-5)使用二氯甲烷对步骤1-4)得到的洗脱液进行定容，涡旋15-60S，得到测试样品。
8.根据权利要求7所述的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)称取2g样品加入改进型SPE柱中；
1-2)静置5min，使样品和改进型SPE柱中的填料充分接触浸润；
1-3)使用6mL二氯甲烷与乙醚的混合物作为洗脱液洗脱目标物，其中，所述洗脱液中二氯甲烷与乙醚的体积比为6:4，洗脱过程中控制流速为1mL/min；
1-4)收集洗脱液，并于30℃用氮气将洗脱液吹至0.1mL；
1-5)使用二氯甲烷将步骤1-4)得到的洗脱液定容至0.5mL，涡旋30S，得到测试样品。
9.根据权利要求4所述的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中气相色谱条件为：
载气：氦气；载气流速1mL/min；进样方式：不分流进样，进样量1μL。
10.根据权利要求4所述的酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中质谱条件为：
接口温度：240℃；
电离方式：EI，电子能量：70eV；
离子源温度：230℃；
四级杆温度：150℃；
扫描模式：SIM模式，监测离子：62,74,89；其中定量离子为62。
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