CN112305129B - 一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法，包括：向菌渣样品中加入提取剂后涡旋振荡，超声；对超声后的液体离心，取上清液，之后将上清液吹干，向加入净化液，涡旋振荡后，采用高效液相色谱串联质谱仪对振荡后液体进行定性、定量检测。与现有技术相比，本发明对色谱条件、质谱条件以及供试品制备方法的试验，建立了菌渣中阿卡波糖的高效液相色谱串联质谱检测分析方法；通过对色谱条件、质谱条件和净化工艺的优化，建立了菌渣中阿卡波糖的检测方法，通过方法学验证试验研究表明，建立的方法准确度高、专属性强、重现性能良好，能有效检测菌渣中残留阿卡波糖。

Description

一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法
技术领域
本发明涉及菌渣检测检验技术领域，尤其是涉及一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法。
背景技术
原料药阿卡波糖目前主要的生产方式是发酵法。阿卡波糖是由农副产品组成的固体或液体培养基，经接种药物产生菌、多级纯种培养等生物合成过程，并从中提取得到的。而其药渣则是药物提取后剩余培养基脱水干化后得到的固态物质，残药量一般在200mg·kg-1之间。此外，药渣中还含有高达20％～40％的蛋白质及丰富的有机质、矿物质和微量元素，将其无害化后，资源化利用的潜力巨大。但由于残留药物的环境行为与生物安全性尚未可知，废渣的资源化利用还不能做到有理有据。只有首先了解药渣基质与待测药物的性质，从而建立起准确分析药渣组成、尤其是残留药物及次级代谢物含量的方法，并将其与药渣环境行为、生物安全性建立起构效关系，作为安全评估标准，困扰无害化和资源化利用的难题才能迎刃而解。
现有的阿卡波糖检测方法专利(专利号：CN201811295579.3)公开了一种针对阿卡波糖发酵液的前处理及检测方法，采用高效液相色谱仪进行检测，所开发的前处理技术能有效解决发酵液中杂质对检测器的影响以及对检测结果造成的误差，并减少了后续仪器设备的维护；专利CN201610144261.X也提供了一种高效液相色谱法检测卡波糖的方法，主要用于工业样品中阿卡波糖的产品质量检验，可以实现阿卡波糖与杂质A的有效分离及检测并可以多分离出一种未知杂质，更有利于生产企业控制阿卡波糖的产品质量；专利CN201911301248.0涉及一种阿卡波糖及有关物质的分析方法，引入了焦磷酸盐作为色谱流动相，能够有效的减少金属离子对于阿卡波糖检测的影响，从而大大提高了阿卡波糖与杂质的分离效果。
2015版《中国药典》第二部中、文献《阿卡波糖及其制剂的高效液相色谱分析方法》、《高效液相色谱法测定阿卡波糖口崩片的含量》也都提供了高效液相色谱法测定阿卡波糖含量的相关方法。
以上所提及的专利、文献提供的方法均能有效的针对发酵液、药物产品进行阿卡波糖含量的定量分析，但是都存在一定的不足，主要在于现有的阿卡波糖检测方法检测的基质多为含量较高的发酵母液、药品等基质成分较为简单的物质，纯度高且杂质少，对目标物阿卡波糖提取、净化等步骤的要求并不高，经过一些相对简单的操作后，即可实现定量检测，导致方法无法适用于药渣中阿卡波糖含量的检测。因此基于上述专利、药典以及文献提供的方法，对于处理前后菌渣中残留药物的提取以及净化、精度等难以达到较优的效果，这是目前亟需解决的技术问题。
基质为医药发酵菌渣，成分相当复杂，其中包含大量有机质及糖类物质，对检测的干扰非常大，对仪器要求也较高，需要一套严格的提取和净化技术才能支撑后续仪器分析检测，尤其对于处理后的菌渣，残留的阿卡波糖含量较低，极限情况往往低于1mg/kg，必须开发出有针对性的提取和净化手段才能在仪器上检测得到准确的含量。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法，以填补现有方法、标准中并没有完整的关于阿卡波糖菌渣中阿卡波糖残留含量检测方法的空白，本方法利用提取剂提取，经浓缩、净化后采用液质联用仪进行检测，方法灵敏度高，结果准确可靠。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明中保护的菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法，包括以下步骤：
S1：向菌渣样品中加入提取剂后涡旋振荡，超声；
S2：对超声后的液体离心，取上清液，之后将上清液吹干，向加入净化液，涡旋振荡后，采用高效液相色谱串联质谱仪对振荡后液体进行定性、定量检测。
进一步地，所述菌渣中阿卡波糖残留含量小于等于200mg/kg。
进一步地，所述菌渣中阿卡波糖残留含量为0.1-10mg/kg。
进一步地，所述阿卡波糖菌渣与提取剂的质量比为1:5-50。
本发明公开的方法中，提取步骤是关键环节，提取剂的用量对后续仪器检测的影响较大，提取剂量过少，不利于提取；提取量过多则影响后续定量。根据实验结果，阿卡波糖菌渣与提取剂的质量比为1:5-50之间较为合适。
进一步地，S1中所述提取剂为二乙胺-乙腈-水混合溶液。所述混合溶液中二乙胺的占比10wt％-20wt％，乙腈占比为20wt％-30wt％，其余为水。本发明公开的方法中，提取步骤是关键环节，提取剂的选择直接决定了提取效果的好坏。目标物为糖类物质，属于强极性物质。二乙胺、乙腈以及水都是极性溶剂，能够加大糖类的溶解。经实验验证，二乙胺的加入能大大提高提取效率，是提取环节的关键。因此根据实验结果，提取剂为二乙胺-乙腈-水混合溶液，混合液中二乙胺的占比为10wt％-20wt％之间，乙腈占比为20wt％-30wt％之间。
进一步地，S1中所述超声的时间为10-120min。
进一步地，S2中所述净化液为甲醇-乙腈-水混合溶液，混合液中乙腈占比为30wt％-70wt％，甲醇占比为20wt％-50wt％，其余为水。本发明为了保证检测仪器的稳定运行以及提高整个前处理过程的效率，需要对提取液进行净化，本发明通过加入净化液来达到这一效果。加入净化液来进行净化，可以省去使用固相萃取柱的操作步骤，与一般实验方法相比，效率大大提高，而且本发明所使用的净化液可以使减少样品的损失。因此根据实验结论，净化液选择为甲醇-乙腈-水混合溶液，混合液中乙腈占比为30％-70％之间，甲醇占比为20％-50％之间。
进一步地，本发明公开的方法中，为了保证检测结果的准确性、检测仪器的稳定运行，对仪器检测方法有较高的要求，上述所述高效液相色谱串联质谱条件包括：色谱柱需要选择亲水色谱柱；流动相A为乙腈和乙酸铵溶液；梯度洗脱。
进一步地，高效液相色谱串联质谱条件中质谱条件包括：ESI离子源；正离子扫描，选择反应监测模式；阿卡波糖母离子为646，定量子离子为303.5，定性子离子为145.8。
进一步地，本发明公开的方法，为了能够对菌渣中阿卡波糖含量准确定量，采用阿卡波糖标准溶液的色谱峰面积作为参照，并通过受试溶液的色谱峰面积计算得到其浓度，进而计算出菌渣样品中阿卡波糖含量。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
1)本发明建立了完整的关于阿卡波糖菌渣中阿卡波糖残留含量的高效液相色谱串联质谱检测方法，经过方法学验证，证明本发明方法具有较好的重复性和实用性。
2)本发明方法不仅为生产企业提供废渣的科学管理技术保证，而且为废渣资源化利用和循环经济发展提供重要依据。
3)本发明的优势在于废渣前处理步骤简单高效，不仅能高效提取菌渣中残留阿卡波糖，还能有效去除基质中干扰检测的物质，大大提高了检测的准确性，同时也对仪器较好的保护。
4)通过本技术方案对阿卡波糖残留量为200mg/kg左右的菌渣进行检测，平均回收率为97.6％-100.8％之间，精密度试验RSD为3.23％；对阿卡波糖残留量为0.1-10mg/kg的菌渣进行检测，平均回收率为82.4％-88.5％之间，精密度试验RSD为3.25％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。
实施例1
本实施例采用标准加入法测定阿卡波糖原药渣中阿卡波糖含量，包括以下步骤：
(1)样品前处理
分别准确称取阿卡波糖原药废渣样品0.2g于15mL离心管中，依次向各样品中加入0.2mL浓度为25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg的阿卡波糖标准溶液，加入10mL二乙胺-乙腈-水混合溶液(V:V:V＝1:2:7)后超声提取100min。样品离心后，取6mL上清液氮气吹干。加入1mL甲醇-乙腈-水混合液(V:V:V＝5:3:2)，离心取上清液过滤，待用。
(2)检测条件
样品经前处理后进入液质联用分析。液相色谱条件如下：色谱柱为ACE HILIC-N(3μm，150*2.1mm)；流动相为：A相10mmol/L乙酸铵，B相乙腈；洗脱条件为：0-5min，B相90％，5-15min，B相90％-60％；流速0.3mL/min；柱温25℃；进样量10μL。
质谱条件如下：离子化模式为ESI电喷雾电离，正离子扫描；喷雾电压3500V；鞘气压力15psi；辅助气压力5psi；离子传输管温度275℃；雾化温度275℃；碰撞气压力1.5torr；阿卡波糖母离子为646，定量子离子为303.5，定性子离子为145.8，碰撞电压27V。
(3)样品检测
将经过前处理的样品在上述检测条件下进行LC-MS/MS检测。以标准溶液添加浓度为横坐标，以阿卡波糖SRM色谱峰面积为纵坐标，标准曲线方程为y＝3877.6x+880982，将标准曲线外延，计算得原药废渣样品中阿卡波糖含量为227.2mg/kg。
实施例2
本实施例采用标准加入法测定已处理过的阿卡波糖废渣样品中阿卡波糖含量，包括以下步骤：
(1)样品前处理
分别准确称取阿卡波糖原药废渣样品0.15g于15mL离心管中，依次向各样品中加入0.2mL浓度为0.25mg/kg、0.50mg/kg、0.75mg/kg、1.00mg/kg、1.25mg/kg、1.50mg/kg、1.75mg/kg、2.00mg/kg的阿卡波糖标准溶液，加入8mL二乙胺-乙腈-水混合溶液(V:V:V＝2:3:5)后超声提取120min。样品离心后，取8mL上清液氮气吹干。加入1mL甲醇-乙腈-水混合液(V:V:V＝2:7:1)，离心取上清液过滤，待用。
(2)检测条件
样品经前处理后进入液质联用分析。液相色谱条件如下：色谱柱为ACCUCOREUREA-HILIC(2.6μm，100*2.1mm)；流动相为：A相10mmol/L乙酸铵，B相乙腈；洗脱条件为：0-5min，B相90％，5-15min，B相90％-60％；流速0.3mL/min；柱温25℃；进样量10μL。
质谱条件如下：离子化模式为ESI电喷雾电离，正离子扫描；喷雾电压3500V；鞘气压力15psi；辅助气压力5psi；离子传输管温度275℃；雾化温度275℃；碰撞气压力1.5torr；阿卡波糖母离子为646，定量子离子为303.5，定性子离子为145.8，碰撞电压27V。
(3)样品检测
将经过前处理的样品在上述检测条件下进行LC-MS/MS检测。以标准溶液添加浓度为横坐标，以阿卡波糖SRM色谱峰面积为纵坐标，标准曲线方程为y＝114567x+105232，将标准曲线外延，计算得到，已处理过的阿卡波糖废渣样品中，阿卡波糖含量为0.92mg/kg。
实施例3
本实施例采用单点比较法测定处原渣中阿卡波糖含量，包括以下步骤：
(1)样品前处理
准确称取阿卡波糖原药废渣样品0.5g于50mL离心管中，加入20mL二乙胺-乙腈-水混合溶液(V:V:V＝3:6:11)后超声提取10min。样品离心后，取15mL上清液氮气吹干。加入1mL甲醇-乙腈-水混合液(V:V:V＝3:3:4)，离心取上清液过滤，待用。
采用乙腈-水溶液(V:V＝7:3)作为溶剂，配制200ppm的标准溶液，待用。
(2)检测条件
样品经前处理后进入液质联用分析。液相色谱条件如下：色谱柱为Shim-pack GISHILIC(3μm，150*2.1mm)；流动相为：A相10mmol/L乙酸铵，B相乙腈；洗脱条件为：0-5min，B相90％，5-15min，B相90％-60％；流速0.3mL/min；柱温25℃；进样量10μL。
质谱条件如下：离子化模式为ESI电喷雾电离，正离子扫描；喷雾电压3500V；鞘气压力15psi；辅助气压力5psi；离子传输管温度275℃；雾化温度275℃；碰撞气压力1.5torr；阿卡波糖母离子为646，定量子离子为303.5，定性子离子为145.8，碰撞电压27V。
(3)样品检测
将经过前处理的样品在上述检测条件下进行LC-MS/MS检测。以标准溶液峰面积为对比，计算得原药废渣样品中阿卡波糖含量为235.1mg/kg。
实施例4
本实施例采用标准曲线法测定已处理过的阿卡波糖废渣样品中阿卡波糖含量，包括以下步骤：
(1)样品前处理
准确称取若干个阿卡波糖处理后废渣样品0.25g于15mL离心管中，加入2mL二乙胺-乙腈-水混合溶液(V:V:V＝1:3:6)后超声提取45min。样品离心后，取1mL上清液氮气吹干。加入1mL甲醇-乙腈混合液(V:V＝3:7)，离心取上清液过滤，待用。
配制0.25mg/kg、0.50mg/kg、0.75mg/kg、1.00mg/kg、1.25mg/kg、1.50mg/kg、1.75mg/kg、2.00mg/kg的标准溶液，待测。
(2)检测条件
样品经前处理后进入液质联用分析。液相色谱条件如下：色谱柱为Shim-pack GISHILIC(3μm，150*2.1mm)；流动相为：A相20mmol/L乙酸铵，B相乙腈；洗脱条件为：0-5min，B相90％，5-15min，B相90％-50％；流速0.3mL/min；柱温25℃；进样量20μL。
质谱条件如下：离子化模式为ESI电喷雾电离，正离子扫描；喷雾电压3500V；鞘气压力15psi；辅助气压力5psi；离子传输管温度275℃；雾化温度275℃；碰撞气压力1.5torr；阿卡波糖母离子为646，定量子离子为303.5，定性子离子为145.8，碰撞电压27V。
(3)样品检测
将经过前处理的样品在上述检测条件下进行LC-MS/MS检测，以标准溶液浓度——峰面积拟合曲线，计算得已处理过的阿卡波糖废渣样品中，阿卡波糖含量为0.87mg/kg。
实施例5
本实施例采用标准曲线法测定阿卡波糖原渣中阿卡波糖含量，包括以下步骤：
(1)样品前处理
准确称取若干个阿卡波糖处理后废渣样品1g于50mL离心管中，加入30mL二乙胺-乙腈-水混合溶液(V:V:V＝1:1:3)后超声提取90min。样品离心后，取20mL上清液氮气吹干。加入1mL甲醇-乙腈-水混合液(V:V:V＝4:3:3)，离心取上清液过滤，待用。
配制100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg的标准溶液，待测。
(2)检测条件
样品经前处理后进入液质联用分析。液相色谱条件如下：色谱柱为Thermo FisherASP-2Hypersil(2.1μm，150*3mm)；流动相为：A相5mmol/L乙酸铵，B相乙腈；洗脱条件为：0-5min，B相90％，5-15min，B相90％-70％；流速0.3mL/min；柱温25℃；进样量20μL。
质谱条件如下：离子化模式为ESI电喷雾电离，正离子扫描；喷雾电压3500V；鞘气压力15psi；辅助气压力5psi；离子传输管温度275℃；雾化温度275℃；碰撞气压力1.5torr；阿卡波糖母离子为646，定量子离子为303.5，定性子离子为145.8，碰撞电压27V。
(3)样品检测
将经过前处理的样品在上述检测条件下进行LC-MS/MS检测，以标准溶液浓度——峰面积拟合曲线，计算得处理后阿卡波糖原渣样品中阿卡波糖含量为218.5mg/kg。
对比例1
根据文献《高效液相色谱法测定阿卡波糖口崩片的含量》(DOI：10.3877/j.issn.2095-8242.2017.97.005)所提供的检测方法，对原渣进行检测分析，进行对比。由于文献中未提供前处理方法，前处理方法仍然采用本专利所提供的技术进行操作。再采用文献提供的仪器分析条件进行上机检测。因此，本对比例检测样品采用实施例5所制备得到的样品，采用文献提供的仪器条件进行检测。
(1)样品前处理
实施例5制备所得待测液。
(2)检测条件
液相色谱条件：氨基硅烷键合硅胶为填充剂(Welch Ultimate XB-NH2柱，250mm×4.6mm×5μm)；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾600mg与无水磷酸氢二钠279mg，加水溶解并稀释至1000ml)-乙腈(30:70)为流动相；流速为每分钟2.0ml；检测波长为210nm；柱温35℃。
(3)样品检测
将经过前处理的样品在上述检测条件下进行液相检测，以标准溶液浓度——峰面积拟合曲线，计算得处理后阿卡波糖原渣样品中阿卡波糖含量为529.7mg/kg。
对比例2
根据专利CN105572267A所提供的检测方法，对处理渣进行检测分析，进行对比。本对比例检测样品为实施例4所制备得到的样品。
(1)样品前处理
实施例4制备所得待测液。
(2)检测条件
液相色谱条件：色谱柱为XBridge Amide柱(250mm×4.6mm×5μm)；流速：1.2mL/min；检测波长为210nm；柱温为65℃；进样量为20μL；检测器采用紫外检测器；流动相乙腈-10mM乙酸铵水溶液体积比为75:25。
(3)样品检测
将经过前处理的样品在上述检测条件下进行液相检测，以标准溶液浓度——峰面积拟合曲线。但是根据CN105572267A所提供方法检测，样品浓度整体偏低，大量数据检测值低于检出限，无法精确计算含量。
综合实施例和对比例可见，本发明的优势在于废渣前处理步骤简单高效，不仅能高效提取菌渣中残留阿卡波糖，还能有效去除基质中干扰检测的物质，大大提高了检测的准确性，同时也对仪器较好的保护。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：向菌渣样品中加入提取剂后涡旋振荡，超声；
S2：对超声后的液体离心，取上清液，之后将上清液吹干，向加入净化液，涡旋振荡后，采用高效液相色谱串联质谱仪对振荡后液体进行定性、定量检测；
所述菌渣中阿卡波糖残留含量为0.1-10 mg/kg；
S1中所述提取剂为二乙胺-乙腈-水混合溶液；
所述混合溶液中二乙胺的占比10 wt % -20 wt %，乙腈占比为20 wt %-30 wt %，其余为水；
S2中所述净化液为甲醇-乙腈-水混合溶液，混合液中乙腈占比为30 wt %-70 wt %，甲醇占比为20 wt %-50 wt % ，其余为水；
S2中，样品经前处理后进入液质联用分析，
其中液相色谱条件为：采用以下色谱柱中的任意一种：（1）ACCUCORE UREA- HILIC ，色谱柱规格为2.6 μm，100*2.1mm，（2）ACE HILIC-N，色谱柱规格为3μm，150*2.1mm，（3）Shim-pack GIS HILIC ，色谱柱规格为3μm，150*2.1mm，（4）Thermo Fisher ASP-2Hypersil ，色谱柱规格为2.1μm，150*3mm，
当选用色谱柱（1）、（2）、（3）中的一种时，流动相为：A相10 mmol/L乙酸铵，B相乙腈；洗脱条件为：0-5min，B相90%，5-15min，B相90%-60%；流速0.3 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL，
当选用色谱柱（4）时，流动相为：A相5 mmol/L乙酸铵，B相乙腈；洗脱条件为：0-5min，B相90%，5-15min，B相90%-70%；流速0.3 mL/min；柱温25 ℃；进样量20 μL；
质谱条件为：离子化模式为ESI电喷雾电离，正离子扫描；喷雾电压3500V；鞘气压力15psi；辅助气压力5psi；离子传输管温度275℃；雾化温度275℃；碰撞气压力1.5 torr；阿卡波糖母离子为646，定量子离子为303.5，定性子离子为145.8，碰撞电压27V。
2.根据权利要求1所述的一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法，其特征在于，所述菌渣与提取剂的质量比为1: 5-50。
3.根据权利要求1所述的一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法，其特征在于，S1中所述超声的时间为10-120 min。
4.根据权利要求1所述的一种菌渣中阿卡波糖残留含量的检测方法，其特征在于，S2中采用阿卡波糖标准溶液的色谱峰面积作为参照，并通过受试溶液的色谱峰面积计算得到其浓度，进而计算出菌渣样品中阿卡波糖含量。
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