CN102269740A - 同时测定烟用添加剂中苯甲酸、山梨酸、水杨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时测定烟用添加剂中苯甲酸、山梨酸、水杨酸的方法。先制备6个浓度级别的苯甲酸、山梨酸和水杨酸标准工作溶液，以及待测样品溶液。然后利用超高效液相色谱仪分别对6种浓度级别的标准工作溶液和样品溶液进行检测分析。最后进行标准曲线绘制及结果计算。本发明对样品的处理方法和色谱条件进行了改进和优化，三种待测物的分离效果好，峰形好。采用三波长通道同时扫描，相比单波长同时测定在灵敏度上具有明显优势。检出限在0.01μg/mL～0.04μg/mL之间，加标回收率在97%～102%之间，平均相对标准偏差（RSD）在1.0%～4.7%之间，重复性好。具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于烟用添加剂理化检验技术领域，具体涉及一种能够同时检测烟用添加剂中所含的苯甲酸、山梨酸和水杨酸三种防腐剂含量的方法。
背景技术
防腐剂是一类化学试剂，常用于防止食品、饮料和化妆品等细菌的生长。烟用添加剂作为卷烟配方中的重要组成部分，而为了防霉变质，烟用添加剂中也会添加防腐剂，最常用的为苯甲酸、山梨酸和水杨酸，而苯甲酸、山梨酸、水杨酸均为有机酸类防腐剂，在酸性条件下具有较强的抗真菌性质。大量的毒理学试验表明：防腐剂成分用量过多会对人体肝脏产生危害，甚至致癌，因此烟用添加剂中防腐剂成分的测定对保障卷烟产品安全具有重要意义。目前化妆品、木材中的防腐剂测定报道较多，而防腐剂的测定方法多采用薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法（GC）等，尚未见采用UPLC同时测定烟用添加剂中多种防腐剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能够同时测定烟用添加剂中所含的苯甲酸、山梨酸和水杨酸含量的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
一种同时测定烟用添加剂中苯甲酸、山梨酸、水杨酸的方法，包括以下步骤：
（1）标准工作溶液制备：称取苯甲酸、山梨酸和水杨酸各10mg～250mg的，置于100mL容量瓶中混合，用甲醇溶解并定容到刻度，得到标准储备液；分别移取20μL、100μL、500μL、2000μL、5000μL 和10000μL的标准储备液于100 mL的容量瓶中，分别用甲醇溶解混匀并定容到刻度，得到6个浓度级别的标准工作溶液；
（2）样品溶液的制备：称取0.300～1.00g待测烟用添加剂样品，用甲醇超声萃取后，离心，滤膜过滤，滤液即为样品溶液；
（3）超高效液相色谱分析：利用超高效液相色谱仪分别对6种浓度级别的标准工作溶液和样品溶液进行检测分析；
（4）标准曲线绘制及结果计算。
所述样品溶液制备具体为：准确称取0.300～1.00g样品于具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声萃取20min，转移至离心管中，8500r/min离心10min，取上层清液经0.2μm滤膜过滤，滤液即为样品溶液。
所述的超高效液相色谱分析，其色谱条件为采用ACOUITY UPLC ? BEH C18 1.7μm 2.1×100mm柱；流动相甲醇（A）和0.02mol/L乙酸铵，0.02mol/L乙酸铵需调节pH至3.4；等度洗脱程序：0～10min 35% A；流速0.2mL/min进样量2μL；采用三波长通道同时扫描，其中苯甲酸检测波长采用228nm，山梨酸检测波长采用260nm，水杨酸检测波长采用300nm。
所述的标准曲线绘制及结果计算具体为：以苯甲酸、山梨酸、水杨酸的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归分析，得到标准曲线；将相同条件下测得样品溶液的苯甲酸、山梨酸、水杨酸的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸的含量。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
（1）本发明对样品的处理方法和色谱条件进行了改进和优化，采用pH值条件为3.4的0.02mol/L乙酸铵-甲醇作为流动相，使基线平稳，三种待测物的分离效果好，峰形好。
（2）采用三波长通道同时扫描，其中苯甲酸检测波长采用228nm，山梨酸检测波长采用260nm，水杨酸检测波长采用300nm，均能获得很好的灵敏度，相比单波长同时测定在灵敏度上具有明显优势。
（3）采用超高效液相色谱（UPLC），相比高效液相色谱（HPLC）大颗粒填料柱而言，UPLC的小颗粒填料在得到同样分析效率的基础上，极大减少了分析时间，均在5.0min内完成分析，且流动相消耗量仅为高效液相色谱的20%。
（4）本发明方法所采用的色谱条件使3种目标化合物色谱峰分离度都较好，并均具有较好的线性相关性，检出限在0.01μg/mL～0.04μg/mL之间。
（5）本发明的加标回收率在97%～102%之间，平均相对标准偏差（RSD）在1.0%～4.7%之间，说明本方法的回收率高，重复性好。
附图说明
图1为本发明测定的方法的流程图；
图2为标准工作溶液的色谱分析图；
图3为样品溶液的色谱分析图；
图4为苯甲酸标准曲线图；
图5为山梨酸标准曲线图；
图6为水杨酸标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明的限定。
实施例1
测定烟用添加剂26588和15025中苯甲酸、山梨酸和水杨酸的含量（测定方法流程如图1所示）；
1、标准工作溶液的制备
（1）混合标准储备液Ⅰ：分别称取200.0mg的苯甲酸、山梨酸、水杨酸于100mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，混合得到混合标准储备液Ⅰ，其中各组分的浓度分别为2.0mg/mL；混合标准储备液Ⅰ在4℃冰箱内密封存放，有效期为3个月；
（2）标准工作溶液：分别移取20μL、100μL 、500μL 、2000μL 、5000μL 和10000μL的混合标准储备液于100 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度并混匀，得到6个浓度级别的标准工作溶液，标准溶液现配现用；
2、样品溶液及空白溶液的制备
（1）样品溶液制备：准确称取0.500 g样品于具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声萃取20min，转移至离心管中，8500r/min离心10min，经0.2μm滤膜过滤，滤液即为样品溶液供超高效液相色谱测定用；
（2）空白溶液制备：具塞锥形瓶不加样品，其他处理步骤同样品溶液制备；
3、色谱分析
分别取标准工作溶液和样品溶液进行色谱分析，其色谱条件：用ACOUITY UPLC? BEH C18 1.7μm 2.1×100mm柱；流动相甲醇（A）和0.02mol/L乙酸铵，0.02mol/L乙酸铵需调节pH至3.4；等度洗脱程序：0～10min 35% A；流速0.2mL/min进样量2μL；采用三波长通道同时扫描，其中苯甲酸检测波长采用228nm，山梨酸检测波长采用260nm，水杨酸检测波长采用300nm，柱温箱温度：30℃，标准工作溶液和样品溶液色谱分析结果分别如图2、图3所示。
4、标准曲线绘制及结果计算
首先以3种目标化合物的色谱峰面积对其浓度进行回归分析，苯甲酸、山梨酸和水杨酸的标准工作曲线结果分别如图4、图5、图6所示，取最低浓度工作标准溶液，做六次平行试验，计算标准偏差，3倍标准偏差为检出限，10倍标准偏差为定量检测限，结果如表1所示；
表1 烟用添加剂苯甲酸、山梨酸、水杨酸的标准曲线和检测限
然后将测得3种目标化合物的色谱峰面积，代入所绘制的标准曲线，得到样品中3种目标化合物的浓度，计算公式如下
X—试样中苯甲酸、山梨酸、水杨酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C—由标准曲线得出的苯甲酸、山梨酸、水杨酸浓度，单位为毫克每升（μg/mL）；
V—萃取液体积，单位为毫升（mL）；
m—试料质量，单位为克（g）；
具体检测结果如表2、表3所示。
表2 烟用添加剂26588中苯甲酸、山梨酸、水杨酸含量检测结果
| 化合物 | 含量（mg/kg） |
| 苯甲酸 | 971.84 |
| 山梨酸 | 6.46 |
| 水杨酸 | 3501.09 |
表3烟用添加剂15025中苯甲酸、山梨酸、水杨酸含量检测结果
| 化合物 | 含量（mg/kg） |
| 苯甲酸 | / |
| 山梨酸 | 24.76 |
| 水杨酸 | 87.86 |
实施例2
本实施例对本发明方法的重复性和加标回收率进行检测。
1、按照实施例1中样品溶液及空白溶液制备，色谱分析条件以及样品处理结果，样品平行测定8次，苯甲酸、山梨酸、水杨酸的重复性结果如表4所示
表4烟用添加剂样品26588中苯甲酸、山梨酸、水杨酸含量重复性结果
2、分别在样品中加入3个梯度标准溶液，色谱分析条件同实施例1的色谱分析条件，根据分析结果计算本方法烟用添加剂中苯甲酸、山梨酸、水杨酸加标回收率结果如表5所示。
表5 烟用添加剂加标回收率结果
| 化合物 | 平均回收率(%) |
| 苯甲酸 | 97.57 |
| 山梨酸 | 99.19 |
| 水杨酸 | 101.86 |
由表4、表5可知，3种目标化合物平均相对标准偏差在1.0%～4.6%之间，回收率在97%～102%之间，说明本方法精密度好、回收率高。
本实施例所用标准溶液仅以其中的一个浓度值为例进行说明的，其他所配制的标准溶液经色谱分析所获得的标准曲线及回归方程与上述实施例中相同，仅散点图与散点的位置不同，并且也不影响样品的测定结果，在此不再一一列举。所举实施例只是为了更好的理解本发明方法啊，并不具有任何限制作用，即上述方法或者等用于上述情况的地方均包含在本发明的技术方案保护范围。
Claims (4)
1.一种同时测定烟用添加剂中苯甲酸、山梨酸、水杨酸的方法，包括以下步骤：
（1）标准工作溶液制备：称取苯甲酸、山梨酸和水杨酸各10mg～250mg的，置于100mL容量瓶中混合，用甲醇溶解并定容到刻度，得到标准储备液；分别移取20μL、100μL、500μL、2000μL、5000μL 和10000μL的标准储备液于100 mL的容量瓶中，分别用甲醇溶解混匀并定容到刻度，得到6个浓度级别的标准工作溶液；
（2）样品溶液的制备：称取0.300～1.00g待测烟用添加剂样品，用甲醇超声萃取后，离心，滤膜过滤，滤液即为样品溶液；
（3）超高效液相色谱分析：利用超高效液相色谱仪分别对6种浓度级别的标准工作溶液和样品溶液进行检测分析；
（4）标准曲线绘制及结果计算。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的样品溶液制备具体为：准确称取0.300～1.00g样品于具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声萃取20min，转移至离心管中，8500r/min离心10min，取上层清液经0.2μm滤膜过滤，滤液即为样品溶液。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱分析，其色谱条件为：采用ACOUITY UPLC ? BEH C18 1.7μm 2.1×100mm柱；流动相甲醇A和0.02mol/L乙酸铵，0.02mol/L乙酸铵需调节pH至3.4；等度洗脱程序：0～10min 35% A；流速0.2mL/min进样量2μL；采用三波长通道同时扫描，其中苯甲酸检测波长采用228nm，山梨酸检测波长采用260nm，水杨酸检测波长采用300nm。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的标准曲线绘制及结果计算具体为：以苯甲酸、山梨酸、水杨酸的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归分析，得到标准曲线；将相同条件下测得样品溶液的苯甲酸、山梨酸、水杨酸的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中苯甲酸、山梨酸、水杨酸的含量。
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