CN104792891A

CN104792891A - 一种r构型利伐沙班中间体的检测方法

Info

Publication number: CN104792891A
Application number: CN201510161013.1A
Authority: CN
Inventors: 巫尔玉; 孙毅; 魏农农
Original assignee: CHENGDU BAIYU TECHNOLOGY PHARMACEUTICAL CO LTD
Current assignee: CHENGDU BAIYU TECHNOLOGY PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2035-04-07
Also published as: CN104792891B

Abstract

本发明公开了一种式Ⅰ所示的R构型利伐沙班中间体的检测方法，它包括以下步骤：(1)取供试品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液；(2)取步骤(1)的供试品溶液用高效液相色谱进行检测，检测条件为：检测波长：200～250nm；固定相：表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶；流动相：乙腈-水。该方法可以简便、快速、精确地检测出R构型利伐沙班中间体的含量，从而能有效控制利伐沙班的产品质量，提高了药物的安全性。

Description

一种R构型利伐沙班中间体的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种R构型利伐沙班中间体的检测方法。

背景技术

利伐沙班(Rivaroxaban)是一种新的口服抗凝药物，具有高度选择性和竞争性，能直接抑制呈游离状态的Xa因子以及凝血酶原活性，具有生物利用度高，量效关系稳定，口服方便，出血风险低的特点。

利伐沙班光学异构体分为S构型和R构型，临床研究显示，利伐沙班S构型异构体的半数抑制浓度(IC50)比R构型小，即R构型异构体的药效比S构型差。

利伐沙班的合成路线包括以下步骤：

其中一个利伐沙班中间体为2-[[(5S)-2-氧代-3-[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]-1，3-噁唑烷-5-基]-甲基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮，其主要构型为S构型。

但是，通常在利伐沙班中间体中，也会存在着少量的R构型利伐沙班中间体。R构型利伐沙班中间体含量直接关系到成品的R构型异构体含量，因此对R构型利伐沙班中间体含量控制是极其重要的。为保证药品的质量及其安全性，需建立检测方法对R构型利伐沙班中间体含量进行控制。目前，对于该R构型利伐沙班中间体的检测，未见相关报道。因此，探寻一种R构型利伐沙班中间体的检测方法是亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种R构型利伐沙班中间体的检测方法，该方法可以简便、快速、精确地检测出R构型利伐沙班中间体的含量，从而能有效控制利伐沙班的产品质量，提高了药物的安全性。

本发明提供了一种如式Ⅰ所示的R构型利伐沙班中间体的检测方法，它包括以下步骤：

(1)取供试品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液；

(2)取步骤(1)的供试品溶液用高效液相色谱进行检测，检测条件为：

检测波长：200～250nm；

固定相：表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶；流动相：乙腈-水。

进一步优选地，所述检测方法是定量检测方法，步骤如下：

a、取供试品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液；

b、取R构型利伐沙班中间体对照品，加入溶剂溶解，作为对照品溶液；

c、取步骤a的供试品溶液和步骤b的对照品溶液，分别用高效液相色谱进行检测，检测条件为：

检测波长：200～250nm；

固定相：表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶；

流动相：乙腈-水。

d、绘制标准曲线，计算供试品中R构型利伐沙班中间体的含量。

进一步优选地，所述溶剂为流动相。

进一步优选地，在步骤a中，所述溶剂与样品的体积重量比为1-50mL/mg。

进一步优选地，在步骤a中，所述溶剂与样品的体积重量比为5mL/mg。

进一步优选地，所述检测波长为220nm。

进一步优选地，所述检测的柱温为10-40℃；流速为0.5-1.5mL/min。

进一步优选地，所述检测的柱温为30℃；流速为1.0mL/min。

进一步优选地，在所述的流动相中，乙腈的体积分数为20-50％。

进一步优选地，所述乙腈的体积分数为30％。

高效液相色谱是检测领域常用的检测方法，但是由于R构型利伐沙班中间体的和S构型的利伐沙班中间体互为对映异构体，结构相似，两者互为干扰，难以通过高效液相色谱进行检测。同时，R构型利伐沙班中间体在利伐沙班中间体中的含量很低，检测难度也较大。

本发明通过选择特定的高效液相色谱检测条件，达到了准确检测R构型利伐沙班中间体含量的效果，并且，本发明方法快速简便，专属性强，准确度高，精密度好，可重复性强，稳定性好，检出限低，可用于利伐沙班合成过程中的质量控制，提高了药物的安全性。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1和图2为实施例1中，本发明流动相中乙腈体积分数的筛选试验色谱图；

图3和图4为实施例2中，本发明流速的筛选试验色谱图；

图5和图6为实施例3中，本发明柱温的筛选试验色谱图；

图7和图8为实施例4中，本发明检测波长的筛选试验色谱图；

图9为试验例2中，本发明系统适用性和专属性试验色谱图；

图10为试验例3中，本发明的标准曲线图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。具体如下：

利伐沙班中间体及R构型利伐沙班中间体可以通过购买获得，例如：上海同昌生物医药科技有限公司等生产厂家的市售产品，并经过检测确证其结构。

紫外可见分光光度计：UV-2600，日本岛津公司；

高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-20A检测器，工作站LCLabsolution，日本岛津公司；

表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶：大赛璐药物手性技术上海有限公司。

实验例1本发明流动相中乙腈体积分数的筛选

(1)检测条件：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比20：80或50：50；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃。

(2)试验材料准备：

供试品溶液制备：精密称取供试品约10mg，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

对照品溶液制备：精密称取R构型利伐沙班中间体对照品约10mg，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；

系统适用性溶液制备：取对照品贮备液和供试品溶液各1.0mL，置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性测定溶液。

(3)测定：取系统适用性测定溶液20μL注入液相色谱仪。

其中，当乙腈-水流动相中乙腈的体积分数为20％时，如图1所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为13.929min，与S构型异构体的分离度为3.141；乙腈-水流动相中乙腈的体积分数为50％时，如图2所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为6.245min，与S构型异构体的分离度为2.204。证明本发明的检测方法的乙腈-水流动相中，当乙腈的体积分数为20-50％时，均能在较短的时间内将R构型利伐沙班中间体与S构型异构体有效分离并检测。

实施例2本发明流速的筛选

(1)检测条件：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：0.5mL/min或1.5mL/min；

柱温：30℃。

(2)试验材料准备：

(3)测定：取系统适用性测定溶液20μL注入液相色谱仪。

其中，流动相的流速为0.5mL/min时，如图3所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为11.595min，与S构型异构体的分离度为2.819；流动相的流速为1.5mL/min时，如图4所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为8.138min，与S构型异构体的分离度为2.521。证明本发明的检测方法的乙腈-水流动相中，流动相的流速为0.5-1.5mL/min时，均能在较短的时间内将R构型利伐沙班中间体与S构型异构体有效分离并检测。

实施例3本发明柱温的筛选

(1)检测条件：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：10℃或40℃。

(2)试验材料准备：

(3)测定：取系统适用性测定溶液20μL注入液相色谱仪。

其中，柱温为10℃时，如图5所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为10.494min，与S构型异构体的分离度为2.794；柱温为40℃时，如图6所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为8.815min，与S构型异构体的分离度为2.656。证明本发明的检测方法的柱温为10-40℃时，均能在较短的时间内将R构型利伐沙班中间体与S构型异构体有效分离并检测。

实施例4本发明检测波长的筛选

(1)检测条件：

检测波长：200nm或250nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃。

(2)试验材料准备：

(4)测定：取系统适用性测定溶液20μL注入液相色谱仪。

其中，检测波长为200nm时，如图7所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为9.581min，与S构型异构体的分离度为2.695；检测波长为250nm时，如图8所示，R构型利伐沙班中间体的保留时间为9.690min，与S构型异构体的分离度为2.766。证明本发明的检测方法在检测波长200-250nm的范围内，均能在较短的时间内将R构型利伐沙班中间体与S构型异构体有效分离并检测。

实施例5本发明定性检测方法

(1)称取供试品10mg，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

(2)取步骤(1)的供试品溶液用高效液相色谱进行检测，进样量为20μL，检测条件为：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃。

实施例6本发明定量检测方法

(2)取R构型利伐沙班中间体对照品10mg，置50mL量瓶中，加流动相制成浓度分别为0.0417、0.1042、0.2084、0.4168、1.0420、2.0840、8.3360μg/mL的系列对照品溶液；

(3)分别取供试品溶液和对照品溶液用高效液相色谱进行检测，进样量为20μL，检测条件为：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃。

(4)制作R构型利伐沙班中间体浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算出供试品中R构型利伐沙班中间体的含量为0.02％。

为进一步说明本发明方法的有益效果，本发明提供以下试验例。

试验例1固定相选择

通过测定本发明利伐沙班中间体在不同溶剂中的溶解性试验确定本发明的固定相。

如表1所示，取利伐沙班中间体约5mg，加溶剂25mL，室温超声处理10分钟和/或水浴加热30分钟。

表1伐沙班中间体的溶解性测定

表1的结果显示利伐沙班中间体在乙腈和50％乙腈中均能被溶解。证明本发明利伐沙班中间体选择乙腈-水为流动相具有良好的溶解性能，并且其溶解性表明，本发明选择的固定相——表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶适于该利伐沙班中间体的对映体进行反向色谱分离并检测。

试验例2系统适用性和专属性试验

(1)检测条件：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃。

(2)试验材料准备：

(3)测定：取系统适用性测定溶液20μL注入液相色谱仪，结果如图9所示。

试验结果显示，R构型利伐沙班中间体出峰时间为10.440min，与S构型异构体分离度为2.713，对映异构体之间互不干扰，也无其他杂质干扰，证明本发明的方法分离度好，无其他干扰，且出峰时间短，检测效率高。

试验例3标准曲线和线性范围

(1)试验方法：如表2所示，取对照品贮备液适量，加流动相制成不同浓度的系列对照品溶液。精密量取各浓度对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，按照试验例2的检测条件检测，记录色谱图。

(2)实验结果如表2和图10所示。

表2标准曲线绘制

证明按照本发明的方法，R构型利伐沙班中间体在0.04-8μg/mL浓度范围内线性关系极佳，线性范围广，准确度高。

试验例4稳定性试验

1对照品溶液稳定性

(1)试验方法：取试验例3试验项下浓度为0.2084μg/mL的对照品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h精密量取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，按照试验例2的检测条件检测，记录色谱图。

(2)结果如表3所示：

表3对照品溶液稳定性试验

时间	0h	2h	4h	6h	8h	平均	RSD(％)
								峰面积	26033	26805	26626	26699	26347	26520	1.14

对照品溶液中的R构型利伐沙班中间体在8h内不降解，证明按照本发明的方法，R构型利伐沙班中间体对照品溶液稳定性高。

2供试品溶液稳定性

(1)试验方法：取供试品10.08mg，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别于0h、2h、4h、6h、8h精密量取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，按照试验例2的检测条件检测，记录色谱图。

(2)结果如表4所示：

表4供试品溶液稳定性试验

供试品溶液中的R构型利伐沙班中间体和S构型利伐沙班中间体在8h内均不降解，证明按照本发明的方法，供试品溶液稳定性高。

试验例5精密度试验

(1)试验方法：取试验例3试验项下浓度为0.2084μg/mL的对照品溶液，分别连续进样6次，按照试验例2的检测条件检测，记录色谱图。

(2)结果如表5所示：

表5精密度试验

进样次数	1	2	3	4	5	6	平均	RSD(％)
									峰面积	26233	26547	26369	26389	26201	26155	26332.2	0.60

RSD为0.60％，证明本发明方法的精密度极佳。

试验例6重复性试验

(1)试验过程及结果：

对照：同试验例5试验项下，取其平均峰面积作为对照峰面积。

供试品溶液：精密称取20140312批供试品6份，每份约10mg，置50mL量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，作为供试品溶液。

测定：精密量取供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按照试验例2的检测条件检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

计算公式：

式中：

A_样：指供试品溶液中对映体峰的峰面积；

A_对：指对照品溶液主峰面积；

C_对：指对照品溶液的浓度(单位：μg/mL)；

C_样：指供试品溶液的浓度(单位：mg/mL)。

(2)结果如表6所示：

表6重复性试验

RSD值为0.73％，证明本发明的方法重复性极好。

试验例7回收率试验

(1)检测条件：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃。

(2)试验材料准备：

对照品溶液制备：取R构型利伐沙班中间体对照品约10mg，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取取1.0mL置100mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取适量，定量稀释制成每1mL中约含0.2μg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液：取50mL量瓶9个，编号1～9。精密称取供试品9份，每份约10mg，分别置以上50mL量瓶中。1、2、3号分别加上述对照品贮备液4.0mL，加流动相稀释至刻度，摇匀；4、5、6号分别加上述对照品贮备液5.0mL，加流动相稀释至刻度，摇匀；7、8、9号分别加上述对照品贮备液6.0mL，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；作为供试品溶液。

(3)测定：精密吸取对照品及供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量和回收率，结果如表7所示。

回收率计算公式：

式中：

A_样：指供试品溶液中对映体峰的峰面积；

A_对：指对照品溶液主峰面积；

C_对：指对照品溶液的浓度(μg/mL)；

V_加入：指供试品溶液中加入的对照品贮备液体积(单位：mL)；

C_贮备液：指对照品贮备液的浓度(单位：μg/mL)；

M_样：指供试品的称样量(mg)。

表7对映体回收率结果

试验结果显示，本发明的检测方法，平均回收率均大于99％，说明本发明的方法准确度好。

试验例7定量限、检测限测定

(1)检测条件：

检测波长：220nm；

流动相：乙腈-水，体积比30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃。

(2)试验材料处理：

取试验例3试验项下最低浓度的溶液(0.0417μg/mL)，以流动相稀释，基线噪音:样品峰高(1:10)，作为定量限测定溶液，基线噪音:样品峰高(1:3)，作为检测限测定溶液。

(3)测定：精密量取定量限和检测限测定溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。经计算，定量限为：0.2501ng，检测限为：0.075ng。

综上所述，本发明通过选择特定的高效液相色谱检测条件，达到了准确检测利伐沙班中间体的R构型含量的效果，并且，本发明方法快速简便，专属性强，准确度高，精密度好，可重复性强，稳定性好，检出限低，可用于利伐沙班合成过程中的质量控制，提高了药物的安全性。

Claims

1.一种如式Ⅰ所示的R构型利伐沙班中间体的检测方法，它包括以下步骤：

(1)取供试品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液；

检测波长：200～250nm；

流动相：乙腈-水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测方法是定量检测方法，步骤如下：

a、取供试品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液；

检测波长：200～250nm；

流动相：乙腈-水。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述溶剂为流动相。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：在步骤a中，所述溶剂与样品的体积重量比为1-50mL/mg。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：在步骤a中，所述溶剂与样品的体积重量比为5mL/mg。

6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述检测波长为220nm。

7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述检测的柱温为10-40℃；流速为0.5-1.5mL/min。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述检测的柱温为30℃；流速为1.0mL/min。

9.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：在所述的流动相中，乙腈的体积分数为20-50％。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述乙腈的体积分数为30％。