CN104730165B - 一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法，它包括以下步骤：a、制备供试品溶液；b、制备对照品溶液；c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：色谱柱的固定相为表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶；流动相为乙腈-水；流速为0.5ml/min～1.5ml/min；柱温为10℃～40℃；检测波长为200nm～300nm。本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度在3.0以上，理论塔板数高，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短、成本低、操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法。
背景技术
利伐沙班(Rivaroxaban)，分子式：C19H18ClN3O5S，化学名为5-氯-氮-({(5S)-2-氧-3-[4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-1,3-唑烷-5-基}甲基)-2-噻吩-羧酰胺，其化学结构如式A所示；利伐沙班是一种新的口服抗凝药物，目前已批准上市的利伐沙班药品有拜耳医药保健股份公司生产的利伐沙班片(商品名称：拜瑞妥)。
利伐沙班R异构体是利伐沙班(即利伐沙班S异构体)的光学异构体(对映异构体)，在利伐沙班的制备等过程中会不可避免地同时存在利伐沙班R异构体；但是，临床研究显示利伐沙班R异构体的药效比利伐沙班S异构体要差很多；因此，检测利伐沙班R异构体的含量对于利伐沙班的质量和药效控制具有非常重要的意义。
在高效液相色谱领域，分离度、分析时间等是影响分析、检测的重要影响因素。通常，色谱柱的长度越长，其价格越贵，对不同物质的分离效果也越好，从而分析、检测的准确性也更好。
目前，现有技术中均是采用长度较长、价格较贵的色谱柱来分析检测利伐沙班中异构体的含量；例如：中国专利CN103217492A公开了一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，它是采用长度为250mm的IC色谱柱分离测定利伐沙班S异构体和R异构体，该方法由于色谱峰峰宽值大而导致利伐沙班S异构体和R异构体的分离度小，且同时存在分析时间长的问题(分析时间长达17分钟以上)，如果缩短保留时间(即缩短分析时间)将会导致利伐沙班S异构体和R异构体的分离度更小(参见CN103217492A说明书附图的图3)；张倩如(张倩如，张琪，郭小丰，郭文敏.HPLC法测定利伐沙班中对映异构体的含量.中国药师，2014年，第17卷，第10期：1629-1631.)和SusanneRoehrig(SusanneRoehrig，AlexanderStraub，etal.DiscoveryoftheNovelAntithromboticAgent5-Chloro-N-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)thiophene-2-carboxamide(BAY59-7939):AnOral,DirectFactorXaInhibitor.J.Med.Chem.，2005，48(19)：5900-5908.)也都是采用长度为250mm的色谱柱测定利伐沙班异构体的含量，同样也都存在利伐沙班S异构体和R异构体的分离度小、分析时间长等问题。
因此，需要寻找一种分离度高、分析时间短、成本低的检测利伐沙班的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法，它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：取利伐沙班，用流动相或乙腈溶解，制成浓度为0.05mg/ml～1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
b、制备对照品溶液：取利伐沙班R异构体，用流动相或乙腈溶解，制成浓度为0.04μg/ml～10μg/ml的溶液，作为对照品溶液；
c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱的固定相为表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶；
流动相为乙腈-水，乙腈与水的体积比为20％：80％～70％：30％；
流速为0.5ml/min～1.5ml/min；
柱温为10℃～40℃；
检测波长为200nm～300nm。
优选的，步骤a中，供试品溶液的浓度为0.2mg/ml。
优选的，步骤c中，色谱柱的规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm。
优选的，步骤c中，色谱柱为AS-RH。
优选的，步骤c中，乙腈与水的体积比为20％：80％～60％：40％。
优选的，步骤c中，乙腈与水的体积比为40％：60％～60％：40％；优选的，乙腈与水的体积比为50％：50％。
优选的，步骤c中，流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
优选的，步骤c中，流速为1.0ml/min。
优选的，步骤c中，柱温为25℃～35℃。
优选的，步骤c中，检测波长为250nm。
优选的，步骤c中，进样量为20μl。
优选的，步骤c中，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量。
本发明利伐沙班的高效液相色谱检测方法，具有以下优点：
(1)本发明采用长度为150mm的色谱柱，就能达到比现有技术更高的分离度，利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度在3.0以上，特别是流动相为乙腈-水(20％：80％，体积比)时，利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度在6.0以上，理论塔板数高，色谱峰的峰形尖锐、对称，而且本发明长度较短的色谱柱其价格也比较便宜；
(2)本发明在流动相为乙腈-水(40％：60％～60％：40％，体积比)时，既可以保证利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度在3.0以上，又可以使利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在5分钟以内，同时具有分离度高、分析时间短等优点；
(3)本发明采用流动相溶解利伐沙班，其溶解度更大、溶解速度更快，可以有效地避免检测过程中析出固体而导致色谱柱以及色谱系统的堵塞，使得检测结果准确可靠，其操作也更简便。
本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度在3.0以上，理论塔板数高，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短、成本低、操作简便等优点，且符合检测方法的方法验证要求。
分离度，等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标，本领域技术人员可以根据《中国药典2010年版》附录ⅤD给出分离度通常具有的定义、解释等。在高效液相色谱领域中，无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1、实施例1条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果图；
图2、实施例2条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果图；
图3、实施例3条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果图；
图4、实施例4条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果图；
图5、实施例5条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果图；
图6、实施例6条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果图；
图7、实施例7条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果图；
图8、本发明检测方法的线性关系。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的供试品、对照品、设备均为已知产品。
利伐沙班、利伐沙班R异构体，可以通过购买获得，例如：上海同昌生物医药科技有限公司等生产厂家的市售产品，并经过检测确证其结构。
高效液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-20A检测器，工作站为LCLabsolution，日本岛津公司；色谱柱：AS-RH(4.6mm×150mm5μm)，大赛璐药物手性技术上海有限公司。
实施例1
利伐沙班的高效液相色谱检测方法：
(1)制备供试品溶液：精密称取利伐沙班10mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
制备对照品溶液：取利伐沙班R异构体10mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取适量，定量稀释制成每1ml中含0.2μg的溶液，作为对照品溶液；
制备系统适用性试验溶液：取利伐沙班10mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得到利伐沙班溶液；取对照品贮备液0.25ml，置于25ml量瓶中，用上述利伐沙班溶液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液；
(2)高效液相色谱的检测条件为：
色谱柱：AS-RH(4.6mm×150mm5μm)，固定相为表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶；
流动相：乙腈-水(50％：50％，体积比)；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
检测波长：250nm；
按照上述检测条件，取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1和表1；取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量为0.02％。
计算公式：
式中：
A样：指供试品溶液中对映体峰的峰面积；
A对：指对照品溶液主峰面积；
C对：指对照品溶液的浓度(单位：μg/ml)；
C样：指供试品溶液的浓度(单位：mg/ml)。
表1、实施例1条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果
结果表明，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度为3.712，理论塔板/米大于16600，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在5分钟以内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例2
除检测条件中改变流动相为乙腈-水(40％：60％，体积比)外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2和表2；取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量为0.02％。
表2、实施例2条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果
结果表明，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度为4.284，理论塔板/米大于16700，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在5分钟以内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例3
除检测条件中改变流动相为乙腈-水(60％：40％，体积比)外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图3和表3；取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量为0.02％。
表3、实施例3条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果
结果表明，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度为3.095，理论塔板/米大于17500，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在5分钟以内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例4
除检测条件中改变流动相为乙腈-水(20％：80％，体积比)外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4和表4；取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量为0.02％。
表4、实施例4条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果
结果表明，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度为6.008，理论塔板/米大于18200，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在15分钟以内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例5
除检测条件中改变流速为0.8ml/min外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5和表5；取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量为0.02％。
表5、实施例5条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果
结果表明，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度为3.824，理论塔板/米大于21500，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在5分钟以内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例6
除检测条件中改变流速为1.2ml/min外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图6和表6；取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量为0.02％。
表6、实施例6条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果
结果表明，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度为3.309，理论塔板/米大于14700，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在5分钟以内，具有分析时间短、成本低等优点。
实施例7
除检测条件中改变柱温为35℃外，其他步骤、条件均与实施例1相同。
按照上述检测条件，取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图7和表7；取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量为0.02％。
表7、实施例7条件下对利伐沙班对映异构体的分离效果
结果表明，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度为3.549，理论塔板/米大于17900，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的保留时间均在5分钟以内，具有分析时间短、成本低等优点。
综上所述，本发明检测方法利伐沙班与利伐沙班R异构体的分离度在3.0以上，理论塔板数高，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短、成本低、操作简便等优点。
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1
1、线性关系
(1)分别取对照品贮备液(与实施例1相同)适量，加流动相制成浓度为0.04μg/ml～10μg/ml的系列对照品溶液；
(2)按照实施例1的检测条件对上述对照品溶液进行检测，记录色谱图，以利伐沙班R异构体的浓度对相应的峰面积进行线性回归，线性方程：Y＝60594X+191.88，相关系数r＝1，如图8所示。
试验结果表明，本发明检测方法的条件下，利伐沙班R异构体的浓度与峰面积线性关系良好。
2、稳定性试验
(1)对照品溶液
按照实施例1的检测条件，分别于0h、2h、4h、6h、8h精密量取浓度为0.2032μg/ml的对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表8。
表8、对照品溶液的稳定性试验结果
| 时间 | 0h | 2h | 4h | 6h | 8h | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 12654 | 12493 | 12952 | 12813 | 13004 | 12783.2 | 1.66 |
(2)供试品溶液
取利伐沙班10.08mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，按照实施例1的检测条件，分别于0h、2h、4h、6h、8h精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表9。
表9、供试品溶液的稳定性试验结果
试验结果表明，本发明检测方法在利伐沙班检测过程中对照品溶液和供试品溶液的稳定性好。
3、精密度试验
(1)精密度试验
取浓度为0.2032μg/ml的对照品溶液，按照实施例1的检测条件，分别连续进样6次，记录色谱图，结果见表10。
表10、精密度试验结果
| 进样次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 12887 | 12807 | 12824 | 12829 | 12780 | 12834 | 12814.8 | 0.2 |
(2)线性最低浓度的精密度试验
取线性最低浓度为0.0406μg/ml的对照品溶液，按照实施例1的检测条件，分别连续进样6次，记录色谱图，结果见表11。
表11、线性最低浓度的精密度试验结果
| 进样次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 2586 | 2547 | 2559 | 2649 | 2601 | 2562 | 2583.6 | 1.6 |
| 保留时间 | 3.920 | 3.915 | 3.918 | 3.921 | 3.919 | 3.919 | 3.919 | 0.05 |
试验结果表明，本发明检测方法对利伐沙班对映异构体检测的精密度好。
4、定量限与检测限试验
线性关系试验中最低浓度的对照品溶液主峰高为222μv，基线噪音约为5μv，信噪比约为44：1，根据定量限(信噪比应为10：1)、检测限要求(信噪比应为3：1)取浓度为0.04μg/ml的对照品溶液，稀释4倍，作为定量限测定溶液；取定量限测定溶液3.0ml，置于10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为检测限测定溶液；
精密量取定量限测定溶液、检测限测定溶液各20μl，按照实施例1的检测条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
利伐沙班R异构体的定量限、检测限分别为：
试验结果表明，本发明检测方法对利伐沙班对映异构体检测的定量限和检测限低。
5、重复性试验
制备供试品溶液：精密称取6份利伐沙班，每份为10mg，置于50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照品溶液：同精密度试验(浓度为0.2032μg/ml)，取其平均峰面积作为对照峰面积；
检测：量取供试品溶液各20μl，按照实施例1的检测条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量，结果见表12。
表12、重复性试验结果
试验结果表明，本发明检测方法的重复性好，符合检测方法的方法验证要求。
6、回收率试验
对照品溶液：同精密度试验，取其平均峰面积作为对照峰面积；
供试品溶液：精密称取利伐沙班9份，每份10mg，分别置于编号分别为1～9的50ml量瓶中；1、2、3号分别加“对映体线性”试验项下4.0647μg/ml的溶液2.0ml，加流动相稀释至刻度，摇匀；4、5、6号分别加“线性关系”试验项下4.0647μg/ml的溶液2.5ml，加流动相稀释至刻度，摇匀；7、8、9号分别加“线性关系”试验项下4.0647μg/ml的溶液3.0ml，加流动相稀释至刻度，摇匀；作为供试品溶液。
检测：量取供试品溶液、加样后的供试品溶液各20μl，按照实施例1的检测条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按以下公式计算回收率，回收率结果见表13。
式中：
A样：指供试品溶液中对映体峰的峰面积；
A对：指对照品溶液主峰面积；
C对：指对照品溶液的浓度(0.2032μg/ml)；
V加入：指供试品溶液中加入的浓度为4.0647μg/ml的对照品溶液(单位：ml)；
表13、回收率试验结果
试验结果表明，本发明检测方法的回收率好，检测结果准确可靠。
本发明检测方法的线性关系好、稳定性好、精密度好、定量限低、检测限低、重复性好、回收率好，检测结果准确可靠；同时，具有易操作、省时节能等优点。
Claims (11)
1.一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：取利伐沙班，用流动相或乙腈溶解，制成浓度为0.05mg/ml～1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
b、制备对照品溶液：取利伐沙班R异构体，用流动相或乙腈溶解，制成浓度为0.04μg/ml～10μg/ml的溶液，作为对照品溶液；
c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：
色谱柱的固定相为表面涂敷有直链淀粉-三[(S)-ɑ-甲苯基氨基甲酸酯]的硅胶；
流动相为乙腈-水，乙腈与水的体积比为20％：80％～70％：30％；
流速为0.5ml/min～1.5ml/min；
柱温为10℃～40℃；
检测波长为200nm～300nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中，供试品溶液的浓度为0.2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱的规格为：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm。
4.根据权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱为
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，乙腈与水的体积比为20％：80％～60％：40％。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，乙腈与水的体积比为40％：60％～60％：40％。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，乙腈与水的体积比为50％：50％。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，流速为1.0ml/min。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，柱温为25℃～35℃，检测波长为250nm，进样量为20μl。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，按外标法以峰面积计算供试品中利伐沙班R异构体的含量。
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