CN104422743A - 一种抗凝血药物的分离检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属分析化学领域，具体涉及用液相色谱法分离测定(S)-利伐沙班及其对映异构体的方法。一种用液相色谱法分离测定(S)-利伐沙班及其对映异构体(杂质)的方法，其特征在于，以多糖衍生物为填料的手性色谱柱，以低级醇或低级烷烃与低级醇的混合溶液为流动相。本发明所述分离检测方法可以将(S)-利伐沙班与其对映异构体进行有效分离，分离度达到1.5以上，完全基线分离，从而可以准确有效控制(S)-利伐沙班的质量。采用本发明所述的分离方法，分离检测(S)-利伐沙班及其对映体的时间在80分钟以内，本发明的方法能简单、快速、准确的分离检测出(S)-利伐沙班及其光学异构体。

Description

一种抗凝血药物的分离检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及用液相色谱法分离测定(S)-利伐沙班及其对映异构体的方法。

背景技术

PCT申请WO2001047919首次公开了利伐沙班或其可药用盐，利伐沙班，化学名称为5-氯-N-(((5S)-2-氧代-3-(4-(3-氧代吗啉-4-基)苯基)-1,3-恶唑啉-5-基)甲基)噻吩-2-甲酰胺，其化学结构如式(I)所示，下文称(S)-利伐沙班，

(S)-利伐沙班可竞争性抑制游离和结合的Xa因子以及凝血酶原活性，以剂量-依赖方式延长活化部分凝血活酶时间板(PT)和凝血酶原时间(aPTT)，主要用于择期髋关节或膝关节置换手术成年患者，以预防静脉血栓形成(VTE)。在美国，用于预防髋关节和膝关节置换术后患者深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)的形成。在日本，用于预防非瓣膜性心房纤颤患者脑卒中和非中枢神经系统性栓塞，降低冠状动脉综合症复发的风险等。

(S)-利伐沙班分子中存在1个手性中心，在化学合成中会同时生成2种立体构型不同的光学异构体。(S)-利伐沙班的对映异构体被列为(S)-利伐沙班的杂质,(S)-利伐沙班的对映异构体杂质的化学名分别为：5-氯-氮-((5R)-2-氧-3-[-4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-1,3-唑烷-5-基-2-噻吩-羧酰胺，本发明称(R)-利伐沙班。

在生产(S)-利伐沙班过程中需要进行质量控制，但目前，《美国药典》USP、《欧洲药典》EP及《中国药典》Ch.P.均没有收载(S)-利伐沙班，也未查到有关文献报道(S)-利伐沙班及其对映异构体的分离检测方法。为了更好更准确的控制产品中对映异构体的含量，保证原料药以及制剂产品的质量，本发明自主开发了适合于(S)-利伐沙班原料药的对映异构体含量测定的分析方法。本发明的方法能简单、快速、准确地分离、检测出(S)-利伐沙班及其对映异构体杂质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用手性色谱柱分离测定(S)-利伐沙班及其对映异构体杂质的方法，从而实现(S)-利伐沙班及其对映异构体杂质的分离和测定。

一种用液相色谱法分离测定(S)-利伐沙班及其对映异构体(杂质)的方法，其特征在于，采用以多糖衍生物为填料的手性色谱柱，以低级醇或低级烷烃与低级醇的混合溶液为流动相。

在一些实施例中，所述手性色谱柱的多糖衍生物填料为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-三[(S)-α-甲苯基氨基甲酸酯]、纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三[4-甲基苯甲酸酯]或纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)或其组合，在某些实施例中，多糖衍生物填料为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)。

在一些实施例中，所述的手性色谱柱为CHIRALPAK AD、CHIRALPAK AS-H、CHIRALCEL OD-H、CHIRALCEL OJ-H或CHIRALPAK IC,销售厂家是大赛璐药物手性技术(上海)有限公司，英文名DAICEL CHIRAL TECHNOLOGIES(CHINA)CO.,LTD.

在一些实施例中，所述低级烷烃是常见的烷烃包括正己烷、正戊烷、正庚烷、环己烷或其组合。

在一些实施例中，所述流动相的低级烷烃或者低级醇类溶液中可以进一步含有有机胺或有机酸或者有机酸和有机胺混合物，在另一些实施例中，所述流动相的低级烷烃溶液中可以含有有机胺(如二乙胺、三乙胺、正丁胺、叔丁胺等)。所述有机胺的浓度(V/V)占低级烷烃的体积百分比为大约0.05至大约5％。

在一些实施例中，所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丙醇或其组合，在某些实施例中为乙醇、异丙醇或其组合。

在一些实施例中，所述流动相低级烷烃(含有机胺)与低级醇溶液的体积比为40:40至0:100，在一些实施例中为40:50至10:90；在另一些实施例中为30:70，在另一些实施例中为40:60，在某些实施例中为20:80。

本发明所述的分离测定方法，可按以下步骤实现：

1)取利伐沙班外消旋体或(S)-利伐沙班或含(S)-利伐沙班的制剂样品适量，用一定量的腈类溶剂与醇类溶剂的混合溶剂作为稀释剂溶解样品。

2)设置仪器参数：流动相的流速、检测波长、色谱柱的柱箱温度。

3)取一定量步骤1)的溶液，注入高效液相色谱仪，完成(S)-利伐沙班及其对映异构体的分离测定。

步骤1)所述的(S)-利伐沙班可以是任意光学纯度的，作为原料药(API)使用的(S)-利伐沙班可以采用美国专利US7157456实施例44公开的方法制备，利伐沙班外消旋体的制备采用N-缩水甘油邻苯二甲酰亚胺为原料按照美国专利US7157456实施例44公开的方法制备；含(S)-利伐沙班的制剂样品如(S)-利伐沙班普通片从Bayer Schering Pharma AG购买。

步骤1)所述腈类溶剂为乙腈、丙腈、丁腈或其组合；在一些实施例中，所述腈类溶剂为乙腈。所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇或其组合，在一些实施例中，所述的醇类溶剂为乙醇；在某些实施例中，所述腈类溶剂与醇类溶剂的混合溶剂为乙腈与乙醇的混合溶剂；所述腈类溶剂与醇类溶剂的混合溶剂的体积比(V/V)为45:55至75:25；在一些实施例中，所述腈类溶剂与醇类溶剂的混合溶剂的体积比(V/V)为60:40。

在一些实施例中，步骤1)所述的稀释剂中每1ml稀释剂含利伐沙班样品0.2mg至10mg；在另一些实施例中，步骤1)所述的稀释剂中每1ml稀释剂含利伐沙班样品0.3mg至5mg；在某些实施例中，步骤1)所述的稀释剂中每1ml稀释剂含利伐沙班样品0.5mg。

步骤2)所述流动相的流速为0.3ml/min至0.9ml/min，在一些实施例中，流动相的流速为0.5ml/min；所述检测波长为230nm至270nm，在一些实施例中，检测波长为250nm；所述色谱柱柱箱温度为20℃至50℃。

步骤3)所述样品溶液进样量为2μl～20μl，在一些实施例中，所述样品溶液进样量为5μL-10μl。

本发明所述的分离测定方法，可按以下方法实现：

1)取利伐沙班外消旋体或(S)-利伐沙班或含(S)-利伐沙班的制剂样品适量，用腈类溶剂与醇类溶剂的混合溶剂溶解样品，并配制成每1ml含利伐沙班0.2mg～10mg的样品溶液；

2)设置流动相的流速为0.3ml/min至0.9ml/min，流动相的流速优选为0.5ml/min，检测波长为230nm至270nm，最佳检测波长为250nm，色谱柱柱箱温度为20℃至50℃；

3)取步骤1)的样品溶液2μl～20μl，注入高效液相色谱仪，完成(S)-利伐沙班及其对映体的分离测定。

其中：

所采用的高效液相色谱仪为美国Agilent1260型高效液相色谱系统及工作站。

手性色谱柱选自CHIRALPAK AD、CHIRALPAK AS-H、CHIRALCEL OD-H、CHIRALCEL OJ-H或CHIRALPAK IC。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK AD，流动相为乙醇。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK AS-H，流动相为正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇，正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇的体积比(V/V)为大约20:80。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALCEL OD-H，流动相为正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇，正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇的体积比(V/V)为大约45:55。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALCEL OJ-H，流动相为正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇，正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇的体积比(V/V)为大约40:60。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK IC，流动相为正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇，正己烷(0.1％二乙胺)与乙醇的体积比(V/V)为大约40:60。

在下文或下文的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。

本发明采用以多糖衍生物为填料的手性色谱柱，以低级醇或低级烷烃与低级醇的混合溶液为流动相，可以将(S)-利伐沙班与其对映异构体进行有效分离，分离度达到1.5以上或2.5以上或5以上，完全基线分离，从而可以准确有效控制(S)-利伐沙班的质量。采用本发明所述的分离方法，分离检测(S)-利伐沙班及其对映体的时间在80分钟以内，在一些实施例中为50分钟以内，在一些实施例中为30分钟以内，本发明的方法能简单、快速、准确的分离检测出(S)-利伐沙班及其光学异构体。

附图说明

图1空白溶剂的高效液相色谱图。

图2示实施例1分离检测的高效液相色谱图。

图3示实施例2分离检测的高效液相色谱图。

图4示实施例3分离检测的高效液相色谱图。

图5示实施例4分离检测的高效液相色谱图。

图6示实施例5分离检测的高效液相色谱图。

图7示实施例6分离检测的高效液相色谱图。

图8示实施例7分离检测的高效液相色谱图。

图9示实施例8分离检测的高效液相色谱图。

图10示实施例9分离检测的高效液相色谱图。

图11示实施例10分离检测的高效液相色谱图。

图12示实施例11分离检测的高效液相色谱图。

图13示实施例12分离检测的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

本发明中，min表示分钟，g表示克，ml表示毫升，μL表示微升，μm表示毫米。

仪器与色谱柱的规格：

美国Agilent1260型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；

实施例1-4：以CHIRALPAK AS-H手性色谱柱分离检测(S)-利伐沙班及其对映体的方法

实施例1

仪器与条件

色谱柱：以CHIRALPAK AS-H手性色谱柱，4.6*250mm；

检测器：UV检测器，检测波长250nm；

流速：0.5mL/min；

柱温：35℃；

进样量：5μL；

流动相：正己烷(含0.1％二乙胺)：乙醇(V/V)为30:70为流动相；

运行时间：42min；

实验步骤

释剂：乙腈:乙醇＝60:40(V/V)；取利伐沙班消旋体约25mg，精密称定至50mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别取稀释剂(作为空白溶液)和供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2。图2中保留时间17.000分钟的色谱峰为(S)-利伐沙班的色谱峰；33.687分钟的色谱峰为(R)-利伐沙班。

实施例2

取(S)-利伐沙班(原料药)约25mg，精密称定至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，照实例1的条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图3，其中，保留时间为33.640分钟的为(R)-利伐沙班，16.100分钟为(S)-利伐沙班。图3证明，(S)-利伐沙班(原料药)的光学纯度达到99.4％以上，本法可以用于(S)-利伐沙班原料药的质量监测。

实施例3

取(S)-利伐沙班片适量，约相当于(S)-利伐沙班25mg，置50ml棕色容量瓶中，加稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，滤液作为供试品溶液。取供试品溶液，照实例1的条件进行高效液相色谱分析，结果见图4，其中，保留时间为35.280分钟的为(R)-利伐沙班，17.027分钟为(S)-利伐沙班，图4证明，本法可以用于含(S)-利伐沙班制剂的质量监测。

实施例4

检测器：UV检测器，检测波长250nm；

流速：0.5ml/min；

柱温：35℃；

进样量：5μL；

运行时间：30min；

流动相：正己烷(0.1％二乙胺)：乙醇＝20:80(V/V)；等度洗脱；

稀释剂/空白溶剂：乙腈:乙醇＝3:2(V/V)；

取利伐沙班消旋体约25mg，精密称定至50ml棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图5。

实施例5-6的仪器参数及其设置条件

采用CHIRALPAK AD柱色谱分离检测利伐沙班(原料药)及利伐沙班消旋体

色谱柱：CHIRALPAK AD，4.6X250mm，10μm；

检测器：UV检测器，检测波长250nm；

流速：0.7mL/min；

柱温：35℃；

进样量：5μL；

运行时间：80min；

流动相：100％乙醇；等度洗脱；

稀释剂/空白溶剂：乙腈:乙醇＝3:2(V/V)；

实施例5

供试液配制：取利伐沙班消旋体25mg至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解稀释至刻度，摇匀作为供试溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图6，其中，保留时间为46.413分钟的为(R)-利伐沙班，保留时间为65.413分钟的为(S)-利伐沙班。

实施例6

取(S)-利伐沙班(原料药)约25mg，精密称定至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，照实例5的条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图7。图7证明，(S)-利伐沙班的光学纯度达到99.4％以上，本法可以用于(S)-利伐沙班的质量监测。

实施例7-8的仪器参数及其设置条件

采用CHIRALCEL OD-H柱色谱分离检测利伐沙班消旋体及(S)-利伐沙班(原料药)

色谱柱：CHIRALCEL OD-H，4.6X250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长250nm；

流速：0.4ml/min；

柱温：33℃；

进样量：10μl；

运行时间：45min；

流动相：正己烷(0.1％二乙胺)：乙醇＝45:55(V/V)；等度洗脱；

稀释剂/空白溶剂：乙腈:乙醇＝3:2(V/V)；

实施例7

供试液配制：取利伐沙班消旋体25mg至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解稀释至刻度，摇匀；按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图8，其中，保留时间为29.640分钟的为(R)-利伐沙班，33.713分钟为(S)-利伐沙班。

实施例8

取(S)-利伐沙班(原料药)约25mg，精密称定至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，照实例7的色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图9。

图9证明，(S)-利伐沙班的光学纯度达到99.4％以上，本法可以用于(S)-利伐沙班的质量监测。

实施例9-10的仪器参数及其设置条件

采用CHIRALCEL OJ-H柱色谱分离检测利伐沙班消旋体及(S)-利伐沙班(原料药)

色谱柱：CHIRALCEL OJ-H，4.6X250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长250nm；

流速：0.5mL/min；

柱温：35℃；

进样量：10μL；

运行时间：45min；

流动相：正己烷(0.1％二乙胺)：乙醇＝40:60(V/V)；等度洗脱；

稀释剂/空白溶剂：乙腈:乙醇＝3:2(V/V)。

实施例9

供试液配制：取利伐沙班消旋体25mg至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解稀释至刻度，摇匀；按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图10，其中，保留时间为26.773分钟的为(S)-利伐沙班，在31.393分钟的为(R)-利伐沙班。

实施例10

取(S)-利伐沙班(原料药)约25mg，精密称定至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，照实例9的条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图11。图11证明，(S)-利伐沙班的光学纯度达到99.4％以上，本法可以用于(S)-利伐沙班的质量监测。

实施例11-12的仪器参数及其设置条件

采用CHIRALPAK IC柱色谱分离检测利伐沙班消旋体及(S)-利伐沙班(原料药)

色谱柱：CHIRALPAK IC，4.6X250mm，5μm；

检测器：UV检测器，检测波长250nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：35℃；

进样量：5μL；

运行时间：30min；

流动相：正己烷(0.1％二乙胺)：乙醇＝40:60(V/V)；等度洗脱；

稀释剂/空白溶剂：乙腈:乙醇＝3:2(V/V)。

实施例11

供试液配制：取利伐沙班消旋体25mg至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解稀释至刻度，摇匀；按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图12，其中，保留时间为18.300分钟为(R)-利伐沙班，20.640分钟的为(S)-利伐沙班。

实施例12

取(S)-利伐沙班(原料药)约25mg，精密称定至50ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，照实例11的条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图13。图13证明，(S)-利伐沙班的光学纯度达到99.4％以上，本法可以用于(S)-利伐沙班的质量监测。

Claims (10)

1.一种用液相色谱法分离测定(S)-利伐沙班及其对映异构体的方法，其特征在于，采用以多糖衍生物为填料的手性色谱柱，以低级醇或低级烷烃与低级醇的混合溶液为流动相，所述手性色谱柱的多糖衍生物填料为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-三[(S)-α-甲苯基氨基甲酸酯]、纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三[4-甲基苯甲酸酯]或纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)或其组合。

2.根据权利要求1所述的方法，所述手性色谱柱的多糖衍生物填料为直链淀粉－三(3,5－二甲苯基氨基甲酸酯)。

3.根据权利要求1所述的方法，所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇或异丙醇或其组合。

4.根据权利要求1所述的方法，所述低级烷烃为为正己烷、正戊烷、正庚烷或环己烷或其组合。

5.根据权利要求1所述的方法，所述低级烷烃或者低级醇溶液中进一步含有二乙胺或乙酸。

6.根据权利要求5所述的方法，所述二乙胺的浓度(V/V)占低级烷烃的体积百分比为0.05～5％。

7.根据权利要求1所述的方法，所述流动相低级烷烃(含有机胺)与低级醇溶液的体积比为60:40至0:100，或者为40:50至10:90；或者为30:70，或者为40:60，或者为20:80。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的方法包含以下步骤：

1)取(S)-利伐沙班或含(S)-利伐沙班的制剂样品适量，用一定量的乙腈与乙醇的混合溶剂作为稀释剂溶解样品，

2)设置仪器参数：流动相的流速、检测波长、色谱柱柱温箱温度，

3)取一定量步骤1)的溶液，注入高效液相色谱仪，完成(S)-利伐沙班及其对映异构体的分离测定。

9.根据权利要求10所述的方法，所述乙腈与乙醇的混合溶剂的体积比(V/V)为45:55至75:25；或者，所述乙腈与乙醇的混合溶剂的体积比(V/V)为60:40。

10.根据权利要求8所述的分离测定方法，所述流动相的流速为0.3ml/min至0.9ml/min，或者流动相的流速为0.5mL/min；检测波长为230nm至270nm，或者检测波长为250nm；色谱柱柱箱温度为20℃至50℃。