CN103983729B - 一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法 - Google Patents
一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，属于分析化学技术领域。本发明的步骤为：一、将HSLs标准品用乙酸乙酯配制成标准储备液；二、取土壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入离心管中震荡，取上清液，向上清液中加入混标样品涡旋混匀；三、将乙酸乙酯加入制得的溶液中，萃取、离心，吸取乙酸乙酯相于含有无水Na2SO4的离心管中，漩涡、离心，吸取有机相于进样瓶中；四、进行GC-MS检测。本发明建立了利用GC-MS测定土壤溶液中HSLs的分析方法，操作简便，检测精度高，适用于土壤溶液中多种HSLs信号分子化合物的同时定性与定量分析，为进一步深入研究HSLs信号分子在土壤中的环境行为奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及土壤溶液中化合物的气质联用分析技术领域，更具体地说，涉及一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法。
背景技术
群体感应(Quorumsensing，QS)是指微生物自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，从而调节微生物的群体行为。随着微生物学的深入发展，QS现象渐渐被大家所熟知。许多微生物的生理特性和活动都与群体感应息息相关。由于小分子在细菌胞间传递信息，在某种意义上使得细菌间能相互交流。革兰氏阴性细菌的群体感应一般都是由LuxI/R型信息系统调控，并以酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserinelactones，HSLs)作为信号分子。HSLs是一类特殊的小分子水溶性化合物，能够很容易通过细胞膜。研究表明，许多革兰氏阴性菌都靠分泌HSLs进行交流和协调群体行为，如生物体发光、蛋白酶活性、抗生素的产生等等。
目前，对HSLs信号分子检测方法主要有酶联免疫、生物传感器、薄层层析和色谱方法。色谱方法包括气相色谱-质谱(gaschromatography-mass，GC-MS)、超级液相色谱(UPLC)、傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)等。其中，生物传感器和薄层层析是分析HSLs化合物最常用的方法。生物传感器检测精度能够达到飞摩尔级，但是每种HSLs都需要特定的菌株和质粒，并且完成测定需要一天的时间。薄层层析的精度不高，只能用来测定较高浓度的HSLs。酶联免疫法简单、方便、快捷，但不能确定HSLs结构。超级液相色谱可以同时定量分析含羟基、羰基的多种HSLs，傅立叶变换离子回旋共振质谱是一种新兴的鉴定HSLs结构的方法，精度高。但由于这两种方法使用仪器比较昂贵，还无法普及到普通的实验室。GC-MS方法能够同时定性、定量地检测HSLs。但目前常规使用的GC-MS检测HSLs的方法还不够优化，且主要是针对纯溶液体系，对于复杂介质(比如土壤、沉积物)中的HSLs测定还不能提供准确的检测方法。
发明内容
1.发明要解决的技术问题
本发明提供了一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，克服了现有HSLs信号分子检测技术所存在的检测精度低、检测成本高、耗时以及不能很好地应用于复杂介质(比如土壤)中的HSLs测定等问题。
2.技术方案
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，其步骤为：
步骤一、将HSLs标准品用乙酸乙酯溶解并配制成1000mgL-1的标准储备液，于-20℃下保存备用，所述的HSLs标准品为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL；
步骤二、取土壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入离心管中，震荡制备土壤溶液，离心分离，取上清液，向上清液中加入混标样品涡旋混匀，所述的混标样品为由步骤一制得的C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL标准储备液稀释混合配制而成；
步骤三、将乙酸乙酯加入步骤二制得的含HSLs的溶液体系中，漩涡萃取、离心分离，取乙酸乙酯相于含有无水Na2SO4的离心管中，漩涡混匀、离心分离，吸取有机相于进样瓶中；
步骤四、对步骤三得到的有机相中所含HSLs进行GC-MS检测，优化的色谱条件包括：进样口温度290℃，初始色谱柱温度设为100℃，以35℃min-1升至150℃，紧接着以25℃min-1升至280℃，保持6分钟，后运行温度为290℃，保持2分钟。
更进一步地，步骤四进行GC-MS检测时，采用分流进样模式，分流比为5:1。
更进一步地，步骤二所述的震荡制备土壤溶液，震荡速率为160rpm，震荡时间为8h，然后以4000rpm的速率离心5min，取上清液。
更进一步地，步骤三加入1mL乙酸乙酯于含有0.5mL溶液体系的离心管中，漩涡萃取2min，以12000rpm的速率离心2min，取乙酸乙酯相于含有无水Na2SO4的离心管中后，漩涡混匀2min，以12000rpm的速率离心2min。
更进一步地，步骤四进行色谱分析时，所用的色谱柱为AgilentHP-5MS石英毛细管柱，载气为高纯氦气。
更进一步地，步骤四所述的色谱条件还包括：流速1mLmin-1；进样量1μL，分析时间为：15min；传输线温度为280℃。
更进一步地，步骤四进行GC-MS检测的质谱条件为：电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，选择m/z143离子作为标记碎片进行选择离子检测。
3.有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下显著效果：
(1)本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，建立了利用GC-MS测定土壤溶液中HSLs的分析方法，在制备检测样品过程中进行了多级离心、萃取操作，且对离心震荡速率、时间等进行了优化调控，为后续GC-MS测定奠定了很好的基础；
(2)本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，利用GC-MS测定技术，该技术柱效高，易维护，发展迅速且较为成熟，且本发明在采用GC-MS对HSLs进行定性定量分析时，对色谱和质谱条件进行了优化，操作简便，快速准确，检测精度、灵敏度高，适用于土壤溶液中多种HSLs信号分子化合物的同时定性与定量分析；
(3)本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，通过加标回收率实验可得乙酸乙酯对土壤溶液中C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL的萃取具有较高的回收率，为进一步深入研究HSLs信号分子在土壤中的环境行为奠定了基础。
附图说明
图1为本发明中7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)标准品的GC-MS色谱图；
图2～图8为本发明中7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)标准品的GC-MS质谱图。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。
仪器与试剂：本发明的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，采用GC-MS(美国Agilent7890A/5975C，7693自动进样器)检测器，乙酸乙酯(色谱纯)购于J.T.Baker公司(美国)，实验用水为去离子水，HSLs标准品(C4-HSL，C6-HSL，C7-HSL，C8-HSL，C10-HSL，C12-HSL，C14-HSL)购于美国Sigma公司，纯度≥97％。乙酸乙酯(色谱纯)购于J.T.Baker公司(美国)。将7种HSLs标准品分别用乙酸乙酯溶解并配制成1000mgL-1的标准储备液，于–20℃下保存备用。采用带自动进样器的GC-MS(美国Agilent7890A/5975C)对HSLs进行定性定量分析，本发明使用的GC-MS检测仪价格相对较低，可以在普通的实验室推广使用，使得本发明的检测成本降低。
实施例1
本实施例着重于分析对标准溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)GC-MS测定方法的优化。
步骤一：分别取10μL上述7种HSLs标准储备液于2mL进样瓶，加入990μL乙酸乙酯进行稀释至10mgL-1，然后于新进样瓶中分别将其逐级稀释至10μgL-1、20μgL-1、50μgL-1、100μgL-1、200μgL-1、300μgL-1、400μgL-1、500μgL-1、600μgL-1、800μgL-1、1000μgL-1、2000μgL-1，使用GC-MS检测。
步骤二：设定质谱仪参数，质谱条件为：电子能量70eV、离子源温度230℃、四级杆温度150℃下，采用全扫描模式。
步骤三：设定色谱条件参数：进样口温度290℃，分流进样，分流比为5:1，初始色谱柱温度设为100℃，以35℃min-1升至150℃，紧接着以25℃min-1升至280℃，保持6分钟，后运行温度为290℃，保持2分钟。
在优化各种条件以后，7种HSLs在12min内完全分离(参见图1)，出峰顺序和保留时间参见表1。最优条件下，5次连续测定同一标准品，保留时间的标准偏差小于0.2％。
步骤四：选择m/z143离子作为标记碎片进行离子检测，对7种HSLs的色谱峰进行质谱鉴定。
从图2～图8可以看到，每种化合物的质谱图均呈现各自的分子离子峰[M]+，即C4-HSL(m/z171)，C6-HSL(m/z199)，C7-HSL(m/z213)，C8-HSL(m/z227)，C10-HSL(m/z255)，C12-HSL(m/z283)，C14-HSL(m/z311)。从这7种HSLs的离子碎片中发现，m/z143处丰度值较高，7种HSLs分子均含有丰富的m/z143碎片离子，选择m/z143离子作为标记碎片进行离子检测，提高了检测精度，获得了更好的检测效果。
从表1还可以看出，7种HSLs的检出限在1.5～2.5μgL-1之间，而且，标准工作曲线在2000μgL-1以内都有很好的线性关系，其决定系数R2均大于0.997。可见本实施例的方法准确度、检测精度、灵敏度高。此外，本实施例大部分检测操作通过优化控制GC-MS检测仪完成，操作简便、快速准确。
表17种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)标准溶液的线性关系和检出限
实施例2
本实施例着重于分析7种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)在土壤溶液中的检出限。
步骤一：在50mL离心管中分别加入10g海南砖红壤或南京黄棕壤，然后以土水比1:2的比例加入20mL水，以160rpm震荡8h制备土壤溶液，接着以4000rpm的速率离心5min，分别取上清液0.5mL于2mL离心管中。
步骤二：向步骤一吸取的上清液中，分别加入不同浓度梯度的混标样品(由C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL标准储备液稀释混合配制而成)，涡旋混匀10秒。
步骤三：取1mL乙酸乙酯，加入上述离心管中，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离心2min后，分别吸取上层乙酸乙酯相于新离心管(离心管中事先加入1g无水Na2SO4)中，漩涡振荡2min，12000rpm的速率离心2min后，吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。
步骤四：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。
7种HSLs在土壤溶液中的检出限及其标准工作曲线见表2。可以看到，7种HSLs的检出限在3.0～5.0μgL-1之间，而且，标准工作曲线在2000μgL-1以内都有很好的线性关系，其决定系数R2均大于0.997。5次连续测定同一样品，保留时间的标准偏差小于0.2％。可见本实施例的方法可以用于土壤溶液样品中HSLs的分析测定，而且准确度、检测精度、灵敏度高。
结合表1和表2，可得7种HSLs标准工作曲线都一致，表明本实施例的方法稳定性和重复性好。
表27种酰基高丝氨酸内酯(HSLs)在土壤溶液中的检出限
实施例3
本实施例着重于分析水溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的提取回收率。
步骤一：取0.5mL去离子水于2mL离心管中，分别加入10μL25mgL-1或10μL100mgL-1的混标样品(由C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL标准储备液稀释混合配制而成)，涡旋混匀10秒，使得溶液中HSLs的浓度为0.5mgL-1或2mgL-1。
步骤二：取1mL乙酸乙酯，加入上述离心管中，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离心2min后，分别吸取上层乙酸乙酯相于新离心管(离心管中事先加入1g无水Na2SO4)中，漩涡振荡2min，12000rpm的速率离心2min后，吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。
步骤三：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。
本实施例在制备检测样品过程中进行多级离心、萃取操作，且对离心震荡速率、时间等进行了优化调控，使得后续的GC-MS测定能够有更高的准确度和检测精度。
水中HSLs的回收率检测结果参见表3，在去离子水加标回收率实验中，7种HSLs的回收率的标准偏差在0～8.11％之间，表明本实施例的方法精密度很高。除了C4-HSL以外，其他6种HSLs的回收率均较高：当加标浓度为0.5mgL-1时，回收率在76％～85％之间；加标浓度为2mgL-1时，回收率在74％～97％之间。
表3水中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的加标回收率
实施例4
本实施例着重于分析土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的提取回收率。
步骤一：取海南砖红壤、南京黄棕壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入到50mL离心管，以160rpm震荡8h制备土壤溶液，接着以4000rpm的速率离心5min，分别取上清液0.5mL于2mL离心管。
步骤二：向离心管中分别加入10μL25mgL-1或10μL100mgL-1的混标样品(由C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL标准储备液稀释混合配置而成)，涡旋混匀10秒，使得离心管溶液中HSLs的浓度为0.5mgL-1或2mgL-1。
步骤三：加入1mL乙酸乙酯，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离心2min，吸取上层乙酸乙酯相于含有1g无水Na2SO4的新离心管，漩涡混匀2min，12000rpm的速率离心2min，吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。
步骤四：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。
表4为本实施例不同土水比土壤溶液中HSLs的加标回收率，与水溶液中HSLs的回收率实验结果类似，从表4可得：除了C4-HSL以外，其他6种HSLs在2种土壤的3个土水比溶液中的回收率均较高，不同土水比的土壤溶液中其余6种HSLs的加标回收率总体都在71％～104％之间。而且，两种土壤的3种土水比溶液中同一种HSLs的回收率都没有显著差异，表明土壤溶液中的有机、无机化合物对本实施例的测定方法没有影响，说明本实施例的检测方法可以有效用于不同土壤溶液中HSLs的定量检测与比较。
表4不同土水比土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的加标回收率
实施例5
本实施例着重于对土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的测定。
步骤一：在50mL离心管中加入10g海南砖红壤，然后以土水比1:2的比例加入20mL水，以160rpm震荡8h制备土壤溶液，接着以4000rpm离心5min，分别取上清液0.5mL于2mL离心管。
步骤二：加入1mL的乙酸乙酯，漩涡萃取2min，12000rpm的速率离心2min，吸取上层乙酸乙酯相于含有1g无水Na2SO4的新离心管，漩涡混匀2min，12000rpm的速率离心2min，吸取上层有机相0.5mL于进样瓶中。
步骤三：按照实施例1所述步骤二至四进行GC-MS测定。
对南京黄棕壤重复上述测定，砖红壤和黄棕壤溶液中HSLs浓度见表5，可以看到，两种土壤溶液中各种HSLs的浓度均比较接近，其中，砖红壤溶液中7种HSLs的浓度在3.80～8.69μgL-1之间，黄棕壤溶液中7种HSLs的浓度在4.19～9.78μgL-1之间。这些结果表明，本实施例的检测方法可以有效用于复杂环境介质——土壤溶液中HSLs的定量检测与比较。
表5砖红壤和黄棕壤溶液中酰基高丝氨酸内酯(HSLs)的浓度
实施例1～5所述的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，在制备检测样品过程中进行了多级离心、萃取操作，对离心震荡速率、时间等进行了优化调控，为后续GC-MS测定奠定了很好的基础，且在采用GC-MS对HSLs进行定性定量分析时，对色谱和质谱条件进行了优化，操作简便，快速准确，检测精度、灵敏度高，适用于土壤溶液中多种HSLs信号分子化合物的同时定性与定量分析，通过加标回收率实验可得乙酸乙酯对土壤溶液中C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL的萃取具有较高的回收率，为进一步深入研究HSLs信号分子在土壤中的环境行为奠定了基础。
Claims (4)
1.一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，其步骤为：
步骤一、将HSLs标准品用乙酸乙酯溶解并配制成1000mgL-1的标准储备液，于-20℃下保存备用，所述的HSLs标准品为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL；
步骤二、取土壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入离心管中，震荡制备土壤溶液，离心分离，取上清液，向上清液中加入混标样品涡旋混匀，所述的混标样品为由步骤一制得的C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL标准储备液稀释混合配制而成；
步骤三、将1mL乙酸乙酯加入步骤二制得的0.5mL含HSLs的溶液体系中，漩涡萃取2min，以12000rpm的速率离心2min，取乙酸乙酯相于含有无水Na2SO4的离心管中，漩涡混匀2min，以12000rpm的速率离心2min，吸取有机相于进样瓶中；
步骤四、对步骤三得到的有机相中所含HSLs进行GC-MS检测，优化的色谱条件包括：进样口温度290℃，采用分流进样模式，分流比为5:1，初始色谱柱温度设为100℃，以35℃min-1升至150℃，紧接着以25℃min-1升至280℃，保持6分钟，后运行温度为290℃，保持2分钟；进行GC-MS检测的质谱条件为：电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，选择m/z143离子作为标记碎片进行选择离子检测。
2.根据权利要求1所述的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，其特征在于：步骤二所述的震荡制备土壤溶液，震荡速率为160rpm，震荡时间为8h，然后以4000rpm的速率离心5min，取上清液。
3.根据权利要求1所述的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，其特征在于：步骤四进行色谱分析时，所用的色谱柱为AgilentHP-5MS石英毛细管柱，载气为高纯氦气。
4.根据权利要求3所述的一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，其特征在于：步骤四所述的色谱条件还包括：流速1mLmin-1；进样量1μL，分析时间为：15min；传输线温度为280℃。
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