CN112557372B - 一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法 - Google Patents

一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，包括以下步骤：S1：Au NPs溶液的制备；S2：Au@MBN@Ag NPs溶液的制备；备；S4：Au@MBN@Ag@Apt‑Trp‑MB复合物溶液的制备；将0.5mM活化后的MB‑COOH与1mM色氨酸以1：2(v/v)混合并孵育1h后，得到复合物溶液A；将利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液A与5％wt的牛血清白蛋白以10：1(v/v)混合并孵育1h，得到复合物溶液B；对利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液B与Au@MBN@Ag@Apt NPs以1：2(v/v)混合并孵育10min～120min，得到Au@MBN@Ag@Apt‑Trp‑MB复合物溶液；S5：IDO的检测。本发明具有高特异性、高灵敏度和高抗干扰性，能够快速、灵敏地检测出IDO在肿瘤微环境中的表达和活性。

Description

一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法
技术领域
本发明涉及酶检测技术领域，尤其是指一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法。
背景技术
吲哚胺-2，3-二加氧酶(IDO)是色氨酸(Trp)代谢的限速酶。IDO被称为犬尿氨酸(Kyn)途径(KP)代谢的关键酶，它催化L-Trp中吲哚环氧化的裂解，使其成为潜在的肿瘤免疫疗法药物靶标。通过自身免疫反应，IDO在维持外周免疫耐受和调节自身免疫反应中起着重要作用。与正常生理条件相比，在肿瘤微环境中容易发现IDO过度表达。IDO的过度表达会异常消耗Trp，并通过KP途径增加代谢产物的产生，这被认为是逃避潜在免疫反应的重要免疫效应途径。
临床研究表明，IDO在各种人类原位和转移性肿瘤组织(例如黑素瘤，卵巢癌，子宫癌，结直肠癌和神经胶质瘤)中异常表达，这与预后的影响呈负相关，导致IDO有助于建立病理性炎症状态以支持肿瘤生长和转移进程。其中，多种炎症因子(如
Figure BDA0002820626760000011
，TNF-α和IL-1)影响IDO在肿瘤微环境中的表达和活性。因此开发一种快速、灵敏、可靠的检测IDO的方法迫在眉睫。
在癌症患者中，与IDO活性相关的Trp浓度和Kyn/Trp比率与存活率相关。目前检测上述指标的方法包括细胞免疫荧光技术、qRT-PCR方法和Western Blot方法等。其中荧光方法由于其稳定性和高灵敏度而受到高度重视，但是这些荧光材料的合成过程复杂且耗时。而qRT-PCR方法存在试剂盒昂贵、操作要求高等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，提高对吲哚胺2，3双加氧酶活性的检测灵敏度。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，包括以下步骤：
S1：Au NPs溶液的制备；
S2：Au@MBN@Ag NPs溶液的制备：
S21：将纯化后的Au NPs溶液与0.1mM的4-巯基苯甲腈溶液以200：1～100：1(v/v)混合，孵化1h后，通过离心去除多余的4-巯基苯甲腈，并重悬于蒸馏水中；
S22：1mM的AgNO3溶液和320uL 0.01M的抗坏血酸溶液以20：1～7：1(v/v)加入通过S21得到的溶液，搅拌30min，得到呈橘红色的Au@MBN@Ag NPs溶液；
S3：Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液的制备：
将纯化后的Au@MBN@Ag NPs与500nM的Apt以2：1(v/v)混合并在37℃下孵育12h，得到Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液；
S4：Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液的制备；
将0.5mM活化后的MB-COOH与1mM色氨酸以1：2(v/v)混合并孵育1h后，得到复合物溶液A；
将利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液A与5％wt的牛血清白蛋白以10：1(v/v)混合并孵育1h，得到复合物溶液B；
对利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液B与Au@MBN@Ag@Apt NPs以1：2(v/v)混合并孵育10min～120min，得到Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液；
S5：IDO的检测：
将不同浓度的IDO分别加入对应的Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液中，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息，拉曼光谱仪的激发波长为785nm，通过拉曼光谱处理数据并对不同浓度的IDO定量分析。
本发明的有益效果在于：本发明以活化后的MB-COOH、Trp和Au@MBN@Ag@Apt NPs构建检测IDO的三明治模型SERS传感器(即Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液)，其中Trp用于充当连接MB-COOH(羧基磁珠)和Au@MBN@Ag@Apt的介质，使本发明中的检测方法对IDO的检测具有高灵敏度，并具有高度的抗干扰性和高度的特异性。因Trp中的氨基被MB-COOH上的羧基捕获，当加入Au@MBN@Ag@Apt后，Apt与Trp相互识别并结合，即构成了Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB结构。当IDO加入Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB的三明治模型中时，由于IDO将Trp转化为Kyn，而Trp适配体只能识别Trp，故Au@MBN@Ag@Apt会与MB分离，导致MB上吸附的Au@MBN@Ag@Apt减少，从而导致内标信号的特征峰信号减弱。通过实验证明，基于本发明提供检测IDO浓度的方法大大降低了IDO的检测限，在实际应用中大大提高了检测灵敏度。由于Trp适配体与Trp侧链的良好结合和高度特异性，有且仅有Trp被Trp适配体特异性捕获，并且由于在于IDO对于Trp的催化作用具有专一性，使本发明中的检测方法具有高度的抗干扰性和高度的特异性，在对IDO检测的过程中对L-半胱氨酸，L-Kyn，赖氨酸，酪氨酸，组氨酸，L-丝氨酸等氨基酸都无明显感应。
附图说明
图1为本发明中所构建的Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB三明治模型检测IDO时的流程图；
图2为本发明中不同体积的IDO加入Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB三明治模型后在2226cm-1处的峰强度柱状图；
图3为本发明中IDO加入Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB三明治模型不同时间后在2226cm-1处峰强度的折线图；
图4A为本发明实施例三中不同浓度IDO的SERS图谱；
图4B为本发明中IDO标准品浓度与特征峰(2226cm-1)的线性关系示意图；
图5为本发明中以不同氨基酸为介质时在2226cm-1处的峰强度柱状图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
请参照图1-图5，一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，包括以下步骤：
S1：Au NPs溶液的制备；
S2：Au@MBN@Ag NPs溶液的制备：
S21：将纯化后的Au NPs溶液与0.1mM的4-巯基苯甲腈溶液以200：1～100：1(v/v)混合，孵化1h后，通过离心去除多余的4-巯基苯甲腈，并重悬于蒸馏水中；
S22：1mM的AgNO3溶液和320uL 0.01M的抗坏血酸溶液以20：1～7：1(v/v)加入通过S21得到的溶液，搅拌30min，得到呈橘红色的Au@MBN@Ag NPs溶液；
S3：Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液的制备：
将纯化后的Au@MBN@Ag NPs与500nM的Apt以2：1(v/v)混合并在37℃下孵育12h，得到Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液；
S4：Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液的制备；
将0.5mM活化后的MB-COOH与1mM色氨酸以1：2(v/v)混合并孵育1h后，得到复合物溶液A；
将利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液A与5％wt的牛血清白蛋白以10：1(v/v)混合并孵育1h，得到复合物溶液B；
对利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液B与Au@MBN@Ag@Apt NPs以1：2(v/v)混合并孵育10min～120min，得到Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液；
S5：IDO的检测：
将不同浓度的IDO分别加入对应的Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液中，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息，拉曼光谱仪的激发波长为785nm，通过拉曼光谱处理数据并对不同浓度的IDO定量分析。
本发明的工作原理在于：
以活化后的MB-COOH、Trp和Au@MBN@Ag@Apt NPs构建检测IDO的SERS传感器，大大降低了IDO的检测限，提高对IDO的检测灵敏度。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明以活化后的MB-COOH、Trp和Au@MBN@Ag@Apt NPs构建检测IDO的三明治模型SERS传感器(即Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液)，其中Trp用于充当连接MB-COOH和Au@MBN@Ag@Apt的介质，使本发明中的检测方法对IDO的检测具有高灵敏度，并具有高度的抗干扰性和高度的特异性。因Trp中的氨基被MB-COOH上的羧基捕获，当加入Au@MBN@Ag@Apt后，Apt与Trp相互识别并结合，即构成了Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB结构。当IDO加入Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB的三明治模型中时，由于IDO将Trp转化为Kyn，而Trp适配体只能识别Trp，故Au@MBN@Ag@Apt会与MB分离，导致MB上吸附的Au@MBN@Ag@Apt减少，从而导致内标信号的特征峰信号减弱。通过实验证明，基于本发明提供检测IDO浓度的方法大大降低了IDO的检测限，在实际应用中大大提高了检测灵敏度。由于Trp适配体与Trp侧链的良好结合和高度特异性，有且仅有Trp被其特异性捕获，并且由于在于IDO对于Trp的催化作用具有专一性，使本发明中的检测方法具有高度的抗干扰性和高度的特异性，在对IDO检测的过程中对L-半胱氨酸，L-Kyn，赖氨酸，酪氨酸，组氨酸，L-丝氨酸等氨基酸都无明显感应。
进一步的，所述S1中具体制备过程为：在强烈搅拌条件下，将1％wt的Nact溶液和0.01％wt的HAuCl4溶液沸腾水溶液以1：50(v/v)混合；
当上述溶液再次沸腾后继续加热搅拌15分钟，将得到呈酒红色的Au NPs溶液。
进一步的，所述S2中的离心条件：转速为9500rpm，时间12min。
进一步的，所述步骤S4中MB-COOH活化的具体步骤为：将20mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和20mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺以1：4(v/v)加入MB-COOH溶液，孵育0.5h。
进一步的，所述S5中Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液与IDO以1：100～1：17(v/v)混合并进行孵育，孵育时间为10min～120min。
进一步的，所述S5中拉曼光谱的工作曲线为y＝7.45x+3281.72(R2＝0.9884)。
由上述描述可知，在上述工作曲线下进行不同浓度的IDO进行检测，能够使检测结果更加精确。
进一步的，所述S5中通过拉曼光谱中2226cm-1的特征峰进行不同浓度的IDO进行定量分析。
由上述描述可知，2226cm-1的特征峰处于拉曼信号分子位于生物静默区(1800～2400cm-1)，绝大多数生物分子在该区域几乎不存在特征峰，故对实现在复杂生物样本中检测IDO具有重要意义，即在该特征峰下更适用于检测复杂生物样本中的IDO。
进一步的，所述S1中Au NPs溶液中的Au NPs的粒径为30nm。
实施例一
一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，包括以下步骤：
S1：Au NPs溶液的制备：在强烈搅拌条件下，将2ml 1％wt的Nact溶液加入100ml0.01％wt的HAuCl4沸腾水溶液中；
当上述溶液再次沸腾后继续加热搅拌15分钟，得到呈酒红色的Au NPs溶液，自然冷却至室温，在4℃下保存备用。
S2：Au@MBN@Ag NPs溶液的制备：
S21：将50uL 0.1mM的4-巯基苯甲腈溶液(MBN)加入S1中纯化后的Au NPs溶液，将将孵化1h后，转速为9500rpm的条件下离心12min，去除多余的4-巯基苯甲腈，并重悬于蒸馏水中；
S22：对S21所得溶液加入1ml 1mM的AgNO3溶液和320uL 0.01M的抗坏血酸溶液，搅拌30min，得到呈橘红色的Au@MBN@Ag NPs溶液；
S3：Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液的制备：
将1ml纯化后的Au@MBN@Ag NPs与500uL 500nM的Apt混合并在37℃下孵育12h，得到Au@MBN@Ag@Apt NPs溶液；
S4：Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液的制备；
将200uL 0.5mM活化后的MB-COOH与100uL 1mM色氨酸混合并孵育1h后，得到复合物溶液A，即MB-Trp复合物溶液；
将利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液A与5％wt的牛血清白蛋白以10：1(v/v)混合，具体的，对复合物溶液A加入5％wt的牛血清白蛋白并孵育1h，得到复合物溶液B；
对利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液B加入100uL Au@MBN@Ag@Apt NPs孵育60min，得到Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液；
S5：IDO的检测：
将625ng/ml的IDO按照0、1:10、1：5、3:10、1:2.5、1:2、6:10(v/v)(IDO与Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液的体积比)分为多组，并分别加入100uL的Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液，孵育60min；
利用磁铁将上述IDO与Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液的混合液分离并洗涤后，滴在擦净的铝板上，其中分离物主要为未被IDO酶作用的Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB、部分被IDO酶作用的Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB以及完全被IDO酶作用后得到的MB-Kyn。采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息，拉曼光谱仪的激发波长为785nm，通过拉曼光谱处理数据并对不同体积的IDO定量分析。
如图2所示，随着IDO的加入量增加，Trp被转化为Kyn的量增加，Au@MBN@Ag@Apt则因为氨基酸介质的改变而与磁珠分离，即2226cm-1处的峰强度越来越弱。当IDO的量达到50uL后，Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物峰强几乎不再发生改变。
实施例二
在实施例一的基础上，改变S5中IDO的添加量。
S5：IDO的检测：
将625ng/ml的IDO加入100uL Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液中，IDO与Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液的体积比为1：2，孵育0、5、10、20、30、45、60、90、120min，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息。
如图3所示，随着IDO的作用时间增加，Trp被转化为Kyn的量增加，Au@MBN@Ag@Apt则因为氨基酸介质的改变而与磁珠分离，即2226cm-1处的峰强度越来越弱。当IDO的作用时间达到1h后，Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物峰强几乎不再发生改变。
实施例三
在实施例一的基础上，改变S5中IDO的添加量。
S5：IDO的检测：
将625、312.5、156.25、78.125、31.25、15.625、3.125ng/ml的IDO分别加入对应组分的100uL Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液中，IDO与Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物的体积比为1：2，孵育60min，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息(参见图4A)。
如图4B所示，选取生物静默区特征峰2226cm-1与IDO浓度建立工作曲线：y＝-7.45x+3281.72，R2＝0.9884。
实施例四
在实施例一的基础上，改变S5中IDO的添加量。
S5：IDO的检测：
将100uL 10-3M的L-半胱氨酸、10-3M的L-Kyn、10-3M的赖氨酸、10-3M的酪氨酸、10-3M的L-丝氨酸、10-3M的组氨酸和10-3M的色氨酸分别与对应组分的200uL 0.5mM活化后的MB-COOH混合并孵育1h后，在利用磁铁分离并洗涤重悬后的MB-氨基酸复合物溶液中加入5％wtBSA孵育1h，其中，MB-氨基酸复合物溶液和5％wt BSA以10：1(v/v)混合；利用磁铁分离并洗涤重悬后，分别加入100uL Au@MBN@Ag@Apt NPs孵育1h。
上述不同浓度的氨基酸复合溶液利用磁铁分离并洗涤后，分别滴在擦净的铝板上，利用激光拉曼光谱仪收集数据图谱。
由于L-半胱氨酸、L-Kyn、赖氨酸、酪氨酸、L-丝氨酸、组氨酸与色氨酸适配体都无法识别匹配，故Au@MBN@Ag@Apt NPs无法与MB-COOH相连接构成三明治结构，故当利用磁铁将反应完的磁珠吸出进而检测SERS信号时发现，以上述氨基酸为介质在时2226cm-1的峰强度远远低于以Trp为介质时的峰强度(参见图5)，由此可得本发明中的IDO检测方法具有高度的特异性。
其中，图5中横坐标上的1～7共表示七种氨基酸，且1～7依次为：L-半胱氨酸、L-Kyn、赖氨酸、酪氨酸、L-丝氨酸、组氨酸和色氨酸。
综上所述，本发明提供的一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，以活化后的MB-COOH、Trp和Au@MBN@Ag@Apt NPs构建检测IDO的三明治模型SERS传感器，具有高灵敏度、高特异性和高抗干扰性，对于IDO在肿瘤微环境中的表达和活性能够快速、可靠地检测。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：Au NPs溶液的制备：在强烈搅拌条件下，将1 %wt的 Nact溶液和0.01 %wt的HAuCl4溶液沸腾水溶液以1：50（v/v）混合；
当上述溶液再次沸腾后继续加热搅拌15分钟，将得到呈酒红色的Au NPs溶液；
S2：Au@MBN@AgNPs溶液的制备：
S21：将纯化后的Au NPs溶液与0.1 mM的4-巯基苯甲腈溶液以200：1~100：1（v/v）混合，孵化1 h后，通过离心去除多余的4-巯基苯甲腈，并重悬于蒸馏水中；
S22：1 mM的AgNO3溶液和320 uL 0.01 M的抗坏血酸溶液以20：1~7：1（v/v）加入通过S21得到的溶液，搅拌30 min，得到呈橘红色的Au@MBN@AgNPs溶液；
S3：Au@MBN@Ag@AptNPs溶液的制备：
将纯化后的Au@MBN@AgNPs与500 nM的Apt以2：1（v/v）混合并在37℃下孵育12 h，得到Au@MBN@Ag@AptNPs溶液；
S4：Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液的制备；
将0.5 mM活化后的MB-COOH与1 mM色氨酸以1：2（v/v）混合并孵育1 h后，得到复合物溶液A；
将利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液A与5 %wt的牛血清白蛋白以10：1（v/v）混合并孵育1h，得到复合物溶液B；
对利用磁铁分离并洗涤重悬后的复合物溶液B与Au@MBN@Ag@Apt NPs以1：2（v/v）混合并孵育10min ~ 120 min，得到Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液；
所述S4中MB-COOH活化的具体步骤为：将20 mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和20 mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺以1：4（v/v）加入MB-COOH溶液，孵育0.5 h；
S5：IDO的检测：
将不同浓度的IDO分别加入对应的Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液中，采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱信息，拉曼光谱仪的激发波长为785nm，通过拉曼光谱处理数据并对不同浓度的IDO定量分析；
所述S5中Au@MBN@Ag@Apt-Trp-MB复合物溶液与IDO以1：100 ~1：17（v/v）混合并进行孵育，孵育时间为10min~120min；
所述S5中通过拉曼光谱中2226 cm-1的特征峰进行不同浓度的IDO进行定量分析，得到拉曼光谱的工作曲线为y=-7.45x +3281.72，R2=0.9884。
2.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，其特征在于，所述S2中的离心条件：转速为9500rpm，时间12min。
3. 根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼技术检测吲哚胺2，3双加氧酶的方法，其特征在于，所述S1中Au NPs溶液中的Au NPs的粒径为30nm。
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