CN111337470A - 一种测定水质中大肠杆菌含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物检测技术领域，提供了一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，包括以下步骤：银‑大肠杆菌体系的制备、捕获探针的制备、加入硝酸、检测探针的制备、大肠杆菌检测标准工作曲线的建立、水质中大肠杆菌含量的测定。本发明提供了一种大肠杆菌的SERS检测方法，能特异、灵敏和快速地检测水质中大肠杆菌的含量。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种测定水质中大肠杆菌含量的方法。
背景技术
大肠埃希氏菌(Escherichia coli，简称E.coli)习惯称为大肠杆菌，是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，常随粪便从人及动物体排除，广泛散播于自然环境中，因此一旦检出大肠杆菌，即意味着样品直接或间接地被粪便污染。因此，大肠杆菌被用作饮用水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标。我国食品和饮用水的相关国家标准中就明确规定了大肠杆菌的检出限，其中我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中关于生活饮用水的大肠杆菌标准的规定，1L水中不超过3个；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过10000个。
大肠杆菌的传统检测和计数方法是MPN法(most probable number，最大可能数)，此法的基础是大肠杆菌在生长培养基上进行乳糖发酵、产气和形成吲哚，但这一方法需要6-7天的时间，已不能适应现代化品质管理的原则。
目前新的扩增技术，包括免疫测定(酶联免疫吸附法(ELISA))、核酸鉴定(聚合酶链式反应(PCR))等，都需要繁琐的操作过程，且ELISA的检测结果易受多种因素影响，易出现假阳性，不适于现场检测；高通量测序需要事先分离出细菌的DNA，除了需要专业的操作人员外，且需要昂贵的核酸扩增仪器，难以满足现场快速检测的迫切需求。
发明内容
针对这种情况，本发明提供了一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，可有效解决现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)银-大肠杆菌体系的制备
将定量体积的菌液在一定转速和时间下，离心一次，除去上清液，大肠杆菌表面存在磷壁酸和脂多糖，二者的存在致使大肠杆菌带负电。一定体积的AgNO3溶液加入其中，基于静电相互作用，Ag+吸附在大肠杆菌表面，引入还原剂后，吸附在大肠杆菌表面的Ag+原位还原生长为银纳米粒子，此时混合溶液变为墨绿色，即得银-大肠杆菌体系，并将所述混合溶液避光置于3-4℃冰箱保存备用；
(2)捕获探针的制备及对银-大肠杆菌的捕获
取一定体积、粒径的羧基磁珠，磁力作用下水洗三次，将其置于醋酸钠缓冲液中，向其中加入定量EDC溶液进行羧基活化，加入大肠杆菌单克隆抗体，磁珠表面羧基与大肠杆菌单克隆抗体的氨基发生脱水缩合，形成酰胺键，使大肠杆菌单克隆抗体连接在磁珠表面，磁力作用下水洗三次，即得捕获探针，置于4℃冰箱保存备用；
取一定体积所述捕获探针，加入到步骤(1)所述银-大肠杆菌体系中，室温条件下，将其摇床振荡孵育30-32分钟，磁力作用分离，得到银-大肠杆菌-磁珠体系；
(3)加入硝酸
在步骤(2)所述银-大肠杆菌-磁珠体系中加入一定体积的稀硝酸，并在磁力作用下，分离得到上清液，将所述上清液置于EP管中；
(4)检测探针的制备
采用具有增强效应的基底材料作为拉曼信号的增强基底，将带巯基且位于生物静默区的信号分子自组装于增强基底表面，即得检测探针，并将其置于3-4℃冰箱保存备用；
(5)大肠杆菌检测标准工作曲线的建立
配置不同浓度的大肠杆菌菌液，与所述捕获探针混合，并在磁力作用下分离，取适量上清液，加入稀硝酸得混合溶液，然后将所述混合溶液加入到所述检测探针中，静置10-12min后，校准拉曼光谱仪，进行拉曼测试，建立大肠杆菌浓度x与MBN信号分子在2228cm-1处的峰强度y的标准工作曲线；
(6)水质中大肠杆菌含量的测定
将待测实际样品简单前处理后，进行磁力作用分离，取适量上清液经稀硝酸分解后加入所述检测探针中，静置10-12min，进行拉曼测试，得到MBN信号分子在2228cm-1处的峰强度，将所述峰强度与步骤(5)中建立的标准工作曲线进行对比，确定待测实际样品中大肠杆菌的含量。
优选的，所述步骤(1)中AgNO3溶液浓度为10mM-100mM。
优选的，所述步骤(1)中还原剂包括盐酸羟胺在内的可将AgNO3还原为银纳米粒子的所有试剂。
优选的，所述步骤(2)中羧基磁珠粒径为380nm-1μm。
优选的，所述步骤(2)中醋酸钠缓冲液浓度为10mM-80mM，pH为5-7。
优选的，所述步骤(3)中稀硝酸浓度为10mM-60mM。
优选的，所述步骤(4)中具有增强效应的基底材料包括20-500nm不同粒径的金纳米球、金纳米星、金纳米花及银纳米材料。
优选的，所述步骤(4)中生物静默区信号分子，除了对巯基苯甲腈外，还包括其他一切带巯基且拉曼位置在静默区的分子。
本发明所具有的有益效果为：
(1)本发明可快速、简单地实现大肠杆菌表面银纳米材料的原位还原生长；
(2)本发明构建的静默区检测探针在生物静默区发射窄带(1-2nm)单峰的拉曼散射信号，能够有效避免其他物质的本征拉曼信号和荧光信号的干扰，准确度高；
(3)本发明制备的检测探针具有较好的光学稳定性，放置三个月，拉曼信号及性能无任何改变；
(4)本发明采用修饰有大肠杆菌单克隆抗体的磁珠作为捕获探针，一方面基于抗原-抗体的特异性相互作用，增加了检测方法的特异性；另一方面磁珠本身的磁分离性能，大幅简化了实验操作流程，缩短了检测所需时间。
附图说明
图1是本发明的流程图；
图2是本发明的标准工作曲线；
图3是本发明实施例中银-大肠杆菌体系的透射电镜图；
图4是本发明实施例中银-大肠杆菌-磁珠体系的透射电镜图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明具体实施例如下：
标准工作曲线的制定
(1)仪器与试剂
785nm激发光波长的便携式拉曼光谱仪；
银-大肠杆菌体系：采用盐酸羟胺还原法，自主合成，其透射电镜如图3；
捕获探针：羧基磁珠表面修饰大肠杆菌单克隆抗体，自主制备，其透射电镜如图4；
金纳米溶胶：采用柠檬酸钠还原氯金酸法，自主合成；
检测探针：MBN修饰的纳米金，自主制备；
不同浓度的大肠杆菌菌液，自主培养。
(2)实验步骤
将不同浓度的大肠杆菌表面原位还原生长银纳米材料，与捕获探针混合后，在磁力作用下分离，加入稀硝酸，取20μL上清液加入到80μL检测探针中，静置10min，校准拉曼光谱仪，进行拉曼测试，以检测探针中MBN信号分子在2228cm-1处的峰强度为y，大肠杆菌浓度为x建立标准工作曲线，详见图2。
实施例1
取500ml超纯水，分别向其中添加不同浓度的大肠杆菌，按照前面所述步骤和检测方法进行操作，结果见表1。
实施例2
取5000ml自来水，分别向其中添加不同浓度的大肠杆菌，按照前面所述步骤和检测方法进行操作，结果见表1。
表1超纯水和自来水中添加不同含量大肠杆菌的快速SERS检测结果。
| 实施例 | 添加值(cfu/mL) | 检出值(cfu/mL) | 回收率(％) |
| 超纯水 | 500 | 489 | 0.98 |
| 自来水 | 5000 | 5164 | 1.03 |
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)银-大肠杆菌体系的制备
将一定体积的菌液在一定转速和时间下，离心一次，除去上清液，然后加入一定体积的AgNO3溶液，涡旋后，引入还原剂，所述混合溶液变为墨绿色，即得银-大肠杆菌体系，并将所述混合溶液避光置于3-4℃冰箱保存备用；
(2)捕获探针的制备
取一定体积、粒径的羧基磁珠，磁力作用下水洗三次，将其置于醋酸钠缓冲液中，向其中加入定量EDC溶液进行羧基活化，加入大肠杆菌单克隆抗体，使大肠杆菌单克隆抗体连接在磁珠表面，磁力作用下水洗三次，即得捕获探针，置于3-4℃冰箱保存备用；
取一定体积所述捕获探针，加入到步骤(1)所述银-大肠杆菌体系中，室温条件下，将其摇床振荡孵育30-32分钟，磁力作用分离，得到银-大肠杆菌-磁珠体系；
(3)加入硝酸
在步骤(2)所述银-大肠杆菌-磁珠体系中加入一定体积的稀硝酸，并在磁力作用下，分离得到上清液，将所述上清液置于EP管中；
(4)检测探针的制备
采用具有增强效应的基底材料作为拉曼信号的增强基底，将带巯基且位于生物静默区的信号分子自组装于增强基底表面，即得检测探针，并将其置于3-4℃冰箱保存备用；
(5)大肠杆菌检测标准工作曲线的建立
配置不同浓度的大肠杆菌菌液，与所述捕获探针混合，并在磁力作用下分离，取适量上清液，加入稀硝酸得混合溶液，然后将所述混合溶液加入到所述检测探针中，静置10-12min后，校准拉曼光谱仪，进行拉曼测试，建立大肠杆菌浓度x与MBN信号分子在2228cm-1处的峰强度y的标准工作曲线；
(6)水质中大肠杆菌含量的测定
将待测水样简单前处理后，进行磁力作用分离，取适量上清液经稀硝酸分解后加入所述检测探针中，静置10-12min，进行拉曼测试，得到MBN信号分子在2228cm-1处的峰强度，将所述峰强度与步骤(5)中建立的标准工作曲线进行对比，确定待测实际样品中大肠杆菌的含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中AgNO3溶液浓度为10mM-100mM。
3.根据权利要求1所述的一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中还原剂包括盐酸羟胺在内的可将AgNO3还原为银纳米粒子的所有试剂。
4.根据权利要求1所述的一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中羧基磁珠粒径为380nm-1μm。
5.根据权利要求1所述的一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中醋酸钠缓冲液浓度为10mM-80mM，pH为5-7。
6.根据权利要求1所述的一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中稀硝酸浓度为10mM-60mM。
7.根据权利要求1所述的一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中具有增强效应的基底材料包括20-500nm不同粒径的金纳米球、金纳米星、金纳米花及银纳米材料。
8.根据权利要求1所述的一种测定水质中大肠杆菌含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中生物静默区信号分子，除了对巯基苯甲腈外，还包括其他一切带巯基且拉曼位置在静默区的分子。
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