CN109655609B - 铂-纳米花及其制备方法和应用 - Google Patents

铂-纳米花及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

铂‑纳米花及其制备方法和应用，属于食源性致病菌快速检测领域。本发明的一种靶标食源性病菌的检测方法采用具有催化硼烷氨效应的铂‑纳米花(PPN)传感器体系实现，将修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体固定在标记链霉亲和素SA的磁珠上；加入待测样品37℃恒温孵育2h，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后吸干；加入铂‑纳米花，在靶标食源性病原菌存在时磁珠上的靶标抗体与铂‑纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物；加入氢氧化钠充分释放纳米花中的纳米铂，再加入产气底物硼烷氨，激发硼烷氨分解并产生氢气，采用氢气探测仪并读取氢气浓度，利用其读数进行计算实现靶标食源性病菌浓度的测定。本发明操作简单、成本低廉、灵敏度高、特异性好。

Description

铂-纳米花及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食源性致病菌快速检测技术领域，具体涉及一种铂-纳米花及其制备方法和应用。
背景技术
近几年，食品安全问题得到了愈加广泛的关注，在所有食源性疾病致病因素包括微生物因素、化学物理以及有毒动植物因素中，微生物因素是最重要的致病因素，高居第一位。食源性病原菌作为一种常见微生物，分布极为广泛，是影响食品安全的最重要的因素之一。因此，开展食源性致病菌的快速检测研究势在必行。
目前用于检测鉴定食源性致病菌的方法主要包括传统的分离鉴定检测方法，免疫学法及分子生物学检测方法。传统培养方法如平板划线法，由于操作繁琐、所需时间长、低灵敏度等原因，已经无法满足现代检测工作中对快速便捷检测的要求。酶联免疫法(ELISA)方法容易污染，检测灵敏度受抗原-抗体结合能力影响，且需要制备高效抗体。常用的聚合酶链式反应技术(PCR)，具有较好的灵敏性，但是PCR技术需要反复的变温加热，所需仪器复杂，对操作人员技术要求较高。随着现代食品卫生及检测速度的发展要求，对食源性致病菌的检测手段要求操作简便、灵敏快速、适应性强，显然上述方法已不能满足这些要求。
自纳米技术问世以来，因其具有制备简单、价格低廉、使用寿命长及对环境要求低等优点，通常可以结合不同生物技术，提高生物传感器的灵敏度，是影响最深远的重大科技进展之一。在食品监测以及人类环境生活等领域中显示了独特的优势并得到了广泛的应用。
2012年Ge等首次发现蛋白质与无机金属盐类可以自组装形成花状的有机无机杂化纳米结构，称为纳米花。研究发现与纳米花杂化的酶同游离酶相比，杂化纳米花在酶的活性与稳定性方面表现出更加稳定优越的性能，同时作者对其形成机理做了初步探究。杂化纳米花结构一经发现，便引起了研究人员的高度关注。目前纳米花已经成功运用于多种领域，如生物传感器、生物分析、生物医药、污水处理等，但其应用范围及对象有待进一步开拓创新。因此，开发新型纳米花，在生物监测应用等领域具有广阔的应用前景。
发明内容
为了解决传统检测食源性致病菌传感器存在的成本高、设计复杂的问题，本发明提供一种操作简单、成本低廉、实用性强、灵敏度高、特异性好的一种铂-纳米花及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的铂-纳米花(PPN)，其组成成分为：纳米铂、抗菌肽、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS。
本发明还提供了上述铂-纳米花的制备方法，包括以下步骤：
取1.5mL离心管，依次加入10～100μL、0.5mg/mL纳米铂、0.01～0.1/mL抗菌肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
本发明还提供了一种含有上述铂-纳米花的具有催化硼烷氨效应的铂-纳米花传感器体系。
作为优选的实施方式，该铂-纳米花传感器体系包括修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体、链霉亲和素SA标记的磁珠、铂-纳米花、硼烷氨，用于检测靶标食源性病菌。
本发明还提供了一种采用上述的铂-纳米花传感器体系检测靶标食源性病菌的方法，主要包括以下步骤：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体；
步骤二、将修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体固定在标记链霉亲和素SA的磁珠上；
步骤三、加入待测样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后吸干；
步骤四、加入铂-纳米花，在靶标食源性病原菌存在时，磁珠上的靶标抗体与铂-纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物；
步骤五、加入3～5M氢氧化钠，释放铂-纳米花中的纳米铂；
步骤六、加入产气底物硼烷氨，激发硼烷氨分解并产生氢气，采用氢气探测仪读取气体浓度，利用气体浓度进行计算实现靶标食源性病菌浓度的测定，通过氢气探测仪作为信号输出平台对靶标食源性病菌进行检测，利用氢气探测仪氢气浓度读数对靶标食源性病菌进行定量及定性。
作为优选的实施方式，步骤二的具体过程为：
将1～10μL标记链霉亲和素SA的磁珠原液置于离心管中，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入5～15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的靶标病原菌抗体，37℃孵育1～2h，然后用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
作为优选的实施方式，步骤四的具体过程为：
加入3～10μL铂-纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，使其悬浮于10μL磷酸盐缓冲液PBS中，得到三明治夹心免疫复合物。
作为优选的实施方式，所述链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL。
作为优选的实施方式，所述磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4，其组成成分为：0.1mMNa2HPO4和0.1mM NaH2PO4。
作为优选的实施方式，步骤六中，加入硼烷氨的体积为1mL，浓度为20～50mM，反应时间为1～5min。
发明原理：如图1所示，本发明利用抗菌肽(Magainin I)和纳米铂(PtNPs)通过一步法合成铂-纳米花。Magainin I作为一种多肽，具有识别细菌表面膜蛋白功能，利用这种特性，可成功识别分离食源性致病菌靶标。纳米铂可催化硼烷氨产氢气，将其合成一种可识别致病菌特性的纳米聚合物：铂-纳米花，可以有效催化硼烷氨，且对外界条件敏感度低。利用本发明的铂-纳米花作为产气平台，可以迅速的催化硼烷氨产生大量氢气，利用氢气探测仪作为信号读取方式，用于食源性致病菌大肠杆菌O157:H7的灵敏检测，最低检测限可达10cfu/mL。
本发明的有益效果是：本发明基于氢气探测仪结合铂-纳米花传感器技术来测定食源性致病菌：大肠杆菌O157:H7，铂-纳米花具有催化硼烷氨作用，其具有以下优点：
(1)利用便携手持式氢气探测仪作为信号读取方式，利用氢气探测仪读数对靶标病原菌进行定量及定性，具有检测灵敏度高、成本低廉、实用性强等优势，可实现快速低浓度食源性致病菌：大肠杆菌O157:H7的检测。
(2)通过一步法合成铂-纳米花，操作简便，且催化效率高，稳定性及实用性好，抗外界条件能力强，敏感度低。
(3)通过磁珠的分离作用，有效消除了复杂环境的干扰，可以成功运用于实际样品中大肠杆菌O157:H7的检测，无需任何前期处理过程。
(4)用于食源性病菌大肠杆菌O157:H7的检测方法具有较好的重现性及准确度，且特异性良好，可以实现在牛奶等样品中对大肠杆菌O157:H7的检测。
(5)本发明的便携手持式氢气探测仪结合铂-纳米花传感器对食源性病原菌的检测具有操作简便，快速，灵敏特异等优势，为今后病原菌快检提供了新的潜能。在此基础上，研究新型杂化纳米花在食源性致病菌快速检测领域的应用，充分发挥其优势，规避传统检测方法弊端，在人类生物医学领域中具有重大的意义。
附图说明
图1为氢气探测仪结合铂-纳米花对食源性病原菌可视化检测原理图。
图2为本发明的铂-纳米花扫描(SEM)电镜图。其中，图2A为10μm的SEM图；图2B为2μm的SEM图。
图3为本发明氢气探测仪结合铂-纳米花检测方法对大肠杆菌O157:H7灵敏性分析结果图。其中，图3A不同大肠杆菌浓度(0cfu/mL至107cfu/mL)对产气体系的影响图，由左至右氢气探测仪读数逐渐增大；图3B为为大肠杆菌O157:H7浓度(10cfu/mL至104cfu/mL)对本发明产生氢气探测仪读数的线性分析。其中P/P0代表存在大肠杆菌靶标与不存在靶标的比值。
图4为本发明的检测方法的对大肠杆菌O157:H7的特异性分析结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本方明作进一步详细说明。下述实施例中，未进行详尽描述的试剂、方法均为常规试剂及方法。其中，所有使用的化学用品都是化学纯，所有的溶液都用超纯水配制。大肠杆菌抗体从英国的艾比康生物公司购买。抗菌肽(Magainin I)由生工生物工程上海股份有限公司合成，硫酸铜从美国奥尔德里奇公司购买、纳米铂购于北京德科岛津科技有限公司，硼烷氨从华润化工有限公司购买，标记SA磁珠从美国赛默飞世尔科技公司购买。
实施例1铂-纳米花的制备
取1.5mL离心管，依次加入10～100μL、0.5mg/mL纳米铂、0.01～0.1/mL抗菌肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
实施例2铂-纳米花的电镜扫面分析
对实施例1中所获得的铂-纳米花进行电镜扫面分析，观察其微观形态表征，结果如图2(图2A和图2B)所示，从电镜图片可以清晰地看到铂-纳米花的大小约为4μm，形状大多为花状球形结构，由此可以证明本发明所制备的铂-纳米花成花形态明显。
实施例3制备标记修饰Biotin的大肠杆菌抗体的磁珠
将1-10μL链霉亲和素SA标记的磁珠原液置于离心管中，用0.1-0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入5-15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的靶标病原菌抗体，37℃孵育1-2h，然后用0.1-0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
实施例4食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的制备
利用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7。分别准确称取各成分：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、蒸馏水50mL；在恒温摇床37℃、180转振摇过夜，超净台内分装菌液，最终分别置于4℃保存备用。
实施例5灵敏度分析
向待检液中加入3～5M氢氧化钠反应3min后，再加入1mL硼烷氨，在铂-纳米花的作用下，催化硼烷氨水解产氢气，根据产气反应的强弱，利用氢气探测仪对待检液进行定量测定。
如图3所示，验证了本发明的检测方法测定大肠杆菌O157:H7灵敏度及线性定量分析范围特性。在最佳反应条件下，靶标大肠杆菌O157:H7的浓度在10～104cfu/mL范围内的线性方程为：Y＝0.4112*X+1.112(R2＝0.989)；其中，Y表示产气浓度信号值读数，X表示大肠杆菌O157:H7浓度，单位为cfu/mL。该线性方程的线性范围是10到104cfu/mL之间，根据上述所测得的读数可知最低检测限可达10cfu/mL。
实施例6特异性试验
为了验证本发明的检测方法的特异性，如图4所示，分别选择大肠杆菌(E.coli)金黄色葡萄球菌(Sta)、李斯特菌(Lis)、沙门氏菌(Sal)以及缓冲液PBS作为对照组进行显色分析，根据试验结果，在相同的试验条件下，只有靶标大肠杆菌可产生明显的气体信号，由此证明本发明的检测方法具有很好地选择性，不会与非靶标产生特异性反应。
实施例8牛奶样品中大肠杆菌O157:H7的检测
运用本发明的检测方法对牛奶样品中的大肠杆菌O157:H7浓度(10～104cfu/mL)进行测定。具体检测过程如下：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的大肠杆菌O157:H7抗体。
步骤二、将修饰生物素Biotin的大肠杆菌O157:H7抗体固定在链霉亲和素SA标记的磁珠上：将1-10μL链霉亲和素SA标记的磁珠原液置于离心管中，用0.1-0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入5-15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的靶标病原菌抗体，37℃孵育1-2h，然后用0.1-0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
步骤三、加入待测样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1-0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后吸干。
步骤四、加入3～10μL铂-纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，使其悬浮于10μL磷酸盐缓冲液PBS中，得到三明治夹心免疫复合物。
步骤五、加入3～5M氢氧化钠反应3min后，再加入1mL硼烷氨，激发硼烷氨分解并产生氢气，根据产氢气浓度实现靶标病原菌的测定，具体的是：采用氢气探测仪读取气体浓度，利用气体浓度(即对应的线性方程中的Y值，表示产气浓度信号值)进行计算实现靶标食源性病菌浓度的测定。通过铂-纳米花能够催化硼烷氨产生氢气，结合氢气探测仪作为读取信号方式，实现了食源性致病菌大肠杆菌O157:H7菌的可视化快速检测。
利用实施例5得到线性方程进行测定并计算。结果如表1所示。通过回收率对本发明的检测方法准确性及精密度进行分析，大肠杆菌O157:H7在85.2到126.3％之间。
表1大肠杆菌O157:H7回收率测定
Figure BDA0001973458490000071
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.采用铂-纳米花传感器体系检测牛奶样品中大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述铂-纳米花传感器体系包括：修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体、链霉亲和素SA标记的磁珠、铂-纳米花、硼烷氨；所述铂-纳米花，其组成成分为：纳米铂、抗菌肽、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS；
包括以下步骤：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体；
步骤二、将修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体固定在标记链霉亲和素SA的磁珠上；
步骤三、加入牛奶样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后吸干；
步骤四、加入铂-纳米花，在大肠杆菌O157:H7存在时，磁珠上的靶标抗体与铂-纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物；
步骤五、加入3～5M氢氧化钠，释放铂-纳米花中的纳米铂；
步骤六、加入产气底物硼烷氨，激发硼烷氨分解并产生氢气，采用氢气探测仪读取气体浓度，利用气体浓度进行计算实现牛奶样品中大肠杆菌O157:H7浓度的测定，通过氢气探测仪作为信号输出平台对牛奶样品中大肠杆菌O157:H7进行检测，利用氢气探测仪氢气浓度读数对牛奶样品中大肠杆菌O157:H7进行定量及定性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铂-纳米花的制备方法，包括以下步骤：
取1.5mL离心管，依次加入10～100μL、0.5mg/mL纳米铂、0.01～0.1/mL抗菌肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二的具体过程为：
将1～10μL标记链霉亲和素SA的磁珠原液置于离心管中，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入5～15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的靶标病原菌抗体，37℃孵育1～2h，然后用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤四的具体过程为：
加入3～10μL铂-纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，使其悬浮于10μL磷酸盐缓冲液PBS中，得到三明治夹心免疫复合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4，其组成成分为：0.1mM Na2HPO4和0.1mM NaH2PO4。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤六中，加入硼烷氨的体积为1mL，浓度为20～50mM，反应时间为1～5min。
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