CN107941779A - 基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法,旨在提供一种方便、快速、高灵敏度、低成本的细菌表面增强拉曼散射(SERS)检测新技术。该方法的核心在于利用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒快速捕获尿溶液中的细菌,通过外加磁场分离、富集出细菌/金壳磁性纳米颗粒复合物,并通过滴加适配体修饰的纳米金标签材料,来实现尿液中细菌的快速检测。本发明制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒细菌的捕获效率高,适用范围广,磁响应能力强,可以快速有效的捕获尿液体系中的细菌。本发明采用的适配体修饰的纳米金材料,检测大肠杆菌的检测限达到102cells/mL。
Description
技术领域
本发明属于生物与生化光谱分析领域,涉及一种表面增强拉曼散射检测中细菌的通用方法,具体涉及一种用于细菌捕获、检测的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备及其与金核银壳纳米颗粒联用协同增强细菌拉曼信号的检测方法。
背景技术
病原菌一直以来都是人类健康的重大威胁。越早的实现细菌感染的准确诊断,患者的存活率越高。因此,准确、快速、高灵敏的鉴别、检测致病菌是防治细菌感染的关键。目前,临床医生常用的检测方法主要是传统的细菌分离培养法,但该方法耗时长,操作繁琐。新兴的一些基于分子检测的方法如核酸测序、酶联免疫吸附测定或者聚合酶链式反应等需要昂贵的仪器、成本高、检测目标单一。
表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering,以下简称SERS)是一种具有强大的振动光谱技术,可以对金、银等贵金属表面的物质进行无损和超灵敏检测,目前已被证明可用于细菌的指纹谱鉴定(参见Biosensors and Bioelectronics 94(2017)131–140)。SERS在检测细菌方面具有灵敏度高、快速、无损、无需样品处理等优点,但主要缺点是抗干扰能力较差,容易受到实际样品中杂质的干扰。为了解决这一问题,研究人员开始使用生物识别分子修饰的SERS基底从溶液中捕获出细菌后再进行检测。万古霉素被证明是一种有效、广谱的细菌识别分子,可与细菌细胞壁作用形成牢固的氢键,既可以作用于革兰阳性菌也可以捕获革兰阴性菌。如2011年中国台湾地区科学家王玉麟教授将万古霉素修饰在商业化的SERS固体基底上实现了血液中细菌的捕获检测(参见NatureCommunications.2011;2:538)。但目前报道的方法中,万古霉素都修饰在制备方法复杂的固态SERS基底上。固态SERS基底在溶液中捕获细菌的效率较低,而且价格昂贵,不适合广泛使用。液态磁性SERS基底以磁珠为核心,表面包覆一层金/银壳的SERS增强材料,特别适用于溶液中目标物质的捕获、富集与增强。目前,现有技术中尚无关于利用万古霉素修饰的磁性SERS基底快速检测尿液环境中细菌指纹谱的详细报道。
目前基于SERS检测病原菌的方法可以分为直接获取细菌的拉曼指纹信号(label-free) 和通过拉曼标签(tags)标记后间接检测细菌两大类(参见Analyst,2013.138(10):p.3005-12)。前一种方法利用SERS直接获得细菌的分子特征谱图并进行分析检测。而标记法是将细菌与一个具有很强拉曼信号的标签通过免疫或杂交等方法相连,并通过间接检测标签的信号来实现生物传感的方法(参见Chem Rev,2013.113(3):p.1391-428)。SERS标签指的是可提供良好SERS信号并易于修饰到目标物上的一些材料。这种SERS标签常以纳米级的金银颗粒作为增强基底,表面修饰上提供SERS信号的染料分子,以及可以跟菌体结合的生物识别分子 (抗体、适配体等)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法,以及一种纳米金标签材料的制备方法,并基于这两种材料的联用实现尿液中细菌的快速捕获及SERS检测。本发明利用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒快速捕获尿液中的细菌,清洗除去杂质后,再向用磁富集的金壳磁性纳米颗粒/细菌复合物中加入纳米金标签材料,后者的适配体可特异性识别细菌,且材料中的拉曼分子可表达拉曼信号。万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒既作为高效捕获细菌的工具,又作为表面增强拉曼光谱基底材料。细菌的SERS信号不是直接来源于细菌,而是来源于纳米金标签材料标记的拉曼信号分子。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:利用11-巯基十一烷酸对制备的金壳磁性纳米颗粒进行羧基化,并作为连接臂用于万古霉素的高效偶联。万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒既作为细菌快速捕获的工具,又可以联合滴加的适配体修饰的纳米金材料,可特异性识别细菌并发出拉曼信号,实现细菌的快速、高效SERS检测。
本发明第一方面提供一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒,是以粒径100-1000纳米磁性纳米颗粒为核心,在表面修饰PEI(即聚乙烯亚胺)后吸附一层密集均一的金种子,并利用盐酸羟胺还原作用使得吸附的金种子生长至连续的金壳,再以此金壳磁性纳米颗粒(Fe3O4@Au)为核心通过氨基化反应表面修饰11-巯基十一烷酸(MUA)作为连接臂,然后通过酰胺反应高效偶联上一层万古霉素。
进一步地,所述11-巯基十一烷酸(MUA)与金壳磁性纳米颗粒(Fe3O4@Au)和万古霉素之间通过共价连接。
所述金壳的厚度为1-90纳米;和/或,
所述11-巯基十一烷酸的浓度范围为0.01-100mM。
本发明第二方面提供一种如上述万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
1)通过溶剂热合成法合成粒径100-1000纳米的Fe3O4磁性纳米颗粒,并通过氨基化修饰使Fe3O4磁性纳米颗粒带上强正电。
具体地,Fe3O4磁性纳米颗粒的氨基化是将适量Fe3O4磁性纳米颗粒(例如0.01-100g,优选0.1g)加入到适量聚乙烯亚胺(即PEI)溶液(例如0.09-9000mL,优选100mL)中,超声(一般至少30分钟),使得聚乙烯亚胺自主装在Fe3O4磁性纳米颗粒表面,从而实现氨基化。
2)使步骤1)制备的氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒外吸附上一层密集的微小金纳米颗粒,并加入盐酸羟胺作为还原剂,以氯金酸为原料,制备出金壳磁性纳米颗粒(即Fe3O4@Au)。
优选地,所述微小金纳米颗粒的粒径为3-5纳米。
优选地,所述盐酸羟胺溶液浓度为0.05-100mg/mL,更优选为0.5mg/mL。
3)将步骤2)制备的金壳磁性纳米颗粒与11-巯基十一烷酸(MUA)混合,超声反应(一般1小时以上),形成羧基化的金壳磁性纳米颗粒(即Fe3O4@Au-MUA)。
优选地,所述11-巯基十一烷酸浓度为10-100微摩尔/升,更优选为50微摩尔/升。
4)将步骤3)制备的羧基化的金壳磁性纳米颗粒加入到适量(例如10mL)2-(N-吗啡啉) 乙磺酸(即MES)缓冲液中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(即EDC)和万古霉素,超声反应(一般1小时以上),即得万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒(即Fe3O4@Au-Van)。
优选地,所述MES缓冲液pH值为5-6,浓度为0.1M。
优选地,以g/mL计,所述羧基化的金壳磁性纳米颗粒与所述MES缓冲液的质量体积比为(1:10)-(1:500),更优选为1:100。
优选地,所述EDC和万古霉素使用浓度为1mg/mL。
本发明第三方面提供一种纳米金标签材料的制备方法,包括如下步骤:
1)在100-1000mL(例如100mL)水中加入0.5-5mL(例如1mL)的1%HAuCl4溶液,并加热煮沸;
2)在步骤1)煮沸的溶液中加入0.5-5mL(例如1.5mL)1%(质量分数)柠檬酸钠;
3)将步骤2)的混合溶液持续加热至颜色稳定;
4)将步骤3)的所得混合溶液加水定容(例如定容至100mL),制得纳米金;
5)用将步骤4)中所得溶液离心(一般1000-9000rpm,离心1-15min),弃上清后,用0.1-100mM的MES溶液重悬;
6)向步骤5)中制备的纳米金材料加入EDC活化;
7)向步骤6)中制备的纳米金材料加入适配体,震荡活化(一般1-360min);
8)向步骤7)中所得材料加入浓度0.1-500mM的乙醇胺,封闭(一般1-240min),制得适配体修饰的胶体金;
9)将步骤8)中的制备的适配体修饰的胶体金洗涤(一般1-5次,可用水洗涤)后加水重悬;即得纳米金标签材料。
所述纳米金标签材料,通过适配体修饰可以特异性识别细菌。
进一步地,步骤7)所述适配体为大肠杆菌适配体E1-aptamer,即
5'-NH2-C6-GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGTCTTGCTGGCGCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'。
本发明第四方面提供上述方法制备的纳米金标签材料。
本发明第五方面提供上述万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米金标签材料在表面增强拉曼散射检测细菌方面的应用。
本发明第六方面提供一种基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒表面增强拉曼散射检测细菌的方法,包括如下步骤:
将上述适量万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒投入到适量待测样本中,(室温)震荡一定时间后,通过外加磁场从待测样本中回收出所述形成金壳磁性纳米颗粒/细菌团聚物;用PBS (磷酸缓冲盐溶液)洗涤(至少两次)后,再滴加上述纳米金标签材料,(室温)震荡一定时间后,用PBS洗涤(至少两次),均匀滴加到干净的硅片表面;(室温)干燥后,硅片表面形成金壳磁性纳米颗粒/细菌团聚物/纳米金标签,利用拉曼光谱仪进行SERS检测,分析拉曼图谱信号;获得样本中待测细菌种类和细菌浓度。
优选地,以μg/mL计,所述万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与待测样本的质量体积比为(100-1):1;更优选为5:1。
优选地,所述第一次室温震荡时间为5-60分钟,更优选为30分钟,第二次室温震荡时间为5-60分钟,更优选为45分钟。
进一步地,本发明待测样本包括尿液。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)本发明提出了一种通用的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法。采用11- 巯基十一烷酸作为连接臂,可以在不同粒径的金壳磁性纳米颗粒表面高效修饰万古霉素。
(2)本发明制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒具有广谱捕获细菌的作用,细菌捕获效率高,适用范围广,磁响应能力强,作用时间短。万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒在本发明中可以实现尿溶液中细菌的快速捕获与分离。
(3)本发明依靠万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与适配体修饰的纳米金材料联合应用,通过SERS信号检测细菌的种类和浓度,检测尿液中细菌的检测限达到1.0×102cells/mL, 可在2小时内完成检测。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的合成路线图。
图2为本发明实施例1制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的透射电子显微镜图(a) 及元素分析(XPS)结果(b)。
图3为本发明实施例1制备的金壳磁性纳米颗粒及万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的磁滞曲线。
图4为本发明实施例1中制备得到的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的能谱图。
图5为本发明实施例2制备的纳米金标签材料的透视电镜表征结果。
图6是本发明实施例3中万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒捕获大肠杆菌后磁富集物的透视电镜和扫描电镜表征结果。
图7为实施例4中检测过程中形成的金壳磁性纳米颗粒/细菌/纳米金标签材料的复合物的扫描电镜图和透视电镜。
图8为实施例4中使用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料联合检测大肠杆菌拉曼信号的SERS的灵敏度图谱。
图9为实施例4中使用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料联合检测大肠杆菌拉曼信号的SERS的特异性图谱。
图10表示实施例4使用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料联合检测大肠杆菌拉曼信号的SERS的特异性图谱。
图11为实施例4中使用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料联合检测5 例尿路大肠杆菌感染实际样本的拉曼信号的SERS图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备
图1为万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒合成路线示意图。其具体的制备方法分为以下四步:第一步,采用溶剂热合成法合成Fe3O4磁性纳米颗粒。取2.5克六水合三氯化铁,1.5g 聚乙二醇8000,3克无水醋酸钠溶解在80毫升乙二醇溶液中,磁力搅拌直至反应物完全溶解。然后,将搅拌均匀的混合物转移至聚四氟乙烯高压反应釜(100毫升容量)中并加热到200℃反应12小时。反应结束后磁收集产物,分别用去离子水和乙醇各清洗2次,最后将产物60℃真空烘干备用。
第二步,制备的Fe3O4磁性纳米颗粒表面修饰一层PEI保护层,并在超声环境中通过静电吸附作用吸附一层密集均一的金种子(即微小金纳米颗粒)。最后利用盐酸羟胺还原作用使得吸附的金种子生长至连续的金壳。具体操作是将5mg金种子化的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到40mL水溶液中,超声5分钟后,依次加入20mg盐酸羟胺,200μL HAuCl4溶液(1%,wt%),并在超声作用下反应5min,磁富集后获得金壳磁性纳米颗粒(Fe3O4@Au)。
第三步,将10mg金壳磁性纳米颗粒溶解到到50mL乙醇溶液中,均匀分散后加入0.1mL 11-巯基十一烷酸(10mM),继续超声反应1小时以上,用乙醇和去离子水各清洗2次,获得巯基十一烷酸的修饰金壳磁性纳米颗粒(Fe3O4@Au-MUA)。
第四步,将10mg巯基十一烷酸的修饰金壳磁性纳米颗粒溶解在50mL MES缓冲溶液中 (0.1M,pH6.0),超声均匀分散后依次加入25mg的EDC和25mg的万古霉素,继续超声反应1小时以上。反应结束后磁收集产物,用去离子水清洗3次,即获得最终反应产物万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒(Fe3O4@Au-Van)。
图2(a)、图2(b)分别是万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的透射电子显微镜图(a) 及元素分析(XPS)结果(b),标尺为100纳米。从图2(a)中可见金壳磁性纳米颗粒分散性好,具有纳米级粗糙的金壳。
图3显示的是万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的磁滞曲线结果,200纳米金壳磁性纳米颗粒的饱和磁化强度为44.6emu/g,万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的饱和磁化强度为40.2 emu/g,表明万古霉素修饰几乎不影响金壳磁性纳米颗粒的磁性能。
图4为本实施例中制备得到的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的能谱图。Fe、Au的信号来源于金壳磁性纳米颗粒,Cu的信号来源于检测的载体铜网。
实施例2
大肠杆菌适配体修饰的纳米金标签材料,其制备方法包括如下步骤:
1)在100ml水中加入1ml的1%HAuCl4溶液,并加热煮沸。
2)在步骤1)煮沸的溶液中加入1.5ml 1%(质量分数)柠檬酸钠。
3)将步骤2)的混合溶液持续加热至颜色稳定。
4)将溶液加水定容补充至100ml。
5)用将步骤4)中制备的纳米金离心(1000-9000rpm,离心1-15min),弃上清后,用0.1-100mM的MES溶液重悬。
6)向步骤5)中制备的纳米金材料加入EDC活化。
7)向步骤6)中制备的纳米金材料添加适配体,大肠杆菌适配体E1-aptamer,
5'-NH2-C6-GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGTCTTGCTGGCGCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'。震荡活化1-360min。
8)向步骤7)中的材料加乙醇胺,浓度0.1-500mM,封闭1-240min。
9)将步骤8)中的制备的适配体修饰的胶体金洗涤1-5次后加水重悬。
图5为本实施例制备的大肠杆菌适配体修饰的纳米金标签材料的透视电镜图。
实施例3万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒捕获溶液中细菌的能力表征:
万古霉素可以与细菌细胞壁作用形成氢键(革兰阳性菌及革兰阴性菌均可),因此万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒可以在尿液中快速捕获各种细菌。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别用去离子水稀释不同倍数后,加入到10毫升玻璃瓶中。然后往每个玻璃瓶加入10微升万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒(10mg/mL),充分混合后震荡孵育30分钟,然后通过外加磁场富集出磁性复合物。通过浊度仪测定捕获细菌后溶液的浊度变化,并通过TEM电镜确定万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒在溶液中捕获细菌的效率。
图6(a)、图6(b)分别为实施例1制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒捕获大肠杆菌后磁富集物的(a)透视电镜和(b)扫描电镜表征结果。标尺分别为500纳米和2微米。
实施例4万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与胶体金标签材料联合作用快速SERS检测尿液中的大肠杆菌:
将实施例1制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒投入含有不同浓度大肠杆菌的尿液中,混合后震荡孵育30分钟,使万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒充分捕获大肠杆菌。通过外加磁场磁富集出复合物后用去离子水清洗2次除去杂质。再滴加实施例2制备的胶体金标签材料,室温震荡一定时间后,PBS洗涤两次,将磁富集物滴在干净的硅片上,烘干后再滴加上金核银壳纳米颗粒。混合溶液充分干燥后形成金壳磁性纳米颗粒/细菌/金纳米颗粒的复合物,即可用拉曼光谱仪进行SERS检测读取拉曼信号。细菌的拉曼信号来源于胶体金标签材料的拉曼分子。
图7为本实施例中使用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料联合作用增强细菌拉曼信号的检测原理图。其中,N、S分别表示外加磁场的两极,Si表示硅片,SERS 表示表面增强拉曼散射,Laser表示激光。
图8是本实施例中形成的金壳磁性纳米颗粒/细菌/金纳米颗粒的复合物的扫描电镜观察结果。图8(a)为检测过程中形成的金壳磁性纳米颗粒/细菌/纳米金标签材料的复合物透视电镜图,图8(b)为该复合物的扫描电镜图。从图8中可以看出,万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米金标签材料可以紧紧的与细菌接触在一起,布满细菌的表面,从而产生大量的SERS 热点。
图9表示本实施例的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料协同检测大肠杆菌信号的实验结果;图9(a)大肠杆菌灵敏度SERS图谱;图9(b)大肠杆菌浓度和SERS信号强度关系。从图9中可见,万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料协同作用后可以激发出典型DTNB信号,且检测细菌的检测限可以达到102cells/mL。该实验结果表明,本发明采用的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒捕获溶液中细菌后,与纳米金标签材料的拉曼信号联用可高效、快速的鉴别细菌种类并计算浓度。图9中,Raman Shift:拉曼位移;Raman Intensity:拉曼强度;E.coli:大肠杆菌。
图10表示使用万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与纳米金标签材料联合检测大肠杆菌拉曼信号的SERS的特异性图谱。在检测大肠杆菌时,本实例所述的纳米金标签材料针对大肠杆菌特异性修饰了其适配体,因而可特异性识别大肠杆菌并报告拉曼信号;而此大肠杆菌的纳米金材料在检测其他细菌时,因为没有报告拉曼信号。从而可证明本实例的纳米金材料在针对不同细菌修饰不同的适配体后,能具有良好的特异性。图10中,RamanShift:拉曼位移;Raman Intensity:拉曼强度;E.coli:大肠杆菌;K.Pneumoniae:肺炎克雷伯菌;A.baumannii:鲍曼不动杆菌;P.Aeruginosa:铜绿假单胞菌;S.epidermidis:表面葡萄球菌;blank:空白对照组。
实施例5
取5例尿路大肠杆菌感染患者的尿液样本,分别按实施例4方法及金标准方法进行检测,拉曼信号的SERS图谱结果及大肠杆菌的含量检测结果分别见图11(a)和图11(b)。图11中, Raman Shift:拉曼位移;Raman Intensity:拉曼强度。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒和纳米标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法
<130> KHP171113079.0
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
gcaatggtac ggtacttcca cttaggtcga ggttagtttg tcttgctggc gcatccactg 60
agcgcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88
Claims (10)
1.一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒,其是以粒径100-1000纳米的磁性纳米颗粒为核心,在表面修饰PEI后吸附一层密集均一的金种子,并利用盐酸羟胺还原作用使得吸附的金种子生长至连续的金壳,再将此金壳磁性纳米颗粒为核心通过氨基化反应使表面修饰11-巯基十一烷酸作为连接臂,然后通过酰胺反应连接臂上偶联上一层万古霉素。
2.根据权利要求1所述的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒,其特征在于,
所述金壳的厚度为1-90纳米;和/或,
所述11-巯基十一烷酸的浓度范围为0.01-100mM。
3.一种万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)通过溶剂热合成法合成粒径100-1000纳米的Fe3O4磁性纳米颗粒,并通过氨基化修饰使Fe3O4磁性纳米颗粒带上强正电;
2)使步骤1)制备的氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒外吸附上一层密集的微小金纳米颗粒,并加入盐酸羟胺作为还原剂,以氯金酸为原料,制备出金壳磁性纳米颗粒;
3)将步骤2)制备的金壳磁性纳米颗粒与11-巯基十一烷酸混合,超声反应,形成羧基化的金壳磁性纳米颗粒;
4)将步骤3)制备的羧基化的金壳磁性纳米颗粒加入到适量2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和万古霉素,超声反应,即得万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,
步骤1)中,Fe3O4磁性纳米颗粒的氨基化是将适量Fe3O4磁性纳米颗粒加入到适量聚乙烯亚胺溶液中,超声,使得聚乙烯亚胺自主装在Fe3O4磁性纳米颗粒表面,从而实现氨基化;和/或,
步骤2)中,所述微小金纳米颗粒的粒径为3-5纳米;和/或,所述盐酸羟胺溶液浓度为0.05-100mg/mL,更优选为0.5mg/mL;和/或,
步骤3)中,所述11-巯基十一烷酸浓度为10-100微摩尔/升,更优选为50微摩尔/升;和/或,
步骤4)中,所述MES缓冲液pH值为5-6,浓度为0.1M;和/或,以g/mL计,所述羧基化的金壳磁性纳米颗粒与所述MES缓冲液的质量体积比为(1:10)-(1:500),更优选为1:100;和/或,所述EDC和万古霉素使用浓度为1mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)通过溶剂热合成法合成粒径100-1000纳米的Fe3O4磁性纳米颗粒,并通过氨基化修饰使Fe3O4磁性纳米颗粒带上强正电;具体地,Fe3O4磁性纳米颗粒的氨基化是将0.1g的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到100mL聚乙烯亚胺溶液中,超声,使得聚乙烯亚胺自主装在Fe3O4磁性纳米颗粒表面,从而实现氨基化;
2)使步骤1)制备的氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒外吸附上一层密集的微小金纳米颗粒,并加入盐酸羟胺作为还原剂,以氯金酸为原料,制备出金壳磁性纳米颗粒;所述微小金纳米颗粒的粒径为3-5纳米;所述盐酸羟胺溶液浓度为0.5mg/mL;
3)将步骤2)制备的金壳磁性纳米颗粒与11-巯基十一烷酸混合,超声反应,形成羧基化的金壳磁性纳米颗粒;所述11-巯基十一烷酸浓度为10-100微摩尔/升,优选为50微摩尔/升;
4)将步骤3)制备的羧基化的金壳磁性纳米颗粒加入到适量2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和万古霉素,超声反应,即得万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒;所述MES缓冲液pH值为5-6,浓度为0.1M;所述羧基化的金壳磁性纳米颗粒与所述MES缓冲液的质量体积比为(1:10)-(1:500),优选为1:100;所述EDC和万古霉素使用浓度为1mg/mL。
6.权利要求3-5所述方法制备的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒。
7.一种纳米金标签材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)在100-1000mL水中加入0.5-5mL的1%HAuCl4溶液,并加热煮沸;
2)在步骤1)煮沸的溶液中加入0.5-5mL的1%柠檬酸钠;
3)将步骤2)的混合溶液持续加热至颜色稳定;
4)将步骤3)的所得混合溶液加水定容,制得纳米金;
5)用将步骤4)中所得溶液离心,弃上清后,用0.1-100mM的MES溶液重悬;
6)向步骤5)中制备的纳米金材料加入EDC活化;
7)向步骤6)中制备的纳米金材料加入适配体,震荡活化;
8)向步骤7)中所得材料加入浓度0.1-500mM的乙醇胺,封闭,制得适配体修饰的胶体金;
9)将步骤8)中的制备的适配体修饰的胶体金洗涤后加水重悬;即得纳米金标签材料;
优选地,步骤7)所述适配体为大肠杆菌适配体E1-aptamer,即
5'-NH2-C6-GCAATGGTACGGTACTTCCACTTAGGTCGAGGTTAGTTTGTCTTGCTGGCGCATCCACTGAGCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'。
8.权利要求7所述方法制备的纳米金标签材料。
9.权利要求1-2、6任一项所述万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒以及权利要求8所述的纳米金标签材料在表面增强拉曼散射检测细菌方面的应用。
10.一种基于万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒表面增强拉曼散射检测细菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将适量权利要求1-2、6任一项所述的万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒投入到适量待测样本中,震荡一定时间后,通过外加磁场从待测样本中回收出所述形成金壳磁性纳米颗粒/细菌团聚物;用PBS洗涤后,再滴加权利要求8所述纳米金标签材料,震荡一定时间后,用PBS洗涤,均匀滴加到干净的硅片表面;干燥后,硅片表面形成金壳磁性纳米颗粒/细菌团聚物/纳米金标签,利用拉曼光谱仪进行SERS检测,分析拉曼图谱信号;获得样本中待测细菌种类和细菌浓度;
优选地,以μg/mL计,所述万古霉素修饰的金壳磁性纳米颗粒与待测样本的质量体积比为(100-1):1;更优选为5:1;和/或,
优选地,所述第一次室温震荡时间为5-60分钟,更优选为30分钟,第二次室温震荡时间为5-60分钟,更优选为45分钟;和/或,
待测样本包括尿液。
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