CN109813701A - 一种快速无标签表面增强拉曼散射检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速无标签表面增强拉曼散射检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的方法。本发明中适配体用于结合目标菌并且作为模板，介导纳米银粒子的原位合成。包覆聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米颗粒通过静电吸引用于细菌的有效捕获和富集，特定的SERS谱随着Fe₃O₄@PEI‑细菌‑银纳米粒子复合物的形成而增强，从而达到特定的目标细菌无标记检测。本发明聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒可以快速从溶液中捕获和分离细菌，捕获效率高。检测灵敏度可达10²cfu/mL，检测时间小于30分钟。该方法特异性强、稳定性好、操作简便、成本低，可用于不同的病原菌鉴别，对血液样品同样有效。该方法是用于临床和食品安全中的病原菌检测一种很有前途的工具。

Description

一种快速无标签表面增强拉曼散射检测金黄色葡萄球菌和大 肠埃希菌的方法

技术领域

本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及一种快速无标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法。

背景技术

与细菌相关的疾病，如霍乱、败血症和感染性腹泻，一直是主要的公共卫生威胁，造成高死亡率和高经济损失。世界卫生组织声明每年有超过170万人死于这些细菌疾病。抗生素对大多数致病菌仍然有效，但是近年来，一些耐药菌出现并传播，从而导致情况恶化。用于细菌的早期检测从而指导合理使用抗生素的检测技术应被开发。

目前有许多方法用于细菌的定性和定量检测，如平板培养、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)、测序及质谱。然而，这些方法也有缺点。例如,平板培养，复杂、耗时，并且很容易出现手工错误；PCR，在核酸扩增过程中容易出现假阴性或阳性；ELISA，需要多步化学试剂和免疫反应；DNA测序和质谱分析可以实现准确的微生物学鉴定，但过程繁琐，设备昂贵，需要操作人员技术精湛，从而限制了在现场检测中的应用。

近年来，表面增强拉曼散射(SERS)通过“整个有机体指纹”进行细菌鉴定已成为一种新的研究方向。基于表面增强拉曼散射的细菌分析方法的优点是:无需培养，灵敏度高，快速检测，无损数据采集，操作方便，指纹识别检测(无标签)。SERS通过可以二次增强表面电磁场的金银作为表面活性基底材料来增强了细菌固有的振动指纹。目前有三种方法：(1)胶体金或者胶体银活性纳米材料与细菌混合；(2)对SERS底物进行修饰以捕获细菌；(3)在细菌上直接合成银纳米粒子。这些方法都可以得到典型的SERS谱细菌。然而，在复杂的临床样本中，无标记SERS检测比较容易受到干扰。需要繁琐的样品预处理来减少来自其它组分复杂的光谱干扰。此外,细菌无标记SERS检测方法通常缺乏选择性和特异性，很难应用到含有多种细菌的样品中。

核酸适配体是通过核酸的系统指数富集进化而得到的配体(SELEX)，是单链DNA或RNA能够与靶结合的分子，具有较高的特异性和亲和力。适配体可以通过化学方法合成，而且比抗体更加稳定，因此，它们是低成本的。许多细菌寡核苷酸适配子,包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，单核增生李斯特菌和沙门氏菌已被识别并作为生物识别分子用于特定病原体的检测。目前有报道基于核酸适配体原位还原纳米银的方法，用于无标记SERS的检测特异性病原体，适配体和细菌的特异性识别获得了特定细菌的高质量SERS光谱。但是这种方法应用于复杂样品仍然存在需要多级样品预处理和离心分离的问题。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，本发明提出了一种灵敏、特异的SERS的技术，一种快速、无标签的适配体识别与磁分离相结合的细菌检测方法。

本发明中适配体用于结合目标菌并且作为模板，介导纳米银粒子的原位合成。包覆聚乙烯亚胺(PEI)的Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄@PEI MNPs)通过静电吸引用于细菌的有效捕获和富集，特定的SERS谱随着Fe₃O₄@PEI-细菌-银纳米粒子复合物的形成而增强，从而达到特定的目标细菌无标记检测。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速无标签表面增强拉曼散射检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的方法,按照如下步骤进行：

1)将细菌特异性核酸适配体添加到测试细菌的样品中孵育,使核酸适配体分子特异性地与目标细菌表面结合；

2)将聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒添加到细菌样品中，利用带正电荷的聚乙烯亚胺壳层和带负电荷细菌-适配体复合物的相互吸引作用，捕获细菌-适配体复合物；

3)用外部磁铁分离出聚乙烯亚胺的Fe₃O₄-细菌-适配体纳米粒子复合物，使其吸附银离子并加入NaBH₄，将银离子还原成银纳米粒子并沉积在细菌的表面，从而形成聚乙烯亚胺的Fe₃O₄-细菌-适配体-银纳米粒子复合物；

4)将聚乙烯亚胺的Fe₃O₄-细菌-适配体-银纳米粒子复合物干燥后进行SERS检测，获得与适配体结合的细菌的SERS光谱，从而达到特定的目标细菌无标记检测。

本发明还公开了该检测方法在检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌中的应用，按照如下步骤进行：

1)制备聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒：通过改进的溶胶-热反应合成超顺磁性Fe₃O₄纳米粒，将制备好的聚乙烯亚胺与聚乙烯亚胺溶液等体积混合，超声30min，聚乙烯亚胺逐渐自组装在磁性Fe₃O₄纳米粒表面，去离子水冲洗三次，在4℃保存备用；

2)将1毫升的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌菌液中加入适配子共同孵育20分钟；

3)加3μL聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒到步骤2)混合液中孵育,在室温下以800rpm速度摇动10分钟，随后，磁性收集Fe₃O₄@PEI-细菌-适配体复合物，PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)洗涤2次；

4)聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒-细菌-适配体复合物被转移到埃普多夫管,加入100μL 10mM硝酸银溶液,漩涡1分钟，然后在埃普多夫管中加入100μL NaBH₄再漩涡1分钟；

5)聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒-细菌-适配体@Ag被磁富集并滴在硅基片上进行SERS光谱的测量。

优选地，所述步骤2)中细菌特异性核酸适配体的浓度为300nm。

优选地，所述步骤5)采用正交偏最小二乘判别分析化学计量学方法准确观察不同细菌的指纹SERS图谱的差异。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒可以快速从溶液中捕获和分离细菌，捕获效率高(>96％)。检测灵敏度可达10²cfu/mL，检测时间小于30分钟。该方法特异性强、稳定性好、操作简便、成本低，可用于不同的病原菌鉴别，对血液样品同样有效。因此，该方法是可以用于临床和食品安全中的病原菌检测一种很有前途的工具。

附图说明

图1为Fe₃O₄@PEI MNPs性能表征图；其中A为Fe₃O₄MNPs的TEM照片，B为Fe₃O₄@PEIMNPs的TEM照片，C为相应放大PEI壳层的HRTEM图像，D为Fe₃O₄和Fe₃O₄@PEI的磁滞曲线，E为Fe₃O₄，Fe₃O₄@PEI,S.aureus以及金黄色葡萄球菌适配体复合物的Zeta电位统计结果图。

图2为Fe₃O₄@PEI的捕获效率图；其中A为形成的Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌复合物的TEM图像，B-D为血琼脂平板显示捕获Fe₃O₄@PEI后上清液中剩余金黄色葡萄球菌的数量图(以Fe₃O₄MNPs为对照)，E为Fe₃O₄@PEI对金黄色葡萄球菌的捕获效率图(***P<0.001)，F为Fe₃O₄@PEI MNPs对金黄色葡萄球菌在PBS缓冲液中不同ph值下的捕获效率图(误差条表示三个测量值的标准差)。

图3为不同适配体浓度形成的Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-银混合物的TEM图像。其中A为0nM，B为100nM，C为200nM，D为300nM，E为不同适配体浓度形成的Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-银混合物的SERS光谱图。

图4中A为来自Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物的不同浓度金黄色葡萄球菌的SERS光谱，B为不同浓度的金黄色葡萄球菌的Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物在733cm^-1处的SERS光谱校准曲线。

图5中A为形成Fe₃O₄@PEI-大肠埃希菌-纳米银粒子复合物的TEM图，B为来自Fe₃O₄@PEI-大肠埃希菌-纳米银粒子复合物的不同浓度大肠埃希菌的SERS光谱图，C为2D-PCA图显示金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的鉴别情况图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例所采用的试剂及仪器如下：

1.试剂：硼氢化钠(NaBH₄)，硝酸银(AgNO₃)，四氯金酸(HAuCl₄·4H2O)，氯化铁(FeCl₃.6H₂O)，柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，氯化钠(NaCl)从上海化学试剂有限公司(中国)采购。

分支PEI(MW 25kDa)和聚乙烯吡咯烷酮(MW 40kDa)分别来自美国Sigma-Aldrich公司。

水在使用前经微孔毫Q净化系统(18.2MΩ厘米^-1)纯化。

金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌来自徐州医科大学附属医院。金黄色葡萄球菌的适配体(aptamerSa)和大肠埃希菌(E.coli)的适配体(AptamerE)是由上海生工生物技术公司合成的。其序列如下：

AptamerSa:GCAAT GGTAC TTCCA CTTAG GTCGA GGTTA GTTTG TCTTG CTGGC GCATCCACTG AGCGC AAAAG TGCAC GCTAC TTTGC TAA；

AptamerE:GCAAT GGTAC GGTAC TTCCT CGGCA CGTTC TCAGT AGCGC TCGCT GGTCATCCCA CAGCT ACGTC AAAAG TGCAC GCTAC TTTGC TA。

2.仪器：透射电镜(TEM)图像是用日立公司H-7650透射电镜在瞬变电磁法加速电压为80kv及分辨率为JEOL-2010，加速电压为200kv的条件下拍摄的。

动态光散射采用布鲁克海文Zeta PALS仪器对制备纳米粒子和细菌样品的电势进行了测量。

Fe₃O₄@PEI的磁性能是通过超导量子干涉装置磁力仪(SQUID,MPMSXL-7 300k)进行研究的。

用日本岛津公司2600光谱仪测量紫外可见光谱。

用便携式拉曼光谱拉曼系统(B&W Tek,i-Raman Plus BWS465-785H光谱仪)记录拉曼光谱。所有的细菌用功率为25mw的785纳米激光对样品进行激发，共激发出样品每个SERS谱的采集时间为20秒。每个样品收集五个光谱求平均以确保信号的重现性。

实施例1 金黄色葡萄球菌和革兰阴性大肠埃希菌的检测

1)Fe₃O₄@PEI MNPs的制备：Fe₃O₄@PEI MNPs的合成采用两步法，首先，通过改进的溶胶-热反应合成了超顺磁性Fe₃O₄MNPs(200nm)。其次，将制备好的10mL Fe₃O₄MNPs(1mg/mL)与10mL PEI溶液(5mg/mL)混合，超声30min，在此过程中PEI逐渐自组装在Fe₃O₄MNPs表面。所得Fe₃O₄@PEI MNPs用去离子水冲洗三次，加入去离子水1ml在4℃保存备用。

2)细菌样本的制备：采用普通平板计数法测定细菌浓度。将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌在37℃的Luria-Bertani(LB)中培养5小时。然后将0.1mL LB培养基的菌体稀释1×10⁵涂于琼脂板上，37℃过夜培养。最后,计算集落形成单位(CFUs)的数量。

3)Fe₃O₄@PEI MNPs捕获细菌的效率:首先准备好10⁴cfu/mL浓度的细菌样品。然后,3μL Fe₃O₄@PEI加入1毫升的准备的细菌样本中共同孵育。在不同时间(0-30分钟)的振荡后，Fe₃O₄@PEI和细菌混合物被磁性吸引地集中在管的底部。之后,从每组中取100μL上层清液均匀地涂在琼脂板在37度过夜培养。通过计算每组细菌菌落数来得出Fe₃O₄@PEI MNPs捕获细菌的效率。

4)SERS测量:1毫升的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌菌液中加入300nM适配子(aptamerSa为金黄色葡萄球菌组和aptamerE为大肠埃希菌组)共同孵育2分钟。然后,加3μLFe₃O₄@PEI到上述混合液中孵育,在室温下摇晃(800rpm)10分钟。随后，磁性收集Fe₃O₄@PEI-细菌-适配体复合物，PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)洗涤2次。Fe₃O₄@PEI-细菌-适配体复合物被转移到一个新的埃普多夫(EP)管,然后加入100μL硝酸银溶液(10mM),强烈漩涡1分钟。随后,在EP管中加入100μL NaBH4再强烈漩涡1分钟。Fe₃O₄@PEI-细菌-适配体@Ag被磁富集并滴在硅基片上进行SERS光谱的测量。

实施例2 检测原理说明和Fe₃O₄@PEI MNPs特征描述

上述检测方法工作原理是基于核酸适配体的纳米银粒子的原位合成和Fe₃O₄@PEIMNP磁富集相结合来检测特定细菌。首先，将核酸适配体添加到测试细菌的样品中孵育。在这一过程中，许多核酸适配体分子可以特异性地与目标细菌表面结合。细菌表面结合的核酸适配体能吸附银离子附着在磷酸二酯基核苷酸上，并作为纳米银粒子原位位点。其次，将Fe₃O₄@PEI MNPs添加到细菌样品中以有效地捕获细菌-适配体复合物。基于静电原理，细菌-适配体复合物可以在短时间内快速与Fe₃O₄@PEI MNPs结合，由于带正电荷的PEI壳层和带负电荷细菌-适配体复合物之间的相互吸引作用。然后，用外部磁铁将生成的Fe₃O₄@PEI-细菌-适配体复合物从溶液中分离出来。后吸附银离子并加入NaBH₄，将银离子还原成银纳米粒子并迅速沉积在细菌的表面，从而形成Fe₃O₄@PEI-细菌-适配体-银纳米粒子复合物。在空气中干燥后，迅速而灵敏测量SERS检测。最重要的是，只能获得与适配体结合的细菌的SERS光谱，从而达到特定的目标细菌无标记检测。

图1显示了Fe₃O₄@PEI MNPs的主要特性。图1A为溶胶-热反应合成的Fe₃O₄纳米粒子的TEM图像，Fe₃O₄纳米粒子的直径约为200纳米，具有明显的分散性。亲水性PEI可以快速地组装在Fe₃O₄MNPs表面形成一个带正电荷的薄壳，进一步提高磁性颗粒的分散性(图1B)。HRTEM图像可以清晰地观察到PEI壳体，表明在30min超声处理下，PEI壳体厚度约为2.2nm(图1C)。这种涂覆在Fe₃O₄MNP上的超薄PEI外壳对其磁性有轻微的影响。图1D显示Fe₃O₄和Fe₃O₄@PEI MNPs的饱和磁化强度(MS)值分别为85.4和65.75emu g^-1。这一结果证实了PEI涂层后只有低MS值降低。高磁铁含量(约66.75wt％)使Fe₃O₄@PEI MNPs能够快速和完全地从样品溶液中分离出来。

采用X射线衍射(XRD)方法对Fe₃O₄@PEI MNPs晶体结构进行研究。PEI是一种阳离子聚合物，具有众多的氨基，PEI能自组装在纳米颗粒上达到表面氨基化。由图1E可以看出Fe₃O₄颗粒用PEI涂层包裹后的Zeta电位由-24.9增加到+51.6mV。

实施例3 Fe₃O₄@PEI MNPs的细菌捕获效率

细菌外膜上有大量的磷酸基和羧基取代基，在pH值5.0-9.0范围内，许多常见的病原体都带负电荷。因此，强正电荷Fe₃O₄@PEI MNPs可以通过静电相互作用与细菌快速结合，并可通过外加磁场快速收集。金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌适配体的Zeta电位分别为-26.6mV和-28.5mV(图1E)，说明金黄色葡萄球菌与适配体的特异性结合并不影响细菌的电学性质。

Fe₃O₄@PEI MNPs首先与1mL金黄色葡萄球菌溶液(10⁴cfu/mL)孵育。孵育不同时间(0-20分钟),Fe₃O₄@PEI-细菌复合物用磁收集,然后取100μL上层清液均匀涂在血琼脂培养板上，在37℃恒温箱中过夜培养，计数细菌菌落数来计算Fe₃O₄@PEI的细菌捕获效率。图2A为Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌复合物形成的TEM图像，并清楚地证明Fe₃O₄@PEI MNPs可以有效地从溶液中捕获金黄色葡萄球菌。上清液中残留的细菌在血琼脂上生长，计数形成的CFUs，计算捕获效率。此外，血平板照片显示金黄色葡萄球菌大部分被Fe₃O₄@PEI MNPs捕获，而Fe₃O₄MNPs组捕获能力较低(图2B-D)。菌落计数结果表明，孵育10min后，Fe₃O₄@PEI对金黄色葡萄球菌的捕获效率为96.9％。此外，随着孵育时间的增加，上清液中金黄色葡萄球菌的数量迅速下降。pH值是另一个重要因素，因为Fe₃O₄@PEI MNPs捕获病原体是由静电相互作用驱动的。在不同pH值的PBS溶液上进行平行实验。图2F中pH值在5-9范围内对细菌的捕获没有明显的pH影响。这些结果表明Fe₃O₄@PEI MNPs可以在较宽的pH范围内快速有效地捕获细菌。

实施例4 适配体浓度选择

核酸适配体是通过体外筛选得到的单链核酸分子，可以通过范德华力、氢键、疏水等非共价键与目标细菌结合。本检测方法中将核酸适配体与特定细菌结合，作为银纳米粒子原位还原的位点。依赖于核酸适配体和目标细菌的特异性识别，可以很容易获得细菌的特殊SERS指纹。如图1B所示，一个细菌可以结合许多适配体分子，而这些适配体分子是带负电荷的可以吸附银离子作为成核位点，进一步合成银纳米粒子。因此,适配体浓度是细菌表面原位合成银纳米粒子的关键因素。制备了金黄色葡萄球菌样品(10⁷cfu/mL)和不同浓度的金黄色葡萄球菌的aptamerSa(0-300nm)加入到这些样品溶液中，评估其影响结合适配体的数量。Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物的制备按照材料和方法部分的描述进行。图3A-D显示与不同浓度适配体作用生成的Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物的TEM图像。这些图像显示了在细菌表面的银纳米粒子的数量和大小随着适配体用量(0到300nM)增加而增加。Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物被滴到硅上来检测金黄色葡萄球菌的SERS信号。如图3E所示不同适配体浓度形成的Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-银混合物的SERS光谱。金黄色葡萄球菌的特征拉曼峰在654、733、958、1326、1458和1577cm^-1可以清晰区分。Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物的SERS信号随着适配体浓度的增加而增加，并在300nM时达到峰值。确保检测结果灵敏度高，稳定性好，选择适配体浓度为300nM。

实施例5 Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物的细菌SERS检测

用浓度为300nM适配体和AgNO₃浓度进一步验证了无标签SERS平台检测细菌的灵敏度。浓度从10⁷cfu/mL至0cfu/mL的金黄色葡萄球菌的悬浮液采用连续稀释法制备。经过适配体结合、磁性富集和银纳米粒子原位还原，采用便携式拉曼系统测量SERS。图4A为来自Fe₃O₄@PEI-金黄色葡萄球菌-纳米银粒子复合物的不同浓度金黄色葡萄球菌的SERS谱。金黄色葡萄球菌的SERS信号强度随着细菌数量的增加而增加(10²-10⁷cfu/mL)。主拉曼谱带在733cm^-1处可以很容易地分辨出来，甚至可以分辨出浓度低至10²cfu/mL金黄色葡萄球菌的主拉曼谱带。每个样品测量五次并统计，根据细菌浓度的对数绘制得到金黄色葡萄球菌检测的剂量-反应曲线(多项式拟合，图4b)。图4B中的误差条显示了五个测量值的标准差。从金黄色葡萄球菌中随机检测20个测试点，获得了较为均匀的SERS谱，相对标准偏差值小于12.6％，结果表明该无标签检测细菌系统具有良好的重复性。

实施例6 利用所提出的无标签系统进行病原菌鉴定

制备大肠埃希菌样品，检测过程如上所述。图5A显示Fe₃O₄@PEI MNPs也可以有效捕获大肠埃希菌-适配体复合物，我们的方法形成了Fe₃O₄@PEI-大肠埃希菌-纳米银粒子复合物。Fe₃O₄@PEI-大肠埃希菌-纳米银粒子复合物的SERS光谱强度随着大肠埃希菌浓度的降低而降低(图5B)。获得的大肠埃希菌的典型拉曼光谱，大肠埃希菌浓度低至10²cfu/mL也可以呈现出731cm^-1处的主峰。

在我们的磁辅助的无标记策略中，使用Fe₃O₄@PEI MNPs可以很容易地捕获、分离和纯化复杂样品中的细菌。因此，Fe₃O₄@PEI-细菌-银纳米粒子复合物的形成完全不受复杂环境的影响。血样和PBS溶液中细菌的相对浓度非常接近，说明该方法可以应用于生物实际样品。此外，Fe₃O₄@PEI MNPs获得的拉曼光谱与小鼠血液中的其他细菌(铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌)发生反应，没有显示SERS信号，表明干扰细菌不影响SERS检测。

由于不同细菌的组成成分非常相似不同细菌的SERS指纹图谱的差异不大。之前的许多研究说明利用主成分分析(PCA)可以实现对细菌快速分析以及对不同细菌的准确鉴别。本发明采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)化学计量学方法准确观察不同细菌的指纹SERS图谱的差异。OPLS-DA是使用SIMCA 14.1的软件来实现(Umetrics,Umea，瑞典)。将原始数据和规范化数据取平均值并通过单位方差进行处理。图5C给出了通过OPLS-DA分析处理后金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌结果的明显趋势。两种类型细菌的数据点被分成两组，表明来从不同的Fe₃O₄@PEI-细菌-银纳米粒子复合物的SERS指纹可以快速、清晰地区分出来。将无标签系统与OPLS-DA相结合是潜在的强大工具，可以用来检测和鉴别实际样品中不同类型的细菌。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种快速无标签表面增强拉曼散射检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的方法,其特征在于，按照如下步骤进行：

1)将细菌特异性核酸适配体添加到测试细菌的样品中孵育,使核酸适配体分子特异性地与目标细菌表面结合；

2)将聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒添加到细菌样品中，利用带正电荷的聚乙烯亚胺壳层和带负电荷细菌-适配体复合物的相互吸引作用，捕获细菌-适配体复合物；

3)用外部磁铁分离出聚乙烯亚胺的Fe₃O₄-细菌-适配体纳米粒子复合物，使其吸附银离子并加入NaBH₄，将银离子还原成银纳米粒子并沉积在细菌的表面，从而形成聚乙烯亚胺的Fe₃O₄-细菌-适配体-银纳米粒子复合物；

4)将聚乙烯亚胺的Fe₃O₄-细菌-适配体-银纳米粒子复合物干燥后进行SERS检测，获得与适配体结合的细菌的SERS光谱，从而达到特定的目标细菌无标记检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

1)制备聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒：通过改进的溶胶-热反应合成超顺磁性Fe₃O₄纳米粒，将制备好的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒与聚乙烯亚胺溶液等体积混合，超声30min，聚乙烯亚胺逐渐自组装在磁性Fe₃O₄纳米粒表面，去离子水冲洗三次，在4℃保存备用；

2)将1毫升的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌菌液中加入适配子共同孵育20分钟；

3)加3μL聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒到步骤2)混合液中孵育,在室温下以800rpm速度摇动10分钟，随后，磁性收集Fe₃O₄@PEI-细菌-适配体复合物，PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)洗涤2次；

4)聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒-细菌-适配体复合物被转移到埃普多夫管,加入100μL 10mM硝酸银溶液,漩涡1分钟，然后在埃普多夫管中加入100μL NaBH₄再漩涡1分钟；

5)聚乙烯亚胺的Fe₃O₄磁性纳米粒-细菌-适配体@Ag被磁富集并滴在硅基片上进行SERS光谱的测量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中细菌特异性核酸适配体的浓度为300nM。

4.根据权利要求2-3所述的方法，其特征在于，所述步骤5)采用正交偏最小二乘判别分析化学计量学方法准确观察不同细菌的指纹SERS图谱的差异。