CN112858257A - 一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器 - Google Patents

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CN112858257A CN202110351541.9A CN202110351541A CN112858257A CN 112858257 A CN112858257 A CN 112858257A CN 202110351541 A CN202110351541 A CN 202110351541A CN 112858257 A CN112858257 A CN 112858257A
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胡晓迪
蒋兰
史沁灵
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Abstract

本发明涉及致病菌检测技术领域，具体涉及一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，包括磁性纳米粒子形成的内核，内核外包裹有用于增强拉曼光谱的纳米外壳，所述纳米外壳外附着有内标分子，内标分子上偶联有探针。本方案的传感器可以解决基于拉曼光谱法的致病菌检测传感器结构复杂和制备过程冗长的技术问题。本方案的传感器可以应用于食源性致病菌的检测的实践操作中，以满足现今社会对快销食品的快速、准确及现场检测的需求。

Description

一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器
技术领域
本发明涉及致病菌检测技术领域，具体涉及一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器。
背景技术
食源性致病菌引发的食品安全事件一直是公共卫生领域关注的焦点。由金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠杆菌等细菌性食物中毒引起的疾病在我国约占食品安全事件的30％～90％，也是世界范围内的主要公共卫生问题。食源性致病菌的检测技术目前主要有：1)传统培养检测技术，根据致病菌生长繁殖的特性，利用选择性培养基对其进行筛选和分离，再结合形态学特征和生理生化特性对其进行鉴定；2)分子检测技术，包括常规的PCR技术、多重PCR技术、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)等；3)免疫学检测技术，包括酶联免疫吸附、免疫荧光技术、免疫胶体金技术等。上述现有检测技术一般都需送检到专业的实验室进行检测，需要大型仪器设备，检测过程复杂、耗时较长，而且如果检验样本中有与目标致病菌相互竞争的其他物质存在时,常出现假阳性结果，已不能满足现今社会对快销食品的快速、准确及现场检测的需求。
基于分子振动散射光波长变化的拉曼光谱可获取分子结构的指纹信息，具有强大的分子识别能力，同时具有非标记、非接触的特点，是分子信息动态监测的理想手段。早期拉曼光谱由于大多数分子的拉曼散射截面很小，其拉曼散射光信号十分微弱而难以实际应用，现在人们利用金属纳米粒子或纳米结构，建立起表面增强拉曼光谱(SERS)技术，可实现单分子水平的高灵敏检测。拉曼光谱技术在食品安全检测领域已显示出巨大的应用潜力，在这方面的科学研究也越来越广泛和深入。Junfeng Wang,Xuezhong Wu,Chongwen Wang等人在公开文献Magnetically Assisted Surface-Enhanced Raman Spectroscopy for theDetection of Staphylococcus aureus Based on Aptamer Recognition(ACS AppliedMaterials Interfaces，2015，7(37):20919-29.)中，利用磁分离技术和适体(适配体)技术捕获细菌，涂有银的磁性纳米颗粒作为拉曼基底，AuNR-DTNB@Ag-DTNB核壳等离子NP作为增强拉曼信号的信号分子，形成特殊的三明治夹心结构，使用传统的拉曼光谱法，可以对金黄色葡萄球菌进行检测。尽管利用磁分离和适配体技术可以提高细菌的捕获率，但是该三明治夹心结构传感器所需原材料很多，制备步骤十分麻烦、制备过程冗长。
发明内容
本发明意在提供一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，以解决基于拉曼光谱法的致病菌检测传感器结构复杂和制备过程冗长的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，包括磁性纳米粒子形成的内核，所述内核外包裹有用于增强拉曼光谱的纳米外壳，所述纳米外壳外附着有内标分子，所述内标分子上偶联有探针。
本方案的原理及优点是：本方案的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器(MB@M-S-A)包含磁性纳米粒子内核(MB)、具有拉曼增强功能的纳米外壳(M)、拉曼内标分子(S)、致病菌捕获探针(A)四种元件。采用多功能集成拉曼纳米传感器(MB@M-S-A)进行食源性致病菌检测时，首先将多功能集成拉曼纳米传感器(MB@M-S-A)与食品试样进行孵育，使MB@M-S-A结合捕获食品试样中的致病菌，并利用磁分离技术，得到富集、浓缩致病菌的MB@M-S-A溶液；然后，对浓缩致病菌的MB@M-S-A溶液进行拉曼光谱检测，分别获取致病菌特征拉曼峰和内标分子特征拉曼峰的信号强度(Ipb、Is)，由两者的比值(Ipb/Is)，对样品中的致病菌进行定量分析。
本方案在传感器中引入内标，根据定量峰与内标峰的相对强度值和目标物浓度之间的关系曲线对样品中目标物进行SERS定量分析。在实际分析过程中，由于食品基质的影响，SERS信号波动性较大，食源性致病菌的分析重现性欠佳。为减少假阳性结果的发生，提高定量结果的重现性，嵌入内标的方法开始出现。该法在SERS活性基底内部嵌入常见的拉曼探针分子，并以其作为内标分子进行定量分析。嵌入内标分子是可独立于基底结构存在的，不参与食源性致病菌吸附检测过程的。内标分子的存在可以用来标准化由于拉曼激光强度波动、基底活性不均、测量环境改变等不稳定因素引起的全光谱强度变化，使定量结果更为可靠准确。在本方案中，内标分子不但可实现稳定SERS信号的作用，还可以将探针分子固定在纳米外壳上，简化了传感器的结构，一举两得。本方案的传感器可以克服上述问题，并且使得传感器结构变得简单，进而解决了基于拉曼光谱法的致病菌检测传感器结构复杂和制备过程冗长的技术问题。
综上所述，本方案的有益效果如下：
(1)本发明提供的传感器，针对常见的食源性致病菌传感器重现性差的技术难点，嵌入的内标分子可以确保食源性致病菌检测的重现性。它的拉曼特征峰信号不对食源性致病菌SERS信号产生干扰，而且含量明确、分布均一，可以用来标准化由于拉曼激光强度波动、基底活性不均、测量环境改变等不稳定因素引起的全光谱强度变化，使定量结果更为可靠准确。内标分子和捕获探针通过共价偶联，可以使内标分子与捕获探针一对一牢固连接，确保捕获探针的组装，并达到较高的表面密度，而且确保该传感器能长期稳定和抗干扰，可实现对食源性致病菌的灵敏准确检测。
(2)本发明提供的传感器，捕获食源性致病菌过程简单，常见的夹心传感器的捕获过程包括两个，一个过程是捕获探针和食源性致病菌的结合，一个过程是信号探针和致病菌的结合，而我们的捕获过程则是将捕获探针和信号探针进行结合形成一个多功能集成拉曼纳米传感器，将两个过程合并为一个过程，来进行食源性致病菌的捕获。
(3)本发明提供的传感器，由于捕获过程和检测过程简单，所需材料少，成本低。而且，该传感器和食源性致病菌孵育结合的时间短，可实现对食源性致病菌的简单快速检测。
(4)本发明提供的传感器，因为捕获过程简单，制备传感器过程中导致的损失少，所以传感器效率高。而且，由于食源性致病菌本身在细胞膜上多含有N-H键，可以更好的增强拉曼信号，使其有更灵敏的拉曼信号。
进一步，所述内核由MnFe2O4纳米粒子或者Fe3O4纳米粒子或者Fe2O3纳米粒子形成。
采用上述技术方案，磁性纳米颗粒具有超顺磁性和快速磁响应能力，可以通过外加磁场方便的操纵，广泛应用于分离、纯化、催化等领域。
进一步，所述纳米外壳的材质为Au、Ag、Cu和石墨烯中的一种。
采用上述技术方案，石墨烯表现出共振增强的拉曼散射效应，即使分散在聚合物基体中的含量非常低，石墨烯也会形成明显且清晰的拉曼特征峰。少量贵金属材料如Au，Ag，Cu等具有明显的SERS活性。在这些贵金属中，银壳表现出了高出其他材料100倍以上的增强能力，而且成本低廉。金壳同样具有优异的SERS性能及磁性能，且金壳便于修饰。近年来将具有优秀磁性能的磁珠与SERS增强性能的贵金属材料结合在一起，制备出多功能的磁性SERS基底。这种磁性SERS基底既可以实现高效的目标分离、富集，又可以进行高灵敏的SERS检测分析。
进一步，所述内标分子为4-巯基苯甲酸或者2-巯基苯并咪唑羧酸。
采用上述技术方案，嵌入的内标分子是可独立于基底结构存在的，不参与食源性致病菌吸附检测过程的，特意添加具有类似于标记物作用的，可作为内标进行定量分析的物质。内标分子拉曼特征峰信号不对食源性致病菌SERS信号产生干扰，而且含量明确、分布均一，可以用来标准化由于拉曼激光强度波动、基底活性不均、测量环境改变等不稳定因素引起的全光谱强度变化，使定量结果更为可靠准确。内标分子具有巯基，能与金属外壳形成化学键结合连接，从而牢固的修饰在外壳表面，并达到最大的拉曼信号增强。内标分子同时还含有羧基，可与一端修饰了氨基的适配体连接，先利用EDC/NHS进行活化，再将核-壳磁性纳米珠(MB@M-S)和致病菌捕获探针(A)进行共价偶联。而且内标分子与食品样品互溶,且没有影响因子，不会受到任何干扰，具有良好的稳定性，使检测更加准确。
进一步，所述探针为抗体或者适体。
采用上述技术方案，食源性疾病的发生常由于有食源性致病菌的存在,致病菌致病性较高,存在数量较少,常伴随着被污染的食物进入机体。为了选择性地改善检测，引入具有高特异性的识别元件来捕获细菌，即利用抗体和适体的高专一性来做捕获探针。核酸适配体作为一种“化学抗体”,与靶标的结合类似于抗原-抗体的结合方式,而且与蛋白质抗体相比,核酸适配体可有效识别如生物大分子、细菌、细胞、小分子、病毒等各种目标物，具有筛选周期短、高亲和性、高特异性以及适用范围广泛等技术优势，是具有高特异性和良好稳定性的良好捕获细菌的元件。
进一步，所述适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或者如SEQ ID NO.2所示。
采用上述技术方案，适体为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列时，可实现对大肠杆菌的有效捕获；适体为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列时，可实现对金黄色葡萄球菌的有效捕获
进一步，多功能集成拉曼纳米传感器由如下方法制备而成：制备磁性纳米粒子形成的内核，在所述内核外包裹纳米外壳；然后在所述纳米外壳的表面化学修饰上内标分子；将探针共价偶联在内标分子上。
采用上述技术方案，首先制备磁性纳米粒子内核(MB)，并在其表面包覆拉曼增强纳米外壳(M)，得到核-壳磁性纳米珠(MB@M)；在核-壳磁性纳米珠(MB@M)的外壳表面化学修饰上拉曼内标分子，得到内标修饰的核-壳磁性纳米珠(MB@M-S)，拉曼增强纳米外壳可增强内标分子的特征拉曼峰信号；最后将食源性致病菌捕获探针(A)与核-壳磁性纳米珠(MB@M-S)上的拉曼内标分子进行共价偶联，最终得到多功能集成拉曼纳米传感器(MB@M-S-A)。采用本方案的方法制备获得的多功能集成拉曼纳米传感器具有结构和制备方法简单的特点，可针对食源性致病菌进行快速检测。
进一步，多功能集成拉曼纳米传感器由如下方法检测致病菌：将多功能集成拉曼纳米传感器与样品接触，再利用磁分离技术，得到结合有致病菌的传感器；对结合有致病菌的传感器进行拉曼光谱检测，获取致病菌的特征拉曼峰的信号强度Ipb和内标分子的特征拉曼峰的信号强度Is，计算样品的Ipb/Is值。
采用上述技术方案，捕获食源性致病菌过程简单。现有技术的夹心传感器的捕获过程包括两个：一个过程是捕获探针和食源性致病菌的结合，一个过程是信号探针和致病菌的结合，而本方案的捕获过程则是将捕获探针和信号探针进行结合形成一个多功能集成拉曼纳米传感器，将两个过程合并为一个过程。
进一步，获得样品的Ipb/Is值后，根据样品的Ipb/Is值和标准曲线计算样品中致病菌含量。检测获得样品的Ipb/Is值后，可代入标准曲线，计算获得样品中致病菌的含量。
进一步，所述标准曲线由如下方法制作：配制不同致病菌含量的标准样品；使用多功能集成拉曼纳米传感器检测标准样品，获得标准样品的Ipb/Is值；根据标准样品的Ipb/Is值和标准样品中的致病菌含量绘制标准曲线。通过配制不同致病菌含量的标准样品，可获知致病菌含量与Ipb/Is值之间的关系，从而获得用于计算样品中致病菌含量的标准曲线。
附图说明
图1为本发明的多功能集成拉曼纳米传感器的制备流程示意图。
图2为本发明的使用多功能集成拉曼纳米传感器的检测流程示意图。
图3为本发明实施例1的磁性纳米粒子内核MB的X射线衍射(XRD)谱图。
图4为本发明实施例1的包覆在MB表面的拉曼增强纳米外壳M的X射线衍射(XRD)谱图。
图5为本发明实施例1的各种物质的拉曼光谱图。
图6为本发明实施例1的多功能集成拉曼纳米传感器的扫描电镜(TEM)照片。
图7为本发明实施例1的琼脂糖电泳图。
图8为本发明实施例1的不同浓度的大肠杆菌的拉曼强度。
图9本发明实施例1的大肠杆菌浓度与Ipb/Is的线性关系曲线。
图10本发明实施例1的不同食品中大肠杆菌的拉曼强度。
图11为本发明实施例1的不加内标的大肠杆菌浓度与Ipb/Is的关系曲线。
图12为本发明实施例2的多功能集成拉曼纳米传感器的扫描电镜(TEM)照片。
图13为本发明实施例1的金黄色葡萄球菌浓度与Ipb/Is的线性关系曲线。
具体实施方式
附图标记如下：致病菌1、多功能集成拉曼纳米传感器2、磁体3、硅板4.
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以下结合实施例和附图对本发明的进行进一步的说明，应当理解，以下实施例仅为本发明较佳的技术方案，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。本发明中所述“室温”为25℃±10℃，本发明中所采用的试剂若无特殊说明均可通过市售渠道购买获得。
图1展示了多功能集成拉曼纳米传感器的制备流程，具体如下：
1、制备磁性纳米粒子的内核(MB)，并在其表面包覆拉曼增强的纳米外壳(M)，得到核-壳磁性纳米珠(MB@M)；
2、在核-壳磁性纳米珠(MB@M)的外壳表面化学修饰上内标分子(即拉曼内标分子，S)，得到内标修饰的核-壳磁性纳米珠(MB@M-S)，拉曼增强纳米外壳可增强内标分子的特征拉曼峰信号；
3、将捕获食源性致病菌的探针(A，aptamer)与核-壳磁性纳米珠(MB@M-S)上的内标分子进行共价偶联，最终得到多功能集成的多功能集成拉曼纳米传感器(MB@M-S-A)。
图2展示了使用多功能集成拉曼纳米传感器2的进行致病菌检测的流程，具体如下：首先，将多功能集成拉曼纳米传感器2(MB@M-S-A)与食品试样进行孵育，使多功能集成拉曼纳米传感器2结合捕获食品试样中的致病菌1，并利用磁分离技术(利用磁体3)，得到富集、浓缩的致病菌1的多功能集成拉曼纳米传感器2的溶液；然后，对浓缩的致病菌1的多功能集成拉曼纳米传感器2溶液进行拉曼光谱检测，分别获取致病菌特征拉曼峰和内标分子特征拉曼峰的信号强度(Ipb、Is)，由两者的比值(Ipb/Is)，对样品中的致病菌进行定量分析。
实施例1
一种快速检测牛奶中大肠杆菌的多功能拉曼纳米传感器，其制备步骤如下：
(1)MB@M的制备：首先，在室温下将FeCl3·6H2O(4/3mmol,360mg)和MnCl2·4H2O(2/3mmol,131.94mg)溶解在EG(乙二醇)和DEG(一缩二乙二醇)中(VEG/VDEG＝13/7，总体积为20mL)。将2g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)加入上述溶液中，在120℃下加热约10分钟，得到透明溶液。最后停止加热，在上述溶液中加入1.5g NaOAc(醋酸钠)。在强力搅拌30分钟后，将得到的均匀溶液密封在坩埚中，然后转移到马弗炉中，加热至200℃。反应10小时后，将溶液冷却至室温，用外磁铁收集，去离子水洗涤5次，真空60℃干燥，制备出MB(MnFe2O4)，其XRD照片见图3。然后，将5mg AgNO3和300mg PVP溶解到25mL去离子水中，再向其溶液中加入0.05g的MnFe2O4，涡旋搅拌10分钟。加入300μL氨水溶液(0.083mol/L)，涡旋搅拌10分钟。再加入150μL甲醛(0.080mol/L)，涡旋10分钟。然后用磁富集手段，用去离子水清洗3次，即可得到黑色产物，将得到的黑色产物置入60℃的干燥箱中干燥，得到银壳磁珠粉末，其XRD照片见图4，表明成功修饰上可增强拉曼的Ag外壳，制备出核-壳磁性纳米珠MB@M(MB@Ag)。
(2)MB@M-S的制备：配制5mg/mL MB@M(MB@Ag)，用终浓度为1μmol/L的4-巯基苯甲酸(MBA)混合乙醇溶液超声处理1小时后过夜，过夜后加入100μL PBS溶液进行保存，其拉曼光谱图见图5的MB@M-S(MB@Ag-MBA)的特征峰，表明MB@Ag与MBA成功结合，成功制备出MB@M-S(MB@Ag-MBA)。
(3)MB@M-S-A的制备：将100μL EDC溶液(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，10mM)和20μL NHS溶液(N-羟基琥珀酰亚胺，100mM)加入到100μL MB@M-S(MB@Ag-MBA)中，再加入PBST(0.01M)，使总体积达到1mL(EDC 1mM,NHS 20mM)，然后，在振荡条件下(850rpm,25℃)，活化15min，将25μL适配体溶液(10μM in PBS)加入溶液中，孵育2小时，通过磁富集手段，用去离子水清洗3次，去除过量的适配体，将上述得到的适配体修饰的银壳磁珠用乙醇胺(1％，v/v)封闭1小时，然后通过磁富集，用去离子水清洗3次，重悬到100μLPBS溶液中备用，即可制备出多功能集成拉曼纳米传感器MB@M-S-A(MB@Ag-MBA-A)，其TEM照片见图6，其MB@M-S和A成功连接的原位PCR琼脂电泳图见图7。
(4)牛奶中大肠杆菌的检测：MB@M-S-A与大肠杆菌的结合：将25mL牛奶加入1mL大肠杆菌菌液(107cfu/mL-10cfu/mL浓度梯度)，然后与250mL PBS均匀混合，形成食品试样溶液。将15μL MB@M-S-A(MB@Ag-MBA-A)加入到1.5mL的离心管中，通过磁富集用吐温溶液(0.05％，v/v)清洗2次后，加入1mL食品试样溶液后，再加入50μL PBSM缓冲液(1×PBS,100mM MgCl2,pH 7.4)，在振荡条件下(850rpm，37℃)，孵育45分钟，通过磁富集用PBST清洗3次，去除过量的大肠杆菌，得到富集、浓缩大肠杆菌的MB@M-S-A(MB@Ag-MBA-A)溶液。浓缩大肠杆菌的MB@M-S-A(MB@Ag-MBA-A)用乙醇重悬后，点在硅片上，晾干后进行拉曼测试。对不同浓度的大肠杆菌进行拉曼检测，分别获取大肠杆菌特征拉曼峰(728cm-1)和MBA特征拉曼峰(1078cm-1)的信号强度(Ipb、Is)，由两者的比值(Ipb/Is)，对样品中的大肠杆菌进行定量分析，其拉曼光谱见图8(图中曲线从上往下依次为107cfu/mL-10cfu/mL大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)，其线性关系见图9，表明随着大肠杆菌浓度的增加，其拉曼强度也呈良好的线性关系增加。
在不同食品样品(牛奶、橙汁、苹果汁、蓝莓汁、蜂蜜水、红茶和咖啡)中加入大肠杆菌菌液(终浓度10cfu/mL)，然后使用本方案的传感器检测大肠杆菌在728cm-1的拉曼特征峰，可以看出在各种食品样品中都可以检测出来10cfu/mL的大肠杆菌，其中牛奶中的拉曼强度最强(图10)。并根据标准曲线计算食品样品中的大肠杆菌的测量浓度，结果显示，在这些大肠杆菌的食品混合物中，测量浓度在实际浓度的98-101％之间，说明本方法可以较为准确地反应出食品中致病菌的实际浓度，本传感器的测量准确度较高。
图11是在没有加入内标分子的情况下(具体地为：使用11-巯基十一烷酸代替内标分子，使得MB@M和A通过稳定的化学键连接起来)，不同浓度的大肠杆菌在拉曼特征峰(728cm-1)的拉曼强度，从图中可以看出因为没有内标分子，所以看不出来大肠杆菌浓度的变化，无法做到定量分析。
本实施例中一些关键物质和参数如下：
大肠杆菌的适体(适配体)序列：5′-NH2-GCA ATG GTA CGG TAC TTC CCC ATG AGTGTT GTG AAA TGT TGG GAC ACT AGG TGG CAT AGA GCC GCA AAA GTG CAC GCT ACT TTGCTA A-FAM-3′(SEQ ID NO.1)；其中，FAM为3’的6-羧基荧光素修饰，NH2为5’的氨基修饰。
大肠杆菌的拉曼特征峰有：477cm-1，658cm-1，728cm-1，960cm-1，1000cm-1，1330cm-1，1460cm-1，1575cm-1，其中728cm-1是拉曼强度最强的；内标分子4-巯基苯甲酸(4-MBA)的拉曼特征峰有：720cm-1，841cm-1，1078cm-1，1158cm-1，1373cm-1，1580cm-1，其中1078cm-1是拉曼信号最强的；硅片的拉曼特征峰为520cm-1。
实施例2
一种快速检测橙汁中金黄色葡萄球菌的多功能拉曼纳米传感器，其制备步骤如下：
(1)MB@M的制备：首先，在室温下，将FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O按一定摩尔比例1:1混溶，再加入2mol/L NaOH溶液调节，使其pH＝10时，再用0.5mol/L NaOH溶液调节，使其pH＝12。然后磁力搅拌20分钟，低温晶化2小时，通过低速离心机分离，用去离子水和无水乙醇洗涤至中性，即得到Fe3O4纳米溶液。将得到的Fe3O4纳米溶液进行冰冻结冰，冷冻干燥20小时，得到固体Fe3O4纳米粉末。然后，在360mL去离子水中加入20mL HAuCl4(5mM)和20mL TSC(柠檬酸三钠，5mM)，然后大力搅拌。接着加入10mL新鲜制备的NaBH4(0.1M)，溶液颜色由无色变为橙色。溶液在室温下搅拌4小时，得到AuNPs溶液。在超声条件下，取0.05g MB加入到200mL的AuNPs溶液中，超声1小时，与AuNPs溶液放置过夜，然后通过磁富集用去离子水清洗3次，即可得到黑色产物，将得到的黑色产物置入60℃的干燥箱中干燥，得到金壳磁珠粉末，制备出核-壳磁性纳米珠MB@M(MB@Au)。
(2)MB@M-S的制备：配制5mg/mL MB@M(MB@Au)，用终浓度为1μmol/L的2-巯基苯并咪唑羧酸(MBIA)混合乙醇溶液超声处理1小时后过夜，过夜后加入100μL PBS溶液进行保存，即可制备出MB@M-S(MB@Au-MBIA)。
(3)MB@M-S-A的制备：将100μL EDC溶液(10mM)和20μL NHS溶液(100mM)加入到100μL MB@M-S(MB@Au-MBIA)中，再加入PBST(0.01M)，使总体积达到1mL(EDC 1mM,NHS 20mM)，然后，在振荡条件下(850rpm,25℃)，活化15min，将25μL适配体溶液(10μM in PBS)加入溶液中，孵育2小时，通过磁富集手段，用去离子水清洗3次，去除过量的适配体，将上述得到的适配体修饰的银壳磁珠用乙醇胺(1％，v/v)封闭1小时，然后通过磁富集，用去离子水清洗3次，即可制备出多功能集成拉曼纳米传感器MB@M-S-A(MB@Au-MBIA-A)，其TEM照片见图12。
(4)橙汁中金黄色葡萄球菌的检测：MB@M-S-A与金黄色葡萄球菌的结合：将25mL橙汁加入1mL金黄色葡萄球菌菌液(107cfu/mL)，然后与250mL PBS均匀混合，形成食品试样溶液。将15μL MB@M-S-A(MB@Au-MBIA-A)加入到1.5mL的离心管中，通过磁富集用吐温溶液(0.05％，v/v)清洗2次后，加入1mL食品试样溶液后，再加入50μL PBSM缓冲液(1×PBS,100mM MgCl2,pH7.4)，在振荡条件下(850rpm，37℃)，孵育45分钟。通过磁富集用PBST清洗3次，去除过量的金黄色葡萄球菌，得到富集、浓缩金黄色葡萄球菌的MB@M-S-A(MB@Au-MBIA-A)溶液。浓缩金黄色葡萄球菌的MB@M-S-A(MB@Au-MBIA-A)用乙醇重悬后，点在硅片上，晾干后进行拉曼测试，对不同浓度的金黄色葡萄球菌进行拉曼检测，分别获取金黄色葡萄球菌特征拉曼峰(1001cm-1)和MBIA特征拉曼峰(1269cm-1)的信号强度(Ipb、Is)，由两者的比值(Ipb/Is)，对样品中的金黄色葡萄球菌进行定量分析，其线性关系见图13，表明随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，其拉曼强度也呈良好的线性关系增加。
(5)金黄色葡萄球菌的适体序列：5′-NH2-GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGCACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACTTTG CTA A-FAM-3′(SEQ ID NO.2)；其中，FAM为3’的6-羧基荧光素修饰，NH2为5’的氨基修饰。
金黄色葡萄球菌的拉曼特征峰有：621cm-1，643cm-1，724cm-1，780cm-1，1001cm-1，1030cm-1，1318cm-1，1451cm-1，其中1001cm-1是拉曼强度最强的；内标分子2-巯基苯并咪唑羧酸(MBIA)较强的拉曼特征峰有：410cm-1和1269cm-1；硅片的拉曼特征峰为520cm-1。
实验例：传感器的捕获率研究
本实验例比较了本方案的传感器和传统的基于三明治法的传感器的对细菌的捕获率。基于三明治法的传感器详见论文Magnetically Assisted Surface-Enhanced RamanSpectroscopy for the Detection of Staphylococcus aureus Based on AptamerRecognition(ACS Applied Materials Interfaces，2015，7(37):20919-29.)。基于三明治法的传感器在合成捕获探针(MnFe2O4@Ag-aptamer)的时候，不使用内标分子将适体和纳米银外壳连接，而是使用11-巯基十一烷酸(11-mercaptoundecanoic acid，MUA)将适体连接在纳米银外壳上(MUA不是一种内标分子，不能发出拉曼光谱，但具有连接作用)。除上述不同点外，基于三明治法的传感器的捕获探针的制备方法同实施例1的传感器的制备方法。另外，针对于三明治法的传感器，除了制备捕获探针之外，还制备了信号探针(C)。信号探针(C)的制备方法为：在金纳米棒外包裹Ag纳米层，在后在Ag纳米层外共价连接大肠杆菌适体。通过紫外分光光度法，比较本方案的传感器(A)和捕获探针(B)在捕获大肠杆菌上的区别。首先，测菌液的OD600(before)，再将菌液和待测传感器孵育(针对于本方案的传感器，直接使用传感器(A)与菌液孵育；针对与三明治法的传感器，先使用捕获探针(B)与菌液孵育，再加入信号探针(C)继续孵育)，磁分离后的取上清液测OD600(after)。捕获率(％)的计算方法为：(OD600(before)-OD600(after))/OD600(before)×100％。其中，对于细菌而言，OD600＝1(在波长为600nm时的吸光度为1)对应107cfu/mL。本实验例也同时比较了传感器(A’)和捕获探针(B’)在捕获金黄色葡萄球菌上的区别，具体的，传感器(A’)是实施例2中制备的传感器，捕获探针(B’)的制备方法是在实施例2的基础上使用MUA替换内标分子，MUA仅起到连接作用。针对于三明治法的传感器，除了捕获探针(B’)，还制备了信号探针(C’)。信号探针(C‘)的制备方法为：在金纳米棒外共价连接金黄色葡萄球菌适体。检测结果如表1所示。
表1：捕获率测量实验结果
Figure BDA0003002517360000111
由实验结果可知，改变适体和纳米外壳之间的连接分子会对致病菌的捕获率有较大的影响。本方案的检测限与现有技术的基于三明治法的传感器的检测限相近，均在10cfu/mL左右，但是实现低检测限的原理并不一致。本方案是依靠提高样品中致病菌的捕获率的方式实现对痕量致病菌的检测，并且同时结合了增强拉曼信号的报告分子来实现低检测限。而三明治法的传感器是依靠加入大量的信号探针，从而增加拉曼信号强度，从而实现对痕量致病菌的检测。并且，由于三明治法有两个过程(捕获探针结合和信号探针结合)，所以捕获率没有本方案高。显而易见，本方案的传感器的制备和检测方法更为简单方便，更具有优势。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Figure BDA0003002517360000112
Figure BDA0003002517360000121
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆工商大学
<120> 一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器
<130> 20210329
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaatggtac ggtacttccc catgagtgtt gtgaaatgtt gggacactag gtggcataga 60
gccgcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaatggtac ggtacttcct cggcacgttc tcagtagcgc tcgctggtca tcccacagct 60
acgtcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88

Claims (10)

1.一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：包括磁性纳米粒子形成的内核，所述内核外包裹有用于增强拉曼光谱的纳米外壳，所述纳米外壳外附着有内标分子，所述内标分子上偶联有探针。
2.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：所述内核由MnFe2O4纳米粒子或者Fe3O4纳米粒子或者Fe2O3纳米粒子形成。
3.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：所述纳米外壳的材质为Au、Ag、Cu和石墨烯中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：所述内标分子为4-巯基苯甲酸或者2-巯基苯并咪唑羧酸。
5.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：所述探针为抗体或者适体。
6.根据权利要求5所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：所述适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或者如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：其由如下方法制备而成：制备磁性纳米粒子形成的内核，在所述内核外包裹纳米外壳；然后在所述纳米外壳的表面化学修饰上内标分子；将探针共价偶联在内标分子上。
8.根据权利要求1所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：其由如下方法检测致病菌：将多功能集成拉曼纳米传感器与样品接触，再利用磁分离技术，得到结合有致病菌的传感器；对结合有致病菌的传感器进行拉曼光谱检测，获取致病菌的特征拉曼峰的信号强度Ipb和内标分子的特征拉曼峰的信号强度Is，计算样品的Ipb/Is值。
9.根据权利要求8所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：获得样品的Ipb/Is值后，根据样品的Ipb/Is值和标准曲线计算样品中致病菌含量。
10.根据权利要求9所述的一种检测食源性致病菌的多功能集成拉曼纳米传感器，其特征在于：所述标准曲线由如下方法制作：配制不同致病菌含量的标准样品；使用多功能集成拉曼纳米传感器检测标准样品，获得标准样品的Ipb/Is值；根据标准样品的Ipb/Is值和标准样品中的致病菌含量绘制标准曲线。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113358628A (zh) * 2021-06-29 2021-09-07 江苏大学 基于仿生纳米孔道刺激响应门控传感体系的食品中抗生素快速检测方法及系统
CN113777297A (zh) * 2021-08-14 2021-12-10 浙江大学 一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法
CN114088784A (zh) * 2021-11-11 2022-02-25 中南大学 一种检测金黄色葡萄球菌的电化学适配体传感器及其制备方法与应用方法
CN114354573A (zh) * 2022-01-04 2022-04-15 江苏大学 一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140161890A1 (en) * 2010-03-26 2014-06-12 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas MULTIFUNCTIONAL Fe3O4 CORED MAGNETIC-QUANTUM DOT FLUORESCENT NANOCOMPOSITES FOR RF NANO-HYPERTHERMIA OF CANCER CELLS
CN104713869A (zh) * 2015-04-03 2015-06-17 重庆工商大学 杂化钙钛矿超表面在拉曼光谱增强上的应用
CN110031447A (zh) * 2019-05-13 2019-07-19 福州大学 一种利用磁性表面增强拉曼免疫基底的检测方法
CN110441287A (zh) * 2019-09-11 2019-11-12 重庆工商大学 一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法
CN111624189A (zh) * 2019-02-27 2020-09-04 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种检测癌细胞的表面增强拉曼散射磁性复合纳米材料

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140161890A1 (en) * 2010-03-26 2014-06-12 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas MULTIFUNCTIONAL Fe3O4 CORED MAGNETIC-QUANTUM DOT FLUORESCENT NANOCOMPOSITES FOR RF NANO-HYPERTHERMIA OF CANCER CELLS
CN104713869A (zh) * 2015-04-03 2015-06-17 重庆工商大学 杂化钙钛矿超表面在拉曼光谱增强上的应用
CN111624189A (zh) * 2019-02-27 2020-09-04 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种检测癌细胞的表面增强拉曼散射磁性复合纳米材料
CN110031447A (zh) * 2019-05-13 2019-07-19 福州大学 一种利用磁性表面增强拉曼免疫基底的检测方法
CN110441287A (zh) * 2019-09-11 2019-11-12 重庆工商大学 一种原位定量检测细菌信号分子的增强拉曼光谱方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUYUE ZHANG等: "Sensitive and specific detection of clinical bacteria via vancomycin-modified Fe3O4@Au nanoparticles and aptamer-functionalized SERS tags", 《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》 *
HUI ZHANG等: "Gold nanoparticles enhanced SERS aptasensor for the simultaneous detectionof Salmonella typhimurium and Staphylococcusaureus", 《BIOSENSORS ANDBIOELECTRONICS》 *
KAISONG YUAN等: "Antimicrobial peptide based magnetic recognition elements and Au@Ag-GO SERS tags with stable internal standards：a three in one biosensor for isolation, discrimination and killing of multiple bacteria in whole blood", 《CHEMICAL SCIENCE》 *
XIAOYUAN MA等: "SERS aptasensor detection of Salmonella typhimurium using a magnetic gold nanoparticle and gold nanoparticle based sandwich structure", 《ANALYTICAL METHODS》 *
党旭: "核酸适配体应用于环丙氨嗪快速检测新方法研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）工程科技I辑》 *
赵丽等: "《食品安全检测新方法》", 31 March 2019, 厦门大学出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113358628A (zh) * 2021-06-29 2021-09-07 江苏大学 基于仿生纳米孔道刺激响应门控传感体系的食品中抗生素快速检测方法及系统
CN113358628B (zh) * 2021-06-29 2022-11-18 江苏大学 基于仿生纳米孔道刺激响应门控传感体系的食品中抗生素快速检测方法及系统
CN113777297A (zh) * 2021-08-14 2021-12-10 浙江大学 一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法
CN114088784A (zh) * 2021-11-11 2022-02-25 中南大学 一种检测金黄色葡萄球菌的电化学适配体传感器及其制备方法与应用方法
CN114354573A (zh) * 2022-01-04 2022-04-15 江苏大学 一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器及其制备方法和应用
CN114354573B (zh) * 2022-01-04 2023-12-15 江苏大学 一种用于食源性致病菌检测的双信号生物传感器及其制备方法和应用

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