CN113281514B - 一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用，其检测方法为：(1)外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；(2)金纳米‑酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米‑酪胺复合物；(3)SPRi检测：先在芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4‑hemin酶，最后上样金纳米‑酪胺复合物，通过酪胺信号扩增(TSA)将金纳米粒子结合到芯片表面，通过SPR进行检测。本传感器是一种免标记、能实时检测肝癌细胞源性外泌体的SPRi生物传感器，灵敏度和特异性高。

Description

一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用。
背景技术
肝癌发病率位居我国恶性肿瘤第三，患病风险高，死亡率高。提高肝癌患者生存率最有效的方法是早期诊断和治疗。得益于操作简便，无创，可随时取样检测且反应迅速，液体活检被认为是用于肿瘤早期筛查的最有前景的方法之一。其中，生物标志物的选择是确定液体活检结果可靠性的关键。外泌体是近年来新兴的肿瘤标志物之一，它是哺乳动物细胞分泌的粒径为30-200nm的双层膜盘状囊泡。大量研究表明，外泌体的产生，内容物和功能在肿瘤的发生发展进程中有不可忽视的作用。而且，发生癌变后的细胞分泌的外泌体量远远超过正常生理状态下的细胞，甚至癌症细胞源性的外泌体膜上会带有特异性的肿瘤标记物，因此，我们可以通过研究分析外泌体来监测癌症的发生发展。
目前，应用较为广泛的几种外泌体检测方法主要包括荧光，流式细胞术(FCM)，纳米粒子跟踪分析(NTA)和表面等离子共振成像技术(SPRi)等。其中，SPRi因其独特的实时成像，免标记，高通量等特点，可以通过实时捕获折射率的变化来监测芯片上发生的生物分子间结合或解离反应，成功吸引了广大研究者们的注意。SPRi检测中，在金芯片表面修饰的DNA探针或抗体可以通过特定的化学键捕获目标物质从而形成质量增加的聚合物，与此同时，通过电荷耦合检测器(CCD)检测到由结合过程引起的折射率变化并实时成像。由于SPRi检测的敏感区域局限于距离芯片表面200nm以内，因此粒径小于200nm的外泌体囊泡与这项技术的检测要求十分契合。另外，在光学检测平台中，SPRi的信号输出性能比其他检测方法更稳定，具有更好的光稳定性。
得益于上述SPRi检测技术的多种优势，研究人员成功地运用了多种策略来检测生物分子，例如DNA、RNA和蛋白质等。然而，该方法仍然存在其固有缺陷，当用于检测复杂样品中的痕量目标物质时，灵敏度有待提高。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用，本传感器是基于G4-hemin和酪胺信号扩增(TSA)的免标记实时SPRi生物传感器，通过将G4-hemin出色的催化性能与酪胺信号扩增相结合，使大量金纳米粒子结合到外泌体表面，极大的扩增SPR检测信号，以提高肝癌外泌体检测的灵敏度。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；
(2)金纳米-酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米-酪胺复合物(AuNPs-Ty复合物)；
(3)SPRi生物传感器的制备：先在芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过酪胺信号扩增(TSA)将金纳米粒子结合到芯片表面，制得所述SPRi生物传感器。
进一步，所述SPRi生物传感器通过CCD探测器捕获由于芯片表面发生的生物分子间的结合而出现的折射率改变来检测肝癌外泌体。
进一步，步骤(1)中，从肝癌细胞中提取外泌体的方法为超速离心法。
进一步，所述超速离心法为：培养肝癌细胞，待细胞生长密度达到80％时进行传代处理，先用无血清培养基对细胞进行饥饿处理，再将细胞培养液离心，最后用PBS缓冲液将含外泌体的沉淀物进行重悬，完成外泌体的提取。
可选地，肝癌细胞的培养在37℃的无菌培养箱中进行，使用添加有10％FBS、1％链霉素和青霉素的DMEM培养基。
可选地，饥饿处理时间为48小时。
可选地，离心条件为：2,000xg，20分钟；10,000xg，30分钟；100,000xg，2小时。
可选地，在4℃下进行离心。
可选地，含外泌体的沉淀物重悬后于-80℃保存备用。
进一步，步骤(1)中，所述肝癌细胞选自HepG2细胞、MHCC-97细胞、HUH-7细胞、SMMC-7721细胞、Bel-7402细胞、Hep-3B细胞中的至少一种。
进一步，步骤(2)中，所述金纳米粒子的粒径为12-16nm，优选为14nm。若金纳米粒子的粒径过小，对SPR的信号放大效果不够强，粒径过大容易沉积于芯片表面，增大空间位阻，因此，将金纳米粒子的粒径控制在上述范围内较为适宜。
进一步，步骤(2)中，金纳米-酪胺复合物的合成包括如下步骤：
(2a)合成金纳米粒子：将还原剂加入到煮沸的HAuCl4·4H2O溶液中，溶液颜色由浅黄色变为深红色，保持继续煮沸10-15分钟后关闭加热，将溶液避光搅拌冷却到室温，得到AuNPs溶液；
(2b)溶解酪胺：将酪胺盐酸盐溶解于水中，制得酪胺溶液；
(2c)合成金纳米-酪胺复合物：先将同时含有巯基和羧基的交联试剂加入到AuNPs溶液中，搅拌反应，AuNPs通过巯基与交联试剂结合，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，再加入酪胺溶液，通过氨基-羧基反应将酪胺与交联试剂结合，最终生成金纳米-酪胺复合物(AuNPs-Ty复合物)。
可选地，步骤(2a)中，所述还原剂与HAuCl4·4H2O溶液的摩尔用量比为3.8-4.0∶1，优选为3.89∶1。
可选地，步骤(2a)中，所述还原剂选自柠檬酸钠、硼氢化钠(NaBH4)中的至少一种。
可选地，步骤(2c)中，所述交联试剂、AuNPs、酪胺的摩尔用量比为(5×10-4～6×10-4)∶1∶(2×10-4～3×10-4)，优选为5×10-4∶1∶2×10-4。
可选地，步骤(2c)中，所述交联试剂选自11-巯基十一烷酸(MUA)、生物素-亲和素中的至少一种。
可选地，步骤(2c)中，所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和酪胺的用量比为(1-2)∶(2-3)∶0.1(mg/mg/mol)，优选为1∶2∶0.1(mg/mg/mol)。
可选地，步骤(2c)中，反应时间均为10-15小时，优选为12小时。
进一步，步骤(3)中，所述芯片为金传感器芯片。
进一步，步骤(3)中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
进一步，步骤(3)中，SPRi生物传感器的制备方法包括如下步骤：
(3a)首先，依次用丙酮、乙醇和去离子水清洗芯片，氮气吹干，用食人鱼溶液覆盖于芯片表面，再用去离子水洗涤并在氮气下干燥；然后用固定液稀释发夹捕获探针，通过金-硫键修饰于芯片上，并依次进行封闭；
(3b)先上样外泌体，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过G4-hemin酶催化酪胺，将大量金纳米粒子结合到外泌体表面，制得所述SPRi生物传感器。
可选地，步骤(3a)中，所述食人鱼溶液在芯片表面覆盖时间为8-15min，优选为10min，时间过短清洁效果不好，时间过长可能会腐蚀芯片表面的金点。
可选地，步骤(3a)中，所述固定液为KH2PO4溶液，优选地，所述KH2PO4溶液的浓度为1M。
可选地，步骤(3a)中，采用1mM MCH封闭电极0.5h。
可选地，步骤(3b)中，外泌体和金纳米-酪胺复合物的进样量与流速相同。优选地，外泌体的进样量为100-150μL，流速为0.006-0.008mL/min，反应时间为0.5-0.8h；金纳米-酪胺复合物的进样量为100-150μL，流速为0.006-0.008mL/min，反应时间为0.5-0.8h。更优选地，外泌体的进样量为100μL，流速为0.007mL/min，反应时间为0.5h；金纳米-酪胺复合物的进样量为100μL，流速为0.007mL/min，反应时间为0.5h。
本发明第二方面提供一种根据第一方面所述的方法制备得到的用于检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器。
本发明第三方面提供如第二方面所述的SPRi生物传感器在检测肝癌细胞外泌体上的应用。
本发明第四方面提供一种检测肝癌细胞外泌体的方法，包括如下步骤：
(I)外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；
(II)金纳米-酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米-酪胺复合物(AuNPs-Ty复合物)；
(III)SPRi检测：先在芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过酪胺信号扩增(TSA)将金纳米粒子结合到芯片表面，通过SPR进行检测。
进一步，步骤(I)中，从肝癌细胞中提取外泌体的方法为超速离心法。
进一步，所述超速离心法为：培养肝癌细胞，待细胞生长密度达到80％时进行传代处理，先用无血清培养基对细胞进行饥饿处理，再将细胞培养液离心，最后用PBS缓冲液将含外泌体的沉淀物进行重悬，完成外泌体的提取。
可选地，肝癌细胞的培养在37℃的无菌培养箱中进行，使用添加有10％FBS、1％链霉素和青霉素的DMEM培养基。
可选地，饥饿处理时间为48小时。
可选地，离心条件为：2,000x g，20分钟；10,000x g，30分钟；100,000x g，2小时。
可选地，在4℃下进行离心。
可选地，含外泌体的沉淀物重悬后于-80℃保存备用。
进一步，步骤(I)中，所述肝癌细胞选自HepG2细胞、MHCC-97细胞、HUH-7细胞、SMMC-7721细胞、Bel-7402细胞、Hep-3B细胞中的至少一种。
进一步，步骤(II)中，所述金纳米粒子的粒径为12-16nm，优选为14nm。
进一步，步骤(II)中，金纳米-酪胺复合物的合成包括如下步骤：
(IIa)合成金纳米粒子：将还原剂加入到煮沸的HAuCl4·4H2O溶液中，溶液颜色由浅黄色变为深红色，保持继续煮沸10-15分钟后关闭加热，将溶液避光搅拌冷却到室温，得到AuNPs溶液；
(IIb)溶解酪胺：将酪胺盐酸盐溶解于水中，制得酪胺溶液；
(IIc)合成金纳米-酪胺复合物：先将同时含有巯基和羧基的交联试剂加入到AuNPs溶液中，搅拌反应，AuNPs通过巯基与交联试剂结合，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，再加入酪胺溶液，通过氨基-羧基反应将酪胺与交联试剂结合，最终生成金纳米-酪胺复合物(AuNPs-Ty复合物)。
可选地，步骤(IIa)中，所述还原剂与HAuCl4·4H2O溶液的摩尔用量比为3.8-4.0∶1，优选为3.89∶1。
可选地，步骤(IIa)中，所述还原剂选自柠檬酸钠、硼氢化钠中的至少一种。
可选地，步骤(IIc)中，所述交联试剂、AuNPs、酪胺的摩尔用量比为(5×10-4～6×10-4)∶1∶(2×10-4～3×10-4)，优选为5×10-4∶1∶2×10-4。
可选地，步骤(IIc)中，所述交联试剂选自11-巯基十一烷酸(MUA)、生物素-亲和素中的至少一种。
可选地，步骤(II c)中，所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和酪胺的用量比为(1-2)∶(2-3)∶0.1(mg/mg/mol)，优选为1∶2∶0.1(mg/mg/mol)。
可选地，步骤(IIc)中，反应时间均为10-15小时，优选为12小时。
进一步，步骤(III)中，所述芯片为金传感器芯片。
进一步，步骤(III)中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
进一步，步骤(III)中，SPRi检测过程包括如下步骤：
(IIIa)首先，依次用丙酮、乙醇和去离子水清洗芯片，氮气吹干，用食人鱼溶液覆盖于芯片表面，再用去离子水洗涤并在氮气下干燥；然后用固定液稀释发夹捕获探针，通过金-硫键修饰于芯片上，并依次进行封闭；
(IIIb)先上样外泌体，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过G4-hemin酶催化酪胺，将大量金纳米粒子结合到外泌体表面；
(IIIc)通过CCD探测器捕获由于芯片表面发生的生物分子间的结合而出现的折射率改变来检测肝癌外泌体。可选地，步骤(IIIa)中，所述食人鱼溶液在芯片表面覆盖时间为8-15min，优选为10min。
可选地，步骤(IIIa)中，所述固定液为KH2PO4溶液，优选地，所述KH2PO4溶液的浓度为1M。
可选地，步骤(IIIa)中，采用1mM MCH封闭电极0.5h。
可选地，步骤(IIIb)中，外泌体和金纳米-酪胺复合物的进样量与流速相同。优选地，外泌体的进样量为100-150μL，流速为0.006-0.008mL/min，反应时间为0.5-0.8h；金纳米-酪胺复合物的进样量为100-150μL，流速为0.006-0.008mL/min，反应时间为0.5-0.8h。更优选地，外泌体的进样量为100μL，流速为0.007mL/min，反应时间为0.5h；金纳米-酪胺复合物的进样量为100μL，流速为0.007mL/min，反应时间为0.5h。
可选地，步骤(IIIc)中，反应完成后，用PBS继续冲洗芯片，以除去非特异性吸附物质，降低非特异性信号。
如上所述，本发明的检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用，具有以下有益效果：
本发明开发了一种免标记的实时SPRi生物传感器，用于对肝癌细胞源性的外泌体进行高灵敏和特异性检测。通过将G4-hemin出色的催化性能与酪胺信号扩增相结合，可以显著增强外泌体的检测信号。经实验验证，本发明方法成功应用于肝癌癌症细胞源性外泌体的检测，有望应用于对实际样品和临床标本中外泌体的检测，为肝癌的早期诊断和精准医疗提供了新的可替代方法。
附图说明
图1显示为本发明所述方法的检测原理图。
图2显示为本发明中验证G4-hemin结合的紫外表征结果图。
图3显示为本发明中验证金纳米与酪胺结合的表征结果图。
图4显示为本发明中所提取外泌体的表征结果图。
图5显示为本发明所述方法的可行性验证结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提出的SPRi生物传感器通过将G4-hemin出色的催化性能与酪胺信号扩增相结合，极大地增强SPR检测信号，从而实现对肝癌细胞源性外泌体的免标记、高灵敏和实时检测。本发明有望应用于患者临床样本中肿瘤标志物的检测中，发展成为具有临床应用价值的SPRi生物传感新方法。
具体实施过程如下：
实施例1
制备SPRi生物传感器并检测外泌体
1、材料
HAuCl4·4H2O购自Sinopharm Chem Co.，Ltd(上海，中国)。6-巯基-1-己醇(MCH)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，美国)。胎牛血清(FBS)和Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM)由Gibco(马里兰州盖瑟斯堡，美国)提供。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自Alfa Aesar(马萨诸塞州，美国)。所有HPLC纯化的寡核苷酸均由Sangon Biotech.Co.，Ltd(上海，中国)制备和纯化。寡核苷酸溶解于Tris-EDTA(TE)缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)。实验全程使用通过Millipore Milli-Q梯度超纯水系统制备的水溶液(Millipore Co.，MA，USA)。
2、检测仪器
实验中的SPRi检测是在表面等离子体共振成像(SPRi)传感平台上进行的。
3、检测原理
如图1所示，首先，通过超速离心法从肝癌细胞中提取外泌体。然后，先合成金纳米颗粒，将金纳米与酪胺结合生成AuNPs-Ty复合材料，之后进行SPRi检测。SPRi检测过程中，首先在芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，当外泌体存在时，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样AuNPs-Ty，通过信号扩增(TSA)将金纳米粒子结合到芯片表面，导致折射率发生改变，由处于反射角的CCD探测器捕获并输出信号。
4、制备过程
(1)、超速离心法提取外泌体：
(a)在37℃的无菌培养箱中(含5％CO2)使用DMEM(添加10％FBS，1％链霉素和青霉素)分开培养各种肝癌细胞(包括HepG2细胞、MHCC-97细胞、HUH-7细胞、SMMC-7721细胞、Bel-7402细胞、Hep-3B细胞)，当培养皿内的细胞生长密度达到80％时进行传代处理。
(b)在提取外泌体之前，用无血清培养基对细胞进行饥饿处理48小时。
(c)饥饿结束后将细胞培养液离心。离心步骤为：2,000x g，20分钟；10,000x g，30分钟；100,000x g，2小时。所有步骤均在4℃下进行。
(d)用100μL 1x PBS将含外泌体的沉淀物进行重悬，-80℃保存备用。
(2)、合成金纳米-酪胺复合物材料：先合成金纳米，溶解酪胺盐酸盐，最后将二者结合。
①、首先合成粒径为14nm的金纳米粒子：
将柠檬酸钠(10.1mL，34mM)快速加入到煮沸的HAuCl4·4H2O(88.2mL，1mM)溶液中，1分钟内溶液颜色由浅黄色变为深红色，保持继续煮沸10-15分钟后关闭加热，将所合成的金纳米粒子溶液避光搅拌冷却到室温，4℃避光保存。
总体系： 98.3mL
柠檬酸钠 10.1mL 34mM
HAuCl4·4H2O 88.2mL 1mM
②、溶解酪胺盐酸盐：
称量0.17364g酪胺盐酸盐溶解于1mL去离子水中。
总体系： 1mL
酪胺盐酸盐 0.17364g
去离子水 1mL
将所得酪胺溶液4℃保存。
③、合成AuNPs-Ty复合物：
先将11-巯基十一烷酸(25μL，10-4mol/L)加入到5mL AuNPs溶液中，持续混匀12小时。然后将NHS(10μL，1mg/mL)、EDC(10μL，2mg/mL)和酪胺(10μL，10-4mol/L)加入到上述溶液中，持续混匀12小时后生成AuNPs-Ty复合物。
(3)、SPRi检测过程：将经过处理得芯片安装好，依次上样进行检测。
(a)首先，依次用丙酮、乙醇和去离子水清洗金传感器芯片3min氮气吹干。现配食人鱼溶液覆盖于芯片表面10min，用去离子水洗涤并在氮气下干燥。然后用现有的固定液KH2PO4溶液(1M)稀释发夹捕获探针，通过金-硫键修饰于芯片上，并依次进行封闭(1mM MCH，0.5h)。
所述捕获探针的核苷酸序列为：
(b)如表1所示：先上样外泌体，将发夹链打开，释放出G4序列，然后上样AuNPs-Ty复合物材料，通过G4-hemin酶催化酪胺将大量金纳米结合到外泌体表面。
表1
上样物质 上样体积(μL) 流速(mL/min) 反应时间(h)
外泌体 100 0.007 0.5
AuNPs-Ty复合物材料 100 0.007 0.5
(c)通过CCD探测器捕获由于芯片表面发生的生物分子间的结合而出现的折射率改变，来检测肝癌外泌体。
反应完成后用PBS继续冲洗金传感器芯片约15min，以除去非特异性吸附物质，降低非特异性信号。
实施例2
验证检测SPRi生物传感器的可行性
1、对G4-hemin的结合进行验证
对实施例1中G4-hemin的成功结合进行验证，图2显示为验证二者结合的紫外吸收图，由图2可知，蓝色线条的信号中同时出现了G4核酸链和hemin的特征性吸收峰，分别为260nm和402nm，表明二者成功结合。
2、对金纳米与酪胺的结合进行验证
图3显示了金纳米与酪胺结合的TEM(A)和紫外表征结果(B)。
由图3A所示的TEM图可知，实施例1合成的金纳米颗粒粒径均一，分散性较好；
图3B所示的紫外表征图中，黑色的为AuNPs紫外吸收，可见在530nm处有特征性吸收峰；红色的为AuNPs-Ty的紫外吸收，吸收峰发生了红移，为537nm，表明金纳米与酪胺成功结合。
3、对外泌体的提取进行验证
图4显示为外泌体的TEM(A)和NTA(B)表征结果图。
由图4A所示的TEM图可知，所提取的外泌体为粒径100nm左右的双层膜盘装囊泡结构，背景很干净，杂质少。
由图4B所示的NTA图可知，所提取的外泌体粒径分布大致为80-150nm，较为集中。
以上结果验证了外泌体的成功提取。
4、对本方法的可行性进行验证
图5显示了分别通过SPRi平台和荧光平台对本检测方法的可行性进行验证结果。
由图5A可知，与空白对照相比(黑色线)，当上样外泌体后(红色线)，SPR信号有所升高，表明适体序列与外泌体表面蛋白特异性结合，将外泌体结合到了芯片表面。之后进一步上样AuNPs-Ty复合物材料，SPR信号出现了大幅度增强，表明G4-hemin催化酪胺，将金纳米结合到外泌体表面，极大的增强了SPR信号。
图5B显示为本发明方法可行性的荧光验证图，其中曲线
(a)反应体系中加入的物质有：G4序列、外泌体、hemin、AuNPs、H2O2；
(b)反应体系中加入的物质有：G4序列、外泌体、hemin、酪胺、H2O2；
(c)反应体系中加入的物质有：G4序列、外泌体、hemin、AuNPs-Ty、H2O2；
(d)反应体系中加入的物质有：外泌体、hemin、AuNPs-Ty、H2O2；
(e)反应体系中加入的物质有：G4序列、hemin、AuNPs-Ty、H2O2；
(f)反应体系中加入的物质有：G4序列、外泌体、AuNPs-Ty、H2O2；
(g)反应体系中加入的物质有：G4序列、外泌体、hemin、H2O2；
(h)反应体系中加入的物质有：G4序列、外泌体、hemin、AuNPs-Ty。
由图5B可知，当外泌体存在时，G4序列可以被成功的暴露，形成G4-hemin结构，并可以催化酪胺产生较强的荧光信号，而且当酪胺与金纳米结合时，由于金纳米的淬灭效果而无法检测到荧光。
以上实验结果表明本发明有较强的可行性和优良的检测性能。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器及其制备与应用
<130> PCQYK2110470-HZ
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 捕获探针
<400> 1
gtactcgggt gggtgggtgg gtccacgcag ggccgtcgaa cacgagcatg gtgcgtggac 60
ctaggatgac ctgagtactg tccttttttt tttttttt 98

Claims (10)

1.一种检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；
（2）金纳米-酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米-酪胺复合物；
（3）SPRi生物传感器的制备：先在金传感器芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过酪胺信号扩增将金纳米粒子结合到芯片表面，制得所述SPRi生物传感器；
所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述SPRi生物传感器通过CCD探测器捕获由于芯片表面发生的生物分子间的结合而出现的折射率改变来检测肝癌外泌体；
和/或，步骤（1）中，从肝癌细胞中提取外泌体的方法为超速离心法；
和/或，步骤（1）中，所述肝癌细胞选自HepG2细胞、MHCC-97细胞、HUH-7细胞、SMMC-7721细胞、Bel-7402细胞、Hep-3B细胞中的至少一种；
和/或，步骤（2）中，所述金纳米粒子的粒径为12-16 nm；
和/或，步骤（2）中，金纳米-酪胺复合物的合成包括如下步骤：
（2a）合成金纳米粒子：将还原剂加入到煮沸的HAuCl4·4H2O溶液中，溶液颜色由浅黄色变为深红色，保持继续煮沸10-15分钟后关闭加热，将溶液避光搅拌冷却到室温，得到AuNPs溶液；
（2b）溶解酪胺：将酪胺盐酸盐溶解于水中，制得酪胺溶液；
（2c）合成金纳米-酪胺复合物：先将同时含有巯基和羧基的交联试剂加入到AuNPs溶液中，搅拌反应，AuNPs通过巯基与交联试剂结合，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺、N-（3-（二甲基氨基）丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基，再加入酪胺溶液，通过氨基-羧基反应将酪胺与交联试剂结合，最终生成金纳米-酪胺复合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2a）中，所述还原剂与HAuCl4·4H2O溶液的摩尔用量比为3.8-4.0:1；
和/或，步骤（2a）中，所述还原剂选自柠檬酸钠、硼氢化钠中的至少一种；
和/或，步骤（2c）中，所述交联试剂、AuNPs、酪胺的摩尔用量比为（5×10-4～6×10-4）:1：（2×10-4～3×10-4）；
和/或，步骤（2c）中，所述交联试剂选自11-巯基十一烷酸、生物素-亲和素中的至少一种；
和/或，步骤（2c）中，所述N-羟基琥珀酰亚胺、N-（3-（二甲基氨基）丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和酪胺的用量比为（1-2）:（2-3）:0.1（mg/ mg/mol）；
和/或，步骤（2c）中，反应时间均为10-15小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，SPRi生物传感器的制备方法包括如下步骤：
（3a）首先，依次用丙酮、乙醇和去离子水清洗芯片，氮气吹干，用食人鱼溶液覆盖于芯片表面，再用去离子水洗涤并在氮气下干燥；然后用固定液稀释发夹捕获探针，通过金-硫键修饰于芯片上，并依次进行封闭；
（3b）先上样外泌体，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过G4-hemin酶催化酪胺，将大量金纳米粒子结合到外泌体表面，制得所述SPRi生物传感器。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3a）中，所述食人鱼溶液在芯片表面覆盖时间为8-15 min；
和/或，步骤（3a）中， 所述固定液为KH2PO4溶液；
和/或，步骤（3a）中，采用1 mM MCH封闭电极0.5 h；
和/或，步骤（3b）中，外泌体和金纳米-酪胺复合物的进样量与流速相同。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法制得的用于检测肝癌细胞外泌体的SPRi生物传感器。
7.根据权利要求6所述的SPRi生物传感器在检测肝癌细胞外泌体上的应用，所述应用为非疾病检测或治疗目的。
8.一种检测肝癌细胞外泌体的方法，所述方法为非疾病检测或治疗目的，其特征在于，包括如下步骤：
（Ⅰ）外泌体的提取：从肝癌细胞中提取外泌体；
（Ⅱ）金纳米-酪胺复合物的合成：先合成金纳米粒子，然后将金纳米粒子与酪胺结合生成金纳米-酪胺复合物；
（Ⅲ）SPRi检测：先在金传感器芯片表面修饰带有G4链的适体发夹捕获探针，然后上样外泌体，外泌体上样后，适体与外泌体表面的蛋白特异性结合，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过酪胺信号扩增将金纳米粒子结合到芯片表面，通过SPR进行检测；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤（Ⅰ）中，从肝癌细胞中提取外泌体的方法为超速离心法；
和/或，步骤（Ⅰ）中，所述肝癌细胞选自HepG2细胞、MHCC-97细胞、HUH-7细胞、SMMC-7721细胞、Bel-7402细胞、Hep-3B细胞中的至少一种；
和/或，步骤（Ⅱ）中，所述金纳米粒子的粒径为12-16 nm；
和/或，步骤（Ⅱ）中，金纳米-酪胺复合物的合成包括如下步骤：
（Ⅱa）合成金纳米粒子：将还原剂加入到煮沸的HAuCl4·4H2O溶液中，溶液颜色由浅黄色变为深红色，保持继续煮沸10-15分钟后关闭加热，将溶液避光搅拌冷却到室温，得到AuNPs溶液；
（Ⅱb）溶解酪胺：将酪胺盐酸盐溶解于水中，制得酪胺溶液；
（Ⅱc）合成金纳米-酪胺复合物：先将同时含有巯基和羧基的交联试剂加入到AuNPs溶液中，搅拌反应，AuNPs通过巯基与交联试剂结合，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺、N-（3-（二甲基氨基）丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基，再加入酪胺溶液，通过氨基-羧基反应将酪胺与交联试剂结合，最终生成金纳米-酪胺复合物；
和/或，步骤（Ⅲ）中，SPRi检测过程包括如下步骤：
（Ⅲa）首先，依次用丙酮、乙醇和去离子水清洗芯片，氮气吹干，用食人鱼溶液覆盖于芯片表面，再用去离子水洗涤并在氮气下干燥；然后用固定液稀释发夹捕获探针，通过金-硫键修饰于芯片上，并依次进行封闭；
（Ⅲb）先上样外泌体，将发夹打开，释放出G4序列，形成G4-hemin酶，最后上样金纳米-酪胺复合物，通过G4-hemin酶催化酪胺，将大量金纳米粒子结合到外泌体表面；
（Ⅲc）通过CCD探测器捕获由于芯片表面发生的生物分子间的结合而出现的折射率改变来检测肝癌外泌体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤（Ⅱa）中，所述还原剂与HAuCl4·4H2O溶液的摩尔用量比为3.8-4.0:1；
和/或，步骤（Ⅱa）中，所述还原剂选自柠檬酸钠、硼氢化钠中的至少一种；
和/或，步骤（Ⅱc）中，所述交联试剂、AuNPs、酪胺的摩尔用量比为（5×10-4～6×10-4）:1：（2×10-4～3×10-4）；
步骤（Ⅱc）中，所述交联试剂选自11-巯基十一烷酸、生物素-亲和素中的至少一种；
和/或，步骤（Ⅱc）中，所述N-羟基琥珀酰亚胺、N-（3-（二甲基氨基）丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和酪胺的用量比为（1-2）:（2-3）:0.1（mg/ mg/mol）；
和/或，步骤（Ⅱc）中，反应时间均为10-15小时；
和/或，步骤（Ⅲa）中，所述食人鱼溶液在芯片表面覆盖时间为8-15 min；
和/或，步骤（Ⅲa）中， 所述固定液为KH2PO4溶液；
和/或，步骤（Ⅲa）中，采用1 mM MCH封闭电极0.5 h；
和/或，步骤（Ⅲb）中，外泌体和金纳米-酪胺复合物的进样量与流速相同。
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