CN108469430A - 一种用于蛋白质高灵敏度检测的tsa-sers传感器的制备方法 - Google Patents

一种用于蛋白质高灵敏度检测的tsa-sers传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA‑SERS传感器的制备方法，在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子（SERS tag）连接酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有SERS tag的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。本发明可在生物分子浓度很低的情况下产生灵敏的信号，由于在低浓度下非特异性结合相对减少，进而改善反应的特异性，与此同时，还能减少生物分子的用量，降低实验成本。

Description

一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法
技术领域
本发明属于SERS传感器领域，具体涉及一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法。
背景技术
蛋白质对于生物体是必不可少的，它们是细胞生理代谢过程的重要组成部分。作为细胞中的主要功能分子，蛋白质能够与其他各类分子特异性地的结合。近年来，用来研究蛋白质结构和功能的方法不断涌现，包括荧光检测、比色检测以及电化学分析等。
作为一种分析检测技术，SERS（表面增强拉曼散射）光谱具有灵敏度高、选择性好等优势，可以在水环境中检测物质的结构信息，对于生物体系的研究具有独特的优势。目前，SERS技术已经被用于创建多种生物传感器，例如利用SERS研究免疫识别过程或蛋白质与各类分子的相互作用等。然而，生物体系结构复杂，存在多种干扰物质以及非特异性结合，会在一定程度上影响SERS信号的高效获得。因此，建立高灵敏度的检测方法是SERS 生物传感器不断向前发展的保证。
为了提高SERS 生物传感器的检测灵敏度，以往的报道提出过许多增强策略。例如，采用含有“热点”结构的活性基底来增强被测物的SERS信号，利用酶、核酸等与目标物的识别过程使信号分子恰好置于基底上的“热点”位置。但是，这些方法不仅需要复杂的制备技术和组装工艺，而且对仪器设备要求较高。同时，一个目标识别事件只能引入一个信号报告单元，这将大大的限制检测灵敏度的提高。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，解决现有方法制备的SERS传感器检测灵敏度不高的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，包括以下步骤：在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子连接在酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有金纳米粒子的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。
TSA（酪胺信号放大）是一种酶介导的放大系统，在过氧化氢存在时，体系中的辣根过氧化物酶（HRP）催化酪胺分子（Tyramine）转化成一种活性中间体，该中间体可以迅速反应，共价结合在相接蛋白分子的富电子区域（比如色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基），通过将荧光染料或者其他标记物连接到酪胺分子上，可使其荧光信号或者其他相应信号在其沉积时得到放大。本发明在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子（SERS tag）连接酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有SERS tag的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。
作为优选，本发明用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1、拉曼染料MBA（巯基苯甲酸）标记的金纳米粒子上连接酪胺分子：
在MBA标记的金纳米粒子溶胶AuNP@MBA中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）、EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）以及tyramine，搅拌反应得到AuNP@MBA-tyramine溶胶，其中tyramine与MBA的摩尔比为1:1.5~3.5；
S2、在基片上构筑从下到上依次叠加的抗体A-靶抗原-抗体B的三层结构：
a、将表面有Au wafer的硅基片经MPA（巯基丙酸）溶液浸泡后，用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干，得到表面羧基化的Au wafer基片；
b、将表面羧基化的Au wafer基片浸入EDC和NHS的混合溶液中活化30~60min，随后将表面活化的Au wafer基片浸入到抗体A溶液中反应3~5h，然后用PBS缓冲液冲洗，将冲洗后的基片用2%的牛血清白蛋白封闭后，再用PBS缓冲液冲洗；
c、将步骤b封闭后组装有抗体A的基片浸入待测抗原溶液中反应30~45min，得到组装有靶抗原的Au wafer基片，然后将组装有靶抗原的Au wafer基片浸入标记有辣根过氧化物酶的抗体B溶液中反应30~45min，得到抗体A-靶抗原-抗体B的Au wafer基片；
S3：引发TSA反应，用于SERS免疫检测：
在步骤S1制备的AuNP@MBA-tyramine溶胶中加入H2O2，混匀后滴加至步骤c得到的抗体A-靶抗原-抗体B的Au wafer基片上进行反应，随后用超纯水冲洗，并经氮气吹干后，进行SERS检测。
在上述步骤S1中，tyramine与MBA的摩尔比是指步骤S1中加入的tyramine的摩尔数与制备AuNP@MBA时加入的MBA的摩尔数之比。tyramine通过末端的氨基与MBA的羧基发生反应，连接在金纳米粒子表面，其中EDC可催化MBA和NHS反应，NHS使MBA的羧基端酰化，进一步和tyramine末端的氨基发生反应。NHS和EDC主要起催化作用，用量可根据需要适量添加，为便于反应，可将NHS、EDC和tyramine用适量的水配制成溶液添加，tyramine的用量不宜太多，过多会导致AuNP@MBA溶胶发生聚集。NHS、EDC和tyramine配制成溶液的浓度可分别优选为1 mg/mL、2 mg/mL、10-4 mol/L。
在上述步骤a中，硅基片表面Au wafer的厚度可为30~100nm，MPA溶液浓度可为10- 3mol/L，浸泡时间可为1~3h，PBS缓冲液的pH可为7.4。
在上述步骤b中，EDC可催化MPA和NHS反应，使MPA的羧基端酰化，以利于抗体A的连接，抗体A通过氨基与羧基反应，连接在基片表面，PBS缓冲液冲洗主要是去除未反应的抗体A，2%的牛血清白蛋白主要是封闭基片上未反应的位点。
在上述步骤c中，组装有抗体A的基片浸入待测抗原溶液中，抗原可与抗体A发生免疫识别反应，组装到基片表面。
在上述步骤S3中，H2O2可以促进HRP氧化tyramine形成活性自由基，进而将大量的标记有MBA的金纳米粒子组装到Au wafer基片表面，产生强烈的SERS信号，H2O2作为催化剂，添加适量即可，反应时间可为20~40min。
作为优选，步骤S1反应完成后，将得到的溶胶进行离心，并用二次蒸馏水重悬浮。离心的目的主要是去掉过量的tyramine分子。
作为优选，步骤S1中搅拌反应时间为1~3h。反应时间会影响AuNP@MBA溶胶的稳定性，时间过长会破坏AuNP@MBA溶胶的稳定性，容易发生聚集。
作为优选，步骤b中EDC和NHS的混合溶液中，EDC和NHS的浓度分别为1~10 mg/mL、2~20mg/L。EDC和NHS作为催化剂，浓度过高会使金纳米离子发生聚集。
作为优选，步骤b中抗体A的浓度为1~10μg/mL，步骤c中抗体B的浓度为1~3μg/mL。抗体A和抗体B的浓度会影响组装效率，浓度太低组装太慢。在实际中，可使待测抗原的浓度低于抗体A和抗体B的浓度，保证待测抗原全部组装，抗体B的浓度也以低于抗体A的浓度为宜。
作为优选，步骤b中基片与抗体A的反应温度为2~6℃。在此温度下，可较稳定的保存抗体蛋白的空间结构，反应温度可进一步优选为4℃。
作为优选，步骤c中基片与待测抗原反应及与抗体B反应的温度为15~40℃。在一定的范围内，温度升高有利于抗原抗体结合，但是温度不宜过高，太高会导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变形或破坏。
本发明对使用的抗体和抗原无特别要求，配对即可，如小鼠IgG、山羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG；人癌胚蛋白抗原CEA、鼠抗人CEA、兔抗人CEA；人前列腺特异性抗原PSA、鼠抗人PSA、兔抗人PSA等。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明制备的TSA-SERS传感器，通过一个免疫识别事件，可以产生多个信号报告单元，增加了探针分子（MBA）在传感器表面的吸附量，进而提高SERS传感器的检测灵敏度。
2、本发明通过探针分子的沉积使被测信号得到放大的增强策略与现有的提高SERS灵敏度的方法有很大不同，本发明可在生物分子浓度很低的情况下产生灵敏的信号，由于在低浓度下非特异性结合相对减少，进而改善反应的特异性，与此同时，减少生物分子的用量可以降低实验成本。
3、本发明利用SERS tag标记酪胺分子，通过引发TSA反应，将连有SERS tag的酶促产物大量地吸附到免疫传感器上，使检测信号得到几何级放大，体系中的金纳米粒子具有双重作用，既是TSA系统中酪胺分子上标记SERS tag的媒介，又是SERS检测过程中的增强基底，不需要额外制备SERS基底，简化了实验步骤。
4、本发明制备的TSA-SERS传感器灵敏度高，SERS强度比传统SERS免疫阵列高出10倍左右，最低检测浓度为0.01 ng/mL，并且选择性好，可特异性识别靶抗原。
附图说明
图1为实施例1制备的金纳米粒子透射电子显微镜图；
图2为实施例1制备的金纳米粒子紫外可见吸收光谱图；
图3为SERS传感器和TSA-SERS传感器的基片扫描电镜图；
图4为SERS传感器和TSA-SERS传感器的SERS信号图；
图5为探针分子的SERS信号强与目标抗原的浓度关系图；
图6为SERS光谱在1583cm-1处的峰强度随着目标蛋白的浓度变化的关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例TSA-SERS传感器的制备，步骤如下：
1. 拉曼染料（MBA）标记的金纳米粒子上连接酪胺分子
（1）金纳米粒子的合成：将100 mL浓度为10-3 mol/L的HAuCl4水溶液加热至沸腾，剧烈搅拌下迅速加入1 mL浓度为1% (wt%)的柠檬酸钠水溶液。保持沸腾状态，继续搅拌反应10min后，自然冷却至室温。将制备得到的金纳米粒子进行透射电子显微镜和紫外可见吸收光谱表征（如图1和图2所示），其在可见光范围内最大吸收波长的位置在524 nm处。
（2）MBA标记金纳米粒子的制备：在5 mL金溶胶中，加入25μL MBA (10-4 mol/L)的乙醇溶液，搅拌反应12 h。MBA通过巯基吸附在金溶胶表面。为防止微量游离的MBA分子干扰，将溶胶离心（10000转/分，离心10分钟）清洗两次，用二次蒸馏水重悬浮，制得MBA吸附的金纳米粒子AuNP@MBA。
（3）AuNP@MBA上连接酪胺分子：在上面得到的AuNP@MBA中加入10μL NHS(1mg/mL)、10μL EDC(2mg/mL)以及10μL tyramine (10-4 mol/L)，搅拌反应2h。Tyramine通过末端的氨基与MBA的羧基发生反应，连接在金纳米粒子上。为去掉过量的tyramine分子，将溶胶离心（10000转/分，离心10分钟）后，用二次蒸馏水重悬浮，制得AuNP@MBA- tyramine。
2. 在基片上构筑从下到上依次叠加的抗体A-靶抗原-抗体B的三层结构
（1）将切割好的硅基片（表面有100nm Au wafer）在巯基丙酸（MPA）溶液中（10-3 mol/L）浸泡2h，取出后用PBS（pH=7.4，磷酸缓冲盐溶液）冲洗，氮气吹干，得到表面带有羧基的Auwafer基片。
（2）将以上得到的Au wafer基片浸入EDC和NHS的混合溶液（其中EDC和NHS的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL）中30min。EDC可催化MPA和NHS的反应，使MPA的羧基端酰化，以利于抗体的连接。
（3）将以上得到的Au wafer基片浸入到抗体A（山羊抗小鼠IgG，10μg/mL）溶液中，4℃条件下反应4h，然后用PBS缓冲溶液（pH为7.4）反复冲洗，除去未反应的抗体A。抗体A通过氨基与羧基反应，连接在基片表面。
（4）基片上未反应的位点用2%的牛血清白蛋白（BSA）封闭30min，之后用PBS（pH为7.4）充分冲洗。组装有抗体A的基片浸泡在待测抗原（小鼠IgG，0.1ng/mL）溶液中，37℃条件下反应45min，抗原与抗体A发生免疫识别反应，组装到基片表面。最后将组装靶抗原的Auwafer基片，浸于标记有辣根过氧化物酶（HRP）的抗体B（HRP-兔抗小鼠IgG，2μg/mL）溶液中，37℃条件下反应45min，得到“抗体A-靶抗原-抗体B（HRP标记）”的Au wafer基片。
3. 引发TSA反应，用于SERS免疫检测
取10μL H2O2（20mmol/L）加入到90μL的AuNP@MBA-tyramine中。取以上含有H2O2的AuNPs5μL，滴加在组装有“抗体A-靶抗原-抗体B（HRP标记）”的Au wafer基片上反应30min。H2O2可以促进HRP氧化酪胺形成活性自由基，进而将大量的标记有MBA的金纳米粒子组装到Auwafer基片表面，产生强烈的SERS信号。最后用超纯水冲洗制得的传感基片，氮气吹干后进行SERS检测。
对实施例1中获得的TSA-SERS传感器进行测试，并与传统免疫SERS传感器进行效果比较。
首先采用扫描电子显微镜（SEM, JEOL 7800F）对传统免疫SERS传感器和TSA-SERS传感器的基片表面相貌进行表征，分别得到图3(a)和图3(b)，两种方法中抗原的浓度均为0.1ng/mL。由图3(a)可以看出，金纳米粒子通过免疫识别过程，分散的组装在基片表面。当经过TSA反应之后，更多的金纳米粒子组装到基片上，并且具有一定程度的聚集（图3(b)），构成高密度的“热点”结构，有利于SERS信号的放大。
SERS光谱采用Jobin Yvon/HORIBA LabRam ARAMIS拉曼光谱仪进行检测，激光波长选用633nm。拉曼散射光通过50×显微物镜进行收集，光谱采集范围为500-2000cm-1，积分时间5s，累积1次。传统免疫SERS传感器中，基片上固定和实施例1相同的抗体A及其待测抗原，然后将抗体B以及SERS活性分子MBA修饰在胶体金上形成MBA标记的免疫金。免疫识别之后，检测探针分子的SERS信号（曲线1）。TSA-SERS传感器中，在发生免疫识别之后，进一步引发TSA反应，然后检测MBA的SERS信号（曲线2）。
两种方式下获取的SERS谱图如图4所示。可以看出，在待测抗原浓度相同的情况下（0.1ng/mL），TSA-SERS传感器获得的SERS信号（曲线2）强度明显高于传统免疫传感器的SERS信号（曲线1）强度，说明该方法可以提高体系的检测灵敏度。
调整实施例1中抗原的浓度，其他条件不变，对不同浓度目标蛋白进行检测。
以不同浓度的目标抗原进行免疫反应，检测相应情况下的TSA-SERS光谱。从图5可以看出，在0.01ng/mL-100ng/mL范围内，探针分子（MBA）的SERS信号强度随着目标抗原的浓度增大而增大。因为抗原的浓度越大，连接有HRP的抗体B组装的越多，因此可以催化更多的tyramine转换成活性自由基，伴随连接有SERS标签的金纳米粒子组装的越多。图6绘制了MBA的SERS光谱在1583cm-1处的峰强度随着目标蛋白（小鼠IgG）的浓度变化的关系图。可以看出，利用TSA-SERS方法对目标抗原的最低检测浓度达到了0.01ng/mL。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子连接在酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有金纳米粒子的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、拉曼染料MBA标记的金纳米粒子上连接酪胺分子：
在MBA标记的金纳米粒子溶胶AuNP@MBA中，加入NHS、EDC以及tyramine，搅拌反应得到AuNP@MBA-tyramine溶胶，其中tyramine与MBA的摩尔比为1:1.5~3.5；
S2、在基片上构筑从下到上依次叠加的抗体A-靶抗原-抗体B的三层结构：
a、将表面有Au wafer的硅基片经巯基丙酸溶液浸泡后，用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干，得到表面羧基化的Au wafer基片；
b、将表面羧基化的Au wafer基片浸入EDC和NHS的混合溶液中活化30~60min，随后将表面活化的Au wafer基片浸入到抗体A溶液中反应3~5h，然后用PBS缓冲液冲洗，将冲洗后的基片用2%的牛血清白蛋白封闭后，再用PBS缓冲液冲洗；
c、将步骤b封闭后组装有抗体A的基片浸入待测抗原溶液中反应30~45min，得到组装有靶抗原的Au wafer基片，然后将组装有靶抗原的Au wafer基片浸入标记有辣根过氧化物酶的抗体B溶液中反应30~45min，得到抗体A-靶抗原-抗体B的Au wafer基片；
S3：引发TSA反应，用于SERS免疫检测：
在步骤S1制备的AuNP@MBA-tyramine溶胶中加入H2O2，混匀后滴加至步骤c得到的抗体A-靶抗原-抗体B的Au wafer基片上进行反应，随后用超纯水冲洗，并经氮气吹干后，进行SERS检测。
3.根据权利要求2所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1中搅拌反应完成后，将得到的溶胶进行离心，并用二次蒸馏水重悬浮。
4.根据权利要求2所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1中搅拌反应1~3h。
5.根据权利要求2所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤b的EDC和NHS的混合溶液中，EDC和NHS的浓度分别为1~10 mg/mL、2~20mg/L。
6.根据权利要求2所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤b中抗体A的浓度为1~10μg/mL，步骤c中抗体B的浓度为1~3μg/mL。
7.根据权利要求2所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤b中基片与抗体A的反应温度为2~6℃。
8.根据权利要求2所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤c中基片与待测抗原反应以及与抗体B反应的温度为15~40℃。
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