CN110031527A - 一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器 - Google Patents
一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110031527A CN110031527A CN201910362515.9A CN201910362515A CN110031527A CN 110031527 A CN110031527 A CN 110031527A CN 201910362515 A CN201910362515 A CN 201910362515A CN 110031527 A CN110031527 A CN 110031527A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- concentration
- distilled water
- electrode
- human thyroglobulin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/308—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells at least partially made of carbon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器。该传感器利用具有优异导电性能的金纳米粒子(Au)和离子液体(IL‑COOH)作为基底,利用酰胺反应将人甲状腺球蛋白抗体(Ab)引入传感界面,利用标记的人甲状腺球蛋白抗原和待测抗原之间的竞争作用发生免疫竞争反应。随后利用金刚烷ADA和环糊精之间的特异性识别作用,使环糊精功能化的TiO2‑MOF(TiO2‑MOF@β‑CD)和In2Se3@ADA在传感界面上形成复合层,该复合层既具有优异的光电流响应又具有良好的光热响应,得到光电流密度和温度两种检测信号,实现一种双读出模式。基于此,构制了一种双信号响应的生物传感器,实现了对人甲状腺球蛋白的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于新型纳米材料制备与应用和生物免疫传感构建与应用检测领域,具体设计了一种人甲状腺球白的双读出生物传感器,实现了对人甲状腺球蛋白(TG)的高灵敏检测。
背景技术
人甲状腺球蛋白(thyroglobulin, TG),是甲状腺滤泡上皮细胞分泌的一种大分子蛋白。参与生物体的多种生理过程,研究表明其表达浓度的上升可增加甲状腺癌癌细胞的转移风险,该指标在分化型甲状腺癌愈后判断和疗后监测都有重要的意义。因此发展一种高灵敏度,可行性好的检测方法对血清中的TG含量监测具有迫切的现实意义。目前用于检测TG的方法有:微流控生物传感法,ELISA法,富集串联色谱法等,但昂贵的仪器设备和繁杂的操作过程都极大限制其实际应用和发展。因此,发展一种准确度高,简单快速的检测方法对人甲状腺球蛋白的临床检测和术后监测都具有重要的意义。
免疫竞争反应,一种常用的免疫分析方法,本实验中用信号分子标记的抗原与游离的待测抗原竞争结合固定在电极界面上的固相抗体。若待测样本中无待测抗原,则标记的抗原尽可能多地被结合在电极表面,得到的检测信号最强;若存在待测抗原,则检测信号随着待测抗原浓度的增加而减少,即待测抗原的浓度与检测信号成反比。该免疫方法结合电化学,荧光、电化学发光、光电学等方法,成为一种可靠的免疫分析方法,已成功应用于对真菌毒素,肿瘤标志物等的高灵敏检测。
光电化学(PEC)传感器是近年来新出现并迅速发展的一种分析方法,是基于光敏材料的光电转换性能来确定待测物质含量的一类传感器。由于检测信号和激发信号的完全分离,使得光电传感器的背景信号值大大减小,因此相比于传统的电化学传感器,光电传感器的灵敏度更高,检测限更低。除此之外,光电传感器还具有操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点,近年来在医疗检测,环境监测和食品安全等领域,PEC传感器都展现出独一无二的分析优势和广阔的应用前景。光热传感器是一种新兴的可用于生物分子灵敏检测的分析方法,是基于光热材料(比如普鲁士蓝,碳材料和金纳米材料等)的光热转换特性来确定待测物质含量的传感器。在红外光或者近红外光的照射下,光热材料会将光信号转换成温度信号,待测物量的改变引起温度信号的变化,据此可以实现对待测物的定量检测。检测信号的易读出和红外光的能量小对生物分子损伤小是光热传感器的两大优势。因此本实验结合了光电和光热传感器的特性,制备了一种具有双读出信号的生物传感器,实现了人甲状腺球蛋白的高灵敏检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种人甲状腺球白的双读出生物传感器。
为实现发明目的,本发明采用如下技术方案:
1. 一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器的制备方法与应用,其特征在于,包括以下步骤:
(1) 在湿润的麂皮上依次用50nm和30nm的氧化铝粉末对玻碳电极(GCE)进行机械打磨抛光,直至其表面光亮洁净,用二次蒸馏水冲洗电极表面残余的氧化铝粉末,最后用无水乙醇和二次蒸馏水进行彻底清洗;
(2) 滴加5μL浓度为3mg/mL的金纳米(Au)溶液至抛光干净的GCE表面,至红外灯箱内烘干后取出,室温下冷却,制得Au/GCE;
(3)滴加3μL浓度为5mg/mL的离子液体溶液(IL-COOH)于步骤(2)所制得的电极表面,放至红外灯箱内烘干,冷却至室温,制得IL-COOH /Au/GCE;
(4)滴加5μL体积比为4:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液于步骤(3)所制得的电极表面,4°C冰箱中反应20min,以此活化IL-COOH上的羧基,随后用二次蒸馏水清洗,晾干备用;
(5) 滴加3μL浓度为1μg/mL的人甲状腺球蛋白的抗体(Ab)溶液至步骤(4)所获得的电极表面,于4°C冰箱中孵育40 min,反应完成后用二次蒸馏水洗去多余的Ab分子,晾干,得Ab/IL-COOH/Au/GCE,于4°C冰箱中保存,备用;
(6) 滴加3 μL 浓度为 1.0 wt.% 的BSA 溶液到步骤 ( 5) 所制得的修饰电极表面,并在4°C冰箱中孵育20 min, 用于封闭电极表面上非特异性活性位点,随后用二次去蒸馏水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(7)滴加6μL体积比为1:1不同浓度的人甲状腺球蛋白(TG)和金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白(TG@In2Se3@ADA)的混合溶液于步骤(6)所制得的电极表面,于4°C冰箱中孵育50 min,随后用蒸馏水冲洗,晾干,制得TG@In2Se3@ADA+ TG /Ab/IL-COOH/Au/GCE;
(8)于步骤(7)所制得的电极表面依次滴加3μL的β-环糊精功能化的TiO2-MOF(TiO2-MOF@β-CD)和3μL 的金刚烷功能化的In2Se3(In2Se3@ ADA),利用金刚烷和β-环糊精之间特异性的识别作用在电极界面上形成复合层,每一步识别过程完成后用二次蒸馏水冲洗,晾干,制得composite layer/ TG @In2Se3@ADA+TG/Ab/IL-COOH/Au/GCE。
1. 上述的In2Se3由下述的方法制备:(1)2mmol的抗坏血酸溶解在30 mL无水乙醇中,60°C加热条件下磁性搅拌5min,使其充分溶解;随后将0.4mmol四氯化铟和0.1mmol硒粉依次加入到上述溶液中,持续磁力搅拌30min;将上述溶液转移至50 mL的聚四氟乙烯内衬高压釜中,密封保存在220°C条件下反应20h;待高压釜冷却制室温后,釜内底部的固相为目标产物,用二次蒸馏水和无水乙醇离心洗涤数次后将所得产物在60°C真空干燥箱加热5h,得到最终产物;称取制得的In2Se31mg,将其均匀分散在1 mL二次蒸馏水中,储存备用。
2. β-环糊精功能化的TiO2-MOF(TiO2-MOF@β-CD)由下述的方法制备的:1)将4.5g的对苯二甲酸,9mL的无水乙醇,81mL的N’N-二甲基甲酰胺和2.34mL的钛酸四丁酯溶液混合,然后将上述溶液转移至100mL的聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,150°C条件下加热48h;冷却至室温后用甲醇过滤洗涤数次,得到白色悬浮液;随后将获得的白色悬浮液在400°C下煅烧5h,升温速率为5°C/min;冷却至室温后,所得到的白色粉末为最终产物,最后将其分散在二次蒸馏水当中,得到浓度为5 mg/mL的TiO2-MOF溶液;2)0.5 mL浓度为5 mg/mL的TiO2-MOF溶液和0.5 mL浓度为4.5 mg/mL的β-环糊精β-CD溶液,室温下混合振荡8h后离心洗涤数次后得到TiO2-MOF@β-CD溶液,重新将其分散在1mL的二次蒸馏水当中;
3. 金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白(TG@In2Se3@ADA)由下述方法制备:1) 0.5 mL浓度为1 mg/mL的步骤(1)制得的In2Se3溶液和0.5 mL浓度为4.5 mg/mL的金刚烷溶液在室温下混合振荡8h,离心洗涤数次后得到In2Se3@ADA溶液,将其重新分散在二次蒸馏水中;2)取体积比为4:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液50µL加入到200 µL的上述功能化的溶液中,于4°C条件下反应2h,金刚烷上的羧基被活化;3)将200µL的人甲状腺球蛋白(TG)标准溶液加入到步骤(1)中所得溶液中,利用酰胺键的作用,4°C条件下反应2h后得到金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白 (TG@In2Se3@ADA),离心洗涤数次后重新分散在pH等于7.4的磷酸缓冲溶液中,放至4°C的冰箱冷藏备用;
4. 一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器的检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以上述的一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器的修饰电极为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,选用的电化学方法是时间电流法,在0.1 mol/mL pH 7.4的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)在电流时间方法中,初始电位0.5V,采样间隔为0.1s,运行时间为400 s,静止时间为1s,电流灵敏度为1μA,初始频率为100000Hz,终止频率为0.1 Hz,对不同浓度的人甲状腺球蛋白( TG) 标准溶液进行检测,通过电化学工作站来采集电流信息数据;通过光电流值与人甲状腺球蛋白( TG) 标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线1;用808nm的激光照射发生免疫识别后的工作电极,同时用红外测温仪实时记录温度变化,根据电极表面的温度与人甲状腺球蛋白( TG)标准溶液浓度之间建立标准工作曲线2;
(3)待测样品溶液代替人甲状腺球蛋白( TG)标准溶液进行检测,检测的结果可由绘制出的标准工作曲线1和标准工作曲线2查得。
本发明的显著优点为:
(1)竞争型的免疫分析方法是具有特异性高,响应时间短,操作简便等优点,本实验中采用竞争型的免疫方法来实现对血清中TG含量的高灵敏检测。同一标准浓度的TG溶液可得到两种检测信号,且两种检测信号互不干扰,对检测结果的准确性提供了有力保障。
(2)本实验合成的In2Se3纳米材料是一种新型的纳米材料。不但具有优异的光电性能,产生稳定高光电流,而且具有良好的光热性能,是一种可实现双读出信号的纳米材料。
(3)本实验利用β环糊精和金刚烷之间的特异性的识别作用,使得金刚烷功能化的In2Se3纳米材料和β环糊精功能化的TiO2-MOF在电极界面上形成复合层,该复合层的形成有利于对检测信号的进一步放大,为拓宽该检测器的检测范围提供基础。
(4)本实验合成的TiO2-MOF和In2Se3都是良好的光电材料,在紫外光的激发下,产生的光电流稳定性好,保证了该生物传感器较高的稳定性和较好的重现性。
附图说明
图1为合成的In2Se3的扫描电镜图(A)和元素分析(B)、(C)对照图;
图2为合成的TiO2-MOF的扫描电镜图(A)和透射电镜图(B)对照图;
图3 为该传感器的光电流值与人甲状腺球蛋白(TG)标准溶液浓度之间的关系图;
图4 为该传感器的电极表面的温度变化与人甲状腺球蛋白(TG)标准溶液浓度之间的标准工作曲线图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明,但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
1.一种基于免疫竞争反应的双读出信号生物传感器制备方法与应用,其特征在于,包括以下步骤:
(1) 在湿润的麂皮上依次用50nm和30nm的氧化铝粉末对玻碳电极(GCE)进行机械打磨抛光,直至其表面光亮洁净,用二次蒸馏水冲洗电极表面残余的氧化铝粉末,最后用无水乙醇和二次蒸馏水清洗数次;
(2)滴加5μL浓度为3mg/mL的金纳米(Au)溶液至抛光干净的GCE表面,至红外灯箱内烘干后取出,室温下冷却,制得Au/GCE;
(3)滴加3μL浓度为5mg/mL的离子液体溶液(IL-COOH)于步骤(2)所制得的电极表面,放至红外灯箱内烘干,冷却至室温,制得IL-COOH /Au/GCE;
(4)滴加5μL体积比为4:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液于步骤(3)所制得的电极表面,4°C冰箱中反应20min,以此活化IL-COOH上的羧基,随后用二次蒸馏水清洗,晾干备用;
(5)滴加3μL浓度为1μg/mL的人甲状腺球蛋白的抗体(Ab)溶液至步骤(4)所获得的电极表面,于4°C冰箱中孵育40 min,反应完成后用二次蒸馏水洗去多余的Ab分子,晾干,得Ab/IL-COOH/Au/GCE,于4°C冰箱中保存,备用;
(6)滴加3 μL 浓度为 1.0 wt.% 的BSA 溶液到步骤 ( 5) 所制得的修饰电极表面,并在4°C冰箱中孵育20 min, 用于封闭电极表面上非特异性活性位点,随后用二次蒸馏水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(7)滴加6μL体积比为1:1不同浓度的人甲状腺球蛋白(TG)和金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白(TG@In2Se3@ADA)的混合溶液于步骤(6)所制得的电极表面,于4°C冰箱中孵育50 min,随后用蒸馏水冲洗,晾干,制得TG@In2Se3@ADA+ TG /Ab/IL-COOH/Au/GCE;
(8) 于步骤(7)所制得的电极表面依次滴加3μL的β-环糊精功能化的TiO2-MOF(TiO2-MOF@β-CD)和3μL 的金刚烷功能化的In2Se3(In2Se3@ ADA),利用金刚烷和β-环糊精之间特异性的识别作用在电极界面上形成复合层,每一步识别过程完成后用二次蒸馏水冲洗,晾干,制得composite layer/ TG @In2Se3@ADA+TG/Ab/IL-COOH/Au/GCE;
上述金锥纳米材料的制备:在旋涂聚苯乙烯珠之前,首先将teflon膜切割成正方形(1.5x1.5cm)并用乙醇和二次蒸馏水冲洗,然后用等离子水清洗3分钟。吸取1mL浓度为2.5w/v %的聚苯乙烯珠丙酮溶液并将其离心,再转移到乙醇和甲醇的体积比为2:1的混合溶液中。在溶液中加入体积分数为0.2 %的表面活性剂(TX100),接着将聚苯乙烯珠的浓度调节至约5 w/v %。 然后将聚苯乙烯珠旋涂在清洁的teflon膜上,并在室温下放置几分钟,使溶剂干燥。用O2等离子体蚀刻聚苯乙烯珠/ teflon表面一定时间。 最后通过热蒸发在该表面涂上50nm的金,得到金纳米材料。
上述金纳米(Au)溶液的制备:取适量上述实验制得的金纳米材料溶解在去离子水中,得到3mg/mL的金纳米(Au)溶液。
上述的人甲状腺球蛋白抗体(Ab), 人甲状腺球蛋白(TG)均购自默沙克生物公司。
实施例2
上述实施例1所用的β-环糊精功能化的TiO2-MOF(TiO2-MOF@β-CD)由下述的方法制备的:1)将4.5g的对苯二甲酸,9mL的无水乙醇,81mL的N’N-二甲基甲酰胺和2.34mL的钛酸四丁酯溶液混合,然后将上述溶液转移至100mL的聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,150°C条件下加热48h;冷却至室温后用甲醇过滤洗涤数次,得到白色悬浮液;随后将获得的白色悬浮液在400°C下煅烧5h,升温速率为5°C/min;冷却至室温后,所得到的白色粉末为最终产物,最后将其分散在二次蒸馏水当中,得到浓度为5 mg/mL的TiO2-MOF溶液;2)0.5 mL浓度为5 mg/mL的TiO2-MOF溶液和0.5 mL浓度为4.5 mg/mL的β-环糊精β-CD溶液,室温下混合振荡8h后离心洗涤数次后得到TiO2-MOF@β-CD溶液,重新将其分散在1mL的二次蒸馏水当中。
实施例3
上述实施例1所用的In2Se3由下述的方法制备:(1)2mmol的抗坏血酸溶解在30 mL无水乙醇中,60°C加热条件下磁性搅拌5min,使其充分溶解;随后将0.4mmol四氯化铟和0.1mmol硒粉依次加入到上述溶液中,持续磁力搅拌30min;将上述溶液转移至50 mL的聚四氟乙烯内衬高压釜中,密封保存在220°C条件下反应20h;待高压釜冷却制室温后,釜内底部的固相为目标产物,用二次蒸馏水和无水乙醇离心洗涤数次后将所得产物在60°C真空干燥箱加热5h,得到最终产物;称取制得的In2Se31mg,将其均匀分散在1 mL二次蒸馏水中,储存备用。
实施例4
上述实施例1所用的金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白(TG@In2Se3@ADA)由下述方法制备:1) 0.5 mL浓度为1 mg/mL的步骤(1)制得的In2Se3溶液和0.5 mL浓度为4.5mg/mL的金刚烷溶液在室温下混合振荡8h,离心洗涤数次后得到In2Se3@ADA溶液,将其重新分散在二次蒸馏水中;2)取体积比为4:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液50µL加入到200 µL的上述功能化的溶液中,于4°C条件下反应2h,金刚烷上的羧基被活化;3)将200µL的人甲状腺球蛋白(TG)标准溶液加入到步骤(1)中所得溶液中,利用酰胺键的作用,4°C条件下反应2h后得到金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白 (TG@In2Se3@ADA),离心洗涤数次后重新分散在pH等于7.4的磷酸缓冲溶液中,放至4°C的冰箱冷藏备用。
实施例5
人甲状腺球蛋白 (TG )的检测步骤:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以实施例1制得的一种基于免疫竞争反应的双读出信号的修饰电极(composite layer/ TG @In2Se3@ADA+TG/Ab/IL-COOH/Au/GCE)为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,选用的电化学方法是时间电流法,在0.1 mol/mL pH 7.4的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)在电流时间方法中,初始电位0.5V,采样间隔为0.1s,运行时间为400 s,静止时间为1s,电流灵敏度为1μA,初始频率为100000Hz,终止频率为0.1 Hz,对不同浓度的人甲状腺球蛋白( TG) 标准溶液进行检测,通过电化学工作站来采集电流信息数据;通过光电流值与人甲状腺球蛋白( TG) 标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线1;用808nm的激光照射发生免疫识别后的工作电极(composite layer/ TG @In2Se3@ADA+TG/Ab/IL-COOH/Au/GCE),同时用红外测温仪实时记录温度变化,根据电极表面的温度与人甲状腺球蛋白( TG)标准溶液浓度之间建立标准工作曲线2;
待测样品溶液代替人甲状腺球蛋白( TG)标准溶液进行检测,检测的结果可由绘制出的标准工作曲线1和标准工作曲线2查得。
Claims (4)
1.一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1) 在湿润的麂皮上依次用50nm和30nm的氧化铝粉末对玻碳电极(GCE)进行机械打磨抛光,直至其表面光亮洁净,用二次蒸馏水冲洗电极表面残余的氧化铝粉末,最后用无水乙醇和二次蒸馏水进行彻底清洗;
(2) 滴加5μL浓度为3mg/mL的金纳米(Au)溶液至抛光干净的GCE表面,至红外灯箱内烘干后取出,室温下冷却,制得Au/GCE;
(3) 滴加3μL浓度为5mg/mL的离子液体溶液(IL-COOH)于步骤(2)所制得的电极表面,放至红外灯箱内烘干,冷却至室温,制得IL-COOH /Au/GCE;
(4)滴加5μL体积比为4:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液于步骤(3)所制得的电极表面,4°C冰箱中反应20min,以此活化IL-COOH上的羧基,随后用二次蒸馏水清洗,晾干备用;
(5)滴加3μL浓度为1μg/mL的人甲状腺球蛋白的抗体(Ab)溶液至步骤(4)所获得的电极表面,于4°C冰箱中孵育40 min,反应完成后用二次蒸馏水洗去多余的Ab分子,晾干,得Ab/IL-COOH/Au/GCE,于4°C冰箱中保存,备用;
(6) 滴加3 μL 浓度为 1.0 wt.% 的BSA 溶液到步骤 ( 5) 所制得的修饰电极表面,并在4°C冰箱中孵育20 min, 用于封闭电极表面上非特异性活性位点,随后用二次蒸馏水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(7)滴加6μL体积比为1:1不同浓度的人甲状腺球蛋白(TG)和金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白 (TG@In2Se3@ADA)的混合溶液于步骤(6)所制得的电极表面,于4°C冰箱中孵育50 min,随后用二次蒸馏水冲洗,晾干,制得TG@In2Se3@ADA+ TG /Ab/IL-COOH/Au/GCE;
(8)于步骤(7)所制得的电极表面依次滴加3μL的β-环糊精功能化的TiO2-MOF(TiO2-MOF@β-CD)和3μL 的金刚烷功能化的In2Se3(In2Se3@ ADA),利用金刚烷和β-环糊精之间特异性的识别作用在电极界面上形成复合层,每一步识别过程完成后用二次蒸馏水冲洗,晾干,制得composite layer/ TG @In2Se3@ADA+TG/Ab/IL-COOH/Au/GCE。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,In2Se3由下述的方法制备的:(1) 2mmol的抗坏血酸溶解在30 mL无水乙醇中,60°C加热条件下磁性搅拌5min,使其充分溶解;随后将0.4mmol四氯化铟和0.1mmol硒粉依次加入到上述溶液中,持续磁力搅拌30min;将上述溶液转移至50 mL的聚四氟乙烯内衬高压釜中,密封保存在220°C条件下反应20h;待高压釜冷却制室温后,釜内底部的固相为目标产物,用二次蒸馏水和无水乙醇离心洗涤数次后将所得产物在60°C真空干燥箱加热5h,得到最终产物;称取制得的In2Se31mg,将其均匀分散在1 mL二次蒸馏水中,储存备用;
(2)β-环糊精功能化的TiO2-MOF(TiO2-MOF@β-CD)由下述的方法制备的:1)将4.5g的对苯二甲酸,9mL的无水乙醇,81mL的N’N-二甲基甲酰胺和2.34mL的钛酸四丁酯溶液混合,然后将上述溶液转移至100mL的聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,150°C条件下加热48h;冷却至室温后用甲醇过滤洗涤数次,得到白色悬浮液;随后将获得的白色悬浮液在400°C下煅烧5h,升温速率为5°C/min;冷却至室温后,所得到的白色粉末为最终产物,最后将其分散在二次蒸馏水当中,得到浓度为5 mg/mL的TiO2-MOF溶液;2)0.5 mL浓度为5 mg/mL的TiO2-MOF溶液和0.5 mL浓度为4.5 mg/mL的β-环糊精β-CD溶液,室温下混合振荡8h后离心洗涤数次后得到TiO2-MOF@β-CD溶液,重新将其分散在1mL的二次蒸馏水当中;
(3)金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白(TG@In2Se3@ADA)由下述方法制备:1)0.5 mL浓度为1 mg/mL的步骤(1)制得的In2Se3溶液和0.5 mL浓度为4.5 mg/mL的金刚烷溶液在室温下混合振荡8h,离心洗涤数次后得到金刚烷功能化的In2Se3(In2Se3@ADA)溶液,将其重新分散在二次蒸馏水中;2)取体积比为4:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液50µL加入到200 µL的上述金刚烷功能化的In2Se3(In2Se3@ADA)溶液中,于4°C条件下反应2h,金刚烷上的羧基被活化;3)将200µL的人甲状腺球蛋白(TG)标准溶液加入到步骤(2)中所得溶液中,利用酰胺键的作用,4°C条件下反应2h后得到金刚烷功能化的In2Se3标记的人甲状腺球蛋白 (TG@In2Se3@ADA),离心洗涤数次后重新分散在pH等于7.4的磷酸缓冲溶液中,放至4°C的冰箱冷藏备用。
3.权利要求1-2任一所述的方法制备的一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器。
4.权利要求3所述的人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器,其特征在于,用于人甲状腺球蛋白(TG)检测,检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以权利要求3所述的一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器的修饰电极为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,选用的电化学方法是时间电流法,在0.1 mol/mL pH 7.4的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)在电流时间方法中,初始电位0.5V,采样间隔为0.1s,运行时间为400 s,静止时间为1s,电流灵敏度为1μA,初始频率为100000Hz,终止频率为0.1 Hz,对不同浓度的人甲状腺球蛋白( TG) 标准溶液进行检测,通过电化学工作站来采集电流信息数据;通过光电流值与人甲状腺球蛋白( TG) 标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线1;用808nm的激光照射发生免疫识别后的工作电极,同时用红外测温仪实时记录温度变化,根据电极表面的温度与人甲状腺球蛋白( TG)标准溶液浓度之间建立标准工作曲线2;
(3)待测样品溶液代替人甲状腺球蛋白( TG)标准溶液进行检测,检测的结果可由绘制出的标准工作曲线1和标准工作曲线查2得。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910362515.9A CN110031527B (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910362515.9A CN110031527B (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110031527A true CN110031527A (zh) | 2019-07-19 |
CN110031527B CN110031527B (zh) | 2021-07-02 |
Family
ID=67240938
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910362515.9A Expired - Fee Related CN110031527B (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110031527B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110531087A (zh) * | 2019-09-05 | 2019-12-03 | 福建师范大学 | 基于MXenes-ZnO QDs的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光传感器 |
CN111999276A (zh) * | 2020-08-26 | 2020-11-27 | 北京大学 | 一种制备发光铕基金属有机框架探针的方法及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2750738B2 (ja) * | 1989-06-13 | 1998-05-13 | 第一化学薬品株式会社 | 分子量マーカー |
US20140191186A1 (en) * | 2013-01-04 | 2014-07-10 | Yale University | Regenerative Nanosensor Devices |
CN104897757A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-09-09 | 济南大学 | 一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器的制备及应用 |
CN107727714A (zh) * | 2017-09-10 | 2018-02-23 | 福建师范大学 | 一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器的制备方法 |
CN108546994A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-18 | 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 | 一种二维三硒化二铟原子晶体及其制备方法和用途 |
-
2019
- 2019-04-30 CN CN201910362515.9A patent/CN110031527B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2750738B2 (ja) * | 1989-06-13 | 1998-05-13 | 第一化学薬品株式会社 | 分子量マーカー |
US20140191186A1 (en) * | 2013-01-04 | 2014-07-10 | Yale University | Regenerative Nanosensor Devices |
CN104897757A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-09-09 | 济南大学 | 一种PdNi合金/氮掺杂石墨烯纳米带双重放大的免疫传感器的制备及应用 |
CN107727714A (zh) * | 2017-09-10 | 2018-02-23 | 福建师范大学 | 一种基于碳纳米角及TiO2介晶纳米材料的比率型电化学发光免疫传感器的制备方法 |
CN108546994A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-18 | 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 | 一种二维三硒化二铟原子晶体及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LISONG WANG等: "Host−Guest Interaction of Adamantine with a β‑Cyclodextrin-Functionalized AuPd Bimetallic Nanoprobe for Ultrasensitive Electrochemical Immunoassay of Small Molecules", 《ANAL. CHEM.》 * |
YAN JIANG等: "Construction of In2Se3/MoS2 heterojunction as photoanode toward efficient photoelectrochemical water splitting", 《CHEMICAL ENGINEERING JOURNAL》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110531087A (zh) * | 2019-09-05 | 2019-12-03 | 福建师范大学 | 基于MXenes-ZnO QDs的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光传感器 |
CN110531087B (zh) * | 2019-09-05 | 2022-08-30 | 福建师范大学 | 基于MXenes-ZnO QDs的热致增敏型甲状腺球蛋白电致化学发光传感器 |
CN111999276A (zh) * | 2020-08-26 | 2020-11-27 | 北京大学 | 一种制备发光铕基金属有机框架探针的方法及其应用 |
CN111999276B (zh) * | 2020-08-26 | 2021-06-08 | 北京大学 | 一种制备发光铕基金属有机框架探针的方法及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110031527B (zh) | 2021-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108318477B (zh) | 基于TiO2金属有机框架制备的电致化学发光探针及其对呕吐毒素的竞争型免疫传感方法 | |
CN107831198B (zh) | 一种基于多级微米立方锡酸锌复合材料的光电化学心肌钙蛋白i传感器的制备方法及应用 | |
CN108080042A (zh) | 结合时间分辨荧光技术的微流控芯片及其制备方法和应用 | |
CN105319254B (zh) | 一种基于Pt/PdCu‑三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用 | |
CN106066324B (zh) | 一种电致化学发光生物传感器标记物的制备方法 | |
Liu et al. | Magnetic graphene nanosheets based electrochemiluminescence immunoassay of cancer biomarker using CdTe quantum dots coated silica nanospheres as labels | |
CN104391117B (zh) | 一种基于PPy-NH2GO-Ag2Se@CdSe的胃癌抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用 | |
Ai et al. | An “on-off” electrochemiluminescence immunosensor for PIVKA-II detection based on the dual quenching of CeO2–Au-g-C3N4 hybrids by Ag nanocubes-VB2 | |
CN106018806B (zh) | 一种基于Au‑Fe3O4@Pd‑ZIF‑8标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用 | |
CN104880456A (zh) | 一种基于GO/MWCNTs-COOH/Au@CeO2构建的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用 | |
Wang et al. | Chemiluminescence excited photoelectrochemical competitive immunosensing lab-on-paper device using an integrated paper supercapacitor for signal amplication | |
CN104459124A (zh) | 一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用 | |
CN106404756B (zh) | 一种基于graphene/Fe3O4@Au/CeO2/TiO2的电致化学发光传感器的制备方法及应用 | |
CN108469524A (zh) | 一种检测ca125的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用 | |
CN105115961A (zh) | 一种纳米复合材料的电化学发光传感器的制备方法 | |
CN110031527A (zh) | 一种人甲状腺球蛋白的双读出生物传感器 | |
CN104931698A (zh) | 一种基于NP-NiGd@Au的胃癌标志物金纳米簇电致化学发光传感器的制备方法及应用 | |
CN108802391A (zh) | 一种基于TiO2介晶诱导的共振能量转移型电化学发光及对卵巢癌标记物的免疫传感方法 | |
Bian et al. | Ultrabright nanoparticle-labeled lateral flow immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibodies in human serum | |
Zhong et al. | Dual-wavelength responsive photoelectrochemical aptasensor based on ionic liquid functionalized Zn-MOFs and noble metal nanoparticles for the simultaneous detection of multiple tumor markers | |
CN110441528A (zh) | 一种基于核壳结构Mo2C@C纳米球的心肌钙蛋白I免疫传感器的构建 | |
CN102565020A (zh) | 一种利用量子点共振散射定量检测蛋白质的方法 | |
CN106370858A (zh) | 一种基于电位寻址模式的双肿瘤标志物的光电检测方法 | |
CN107271519B (zh) | 一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法及应用 | |
Zheng et al. | A Label-Free Immunosensor for CEA based on Pd–Ir bimetallic nanoparticles |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210702 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |